Abstract
Bakgrunn
Sirkulasjons celle-fritt DNA (cfDNA) i plasma har vist potensial som biomarkør i ulike kreftformer og kan bli en viktig kilde for svulst mutasjonsdeteksjon. Målene for vår studie var å etablere et normalt nivå av cfDNA i en kohort av friske individer, og å sammenligne dette med fire kohorter av metastatisk kolorektalcancer (mCRC) pasienter. Vi har også undersøkt den prognostiske verdien av cfDNA og analysert svulsten spesifikke
KRAS
mutasjoner i plasma.
Metoder
Studien var en prospektiv biomarkør evaluering i fire påfølgende fase II-studier, inkludert 229 pasienter med kjemoterapi ildfast mCRC og 100 friske personer. Plasma ble hentet fra en EDTA blodprøven, og det totale antallet DNA-alleler og
KRAS
muterte alleler ble vurdert ved hjelp av en in-house ARMS-qPCR som tidligere beskrevet.
Resultater
Median cfDNA nivåene var høyere i mCRC sammenlignet med kontroller (p 0,0001). ROC analyse viste en AUC på 0,9486 (p 0,00001). Dataene viste nedsatt OS med økende nivåer av referanse cfDNA både når kategorisere pasienter med kvartiler av cfDNA og til lave eller høye cfDNA grupper basert på det øvre normale område for kontrollgruppen (Median OS 10.2 (08.03 til 11.07) og 5,2 (4/6 til 5/9 ) måneder, henholdsvis HR 1,78, p = 0,0006). Multivariat analyse bekreftet en uavhengig prognostisk verdi av cfDNA (HR 1,5 (95% KI 1,3-1,7) for hver økning i cfDNA kvartil). Den samlede konkordans av
KRAS
mutasjoner i plasma og vev var høy (85%).
Konklusjoner
Disse dataene bekrefter den prognostiske verdien av cfDNA måling i plasma og nytte for mutasjonsdeteksjon med metoden presenteres
Citation. Spindler KLG, Pallisgaard N, Andersen RF, Brandslund jeg, Jakobsen A (2015) Sirkulasjons Gratis DNA som Biomarker og kilde for mutasjonsdeteksjons i metastatisk kolorektalcancer. PLoS ONE 10 (4): e0108247. doi: 10,1371 /journal.pone.0108247
Academic Redaktør: Libing Song, Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center, KINA
mottatt: 20 juli 2013; Godkjent: 27 august 2014; Publisert: 13 april 2015
Copyright: © 2015 Spindler et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Denne studien ble finansiert av Forskningsrådet Vejle sykehus og Tryg fonden. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, desicion å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastatisk kolorektalcancer (mCRC) har en dårlig prognose og til tross for nylige forbedringer motstand mot terapi er fortsatt en stor utfordring. Jakten på bedre utvalgskriteriene for terapi sammen med nye potensielt effektive behandlingsregimer for kjemoterapi-resistent sykdom har trukket mye oppmerksomhet det siste tiåret. Disse inkluderer utvikling av nye agenter, identifikasjon av genetiske endringer som er ansvarlige for motstand og søke etter biomarkører for veiledning under behandling.
Tilstedeværelsen av sirkulerende cellefritt DNA (cfDNA) i blodet ble rapportert mer enn 60 år siden [1]. Det er aktivt frigjøres fra normale og døde celler, apoptosing og nekrotiserende prosesser, så vel som fra komplekse interaksjoner mellom tumor og tilstøtende ikke-tumorceller [2-5]. Cell-free DNA kan påvises i serum, plasma og andre kroppsvæsker [6], men mekanismene for utgivelse i blodet og opprinnelsen til DNA er langt fra fullt ut forstått. Ytterligere avklaring er nødvendig å foreta en pålitelig skille mellom ondartede øker og ikke-kreft variasjoner i cfDNA.
Studier har antydet at nivået av cfDNA økes i begge kreftpasienter [7-8] og i ulike ikke- ondartede patologiske tilstander i forhold til friske personer. Men en fersk meta-analyse viste inkonsistente resultater [9]. Etablering av en normalområdet er derfor en forutsetning for videre undersøkelse av potensielle rolle cfDNA som en diagnostisk markør, samt av sin nytteverdi i tidlig deteksjon av tilbakefall.
Cell-free DNA har også vært ansett som en potensialet prognostisk markør for utfallet i ulike kreft [10]. Nylig rapporterte vi at cfDNA holdt prognostisk verdi hos pasienter med mCRC [11-13]. Et høyt antall cfDNA alleler i plasma gående korrelert med en dårlig total overlevelse (OS) i våre pasienter behandlet med thirdline kjemoterapi for mCRC, mens pasienter med en lav plasmakonsentrasjon av cfDNA hadde en lengre median OS. Verifisering av disse resulterer i større kohorter er svært relevant i å etablere den kliniske potensialet cfDNA.
I tillegg til sitt potensial som et diagnostisk verktøy og prognostisk markør, er cfDNA også en verdifull kilde for påvisning av tumorspesifikke mutasjoner i den perifere sirkulasjon av kreftpasienter [14-16]. I mCRC, er det en høy frekvens av
KRAS
mutasjoner, som er ansvarlig for motstand mot de mest brukte monoklonale antistoffer rettet mot EGFR [17]. Molekylær analyse av genomiske forandringer er normalt utført på arkivtumorvevet, men det har vært bekymring for at denne fremgangsmåten ikke i tilstrekkelig grad reflekterer sykdommen biologi på tidspunktet for initiering av målrettet EGFR-terapi, som er ofte flere år fra den primære diagnose og /eller kirurgi. Videre gjentatte biopsier er ikke gjennomførbart i praksis og etiske grunner. Derfor kan bruk av cfDNA for å påvise disse tumorspesifikke mutasjoner være et attraktivt tillegg til bedre pasientvalg for målrettet terapi i fremtiden.
De metodene som brukes for DNA kvantifisering har variert over tid, alt fra enkle qPCR metoder til komplekse strålte teknologier og dype neste generasjons sekvense [18,5]. Sensitiviteten og spesifisiteten av analyse har forbedret mange folder siden de innledende studier, men bruken av de forskjellige prøvematerialer og fremgangsmåter for kvantifisering cfDNA, i tillegg til inkonsekvent rapportering, har kompliserte en gyldig sammenligning av resultatene fra forskjellige undersøkelser. Nylige fremskritt innen teknologiske metoder har gjort oss i stand til å utvikle en svært sensitiv qPCR metode for å kvantifisere cfDNA i plasmaprøver, som også er mulig i laboratoriet. Dette har gjort det mulig for oss å undersøke biomarkør potensialet cfDNA i en stor kohort av kreftpasienter og friske kontroller.
Formålet med denne studien var å etablere et normalt nivå av cfDNA i en kohort av friske mennesker og til sammenligne dette cfDNA serien med de fra fire ulike kohorter av pasienter behandlet for mCRC. I tillegg ønsket vi å validere den prognostiske verdien av de før behandling av cfDNA og analysere tumorspesifikke
KRAS
mutasjoner i plasma.
Materialer og metoder
Studiedesign
til sammen 100 friske personer og 229 mCRC pasienter ble undersøkt. Studien ble utført som en potensiell biomarkør undersøkelse i fire sammenhengende fase II og biomarkør studier: den Cetuximab studien [11,20], den TIRASMUS (ClinicalTrials.gov identifikator, NCT00827684, [12], PG (ClinicalTrials.gov identifikator; NCT01109615 [ ,,,0],13] og GemCap (ClinicalTrials.gov identifikator, NCT01472770, [32] studier utført ved Avdeling for kreftbehandling, Vejle Hospital, Danmark, fra april 2005 til november 2012. Alle fire fase II-studier inkluderte pasienter med kjemoterapi refraktær sykdom og biomarkør samlingen var prospektivt gjennomført.
det primære endepunktet var korrelasjon av cfDNA til OS, sekundær progresjonsfri overlevelse (PFS) og evaluering av forskjellen mellom friske kontroller og mCRC pasienter, i tillegg til sammenhengen mellom svulst KRAS (tKRAS) og . plasma KRAS (pKRAS) deteksjon data presenteres etter å bemerke retningslinjer
Pasienter
inklusjonskriteriene i studiene var:. histopathologically bekreftet stadium IV mCRC, behandlingssvikt etter eksponering for flouropyrimidine, oksaliplatin og irinotekan, indikasjon for tredje eller fjerde linjebehandling, ECOG performance status (PS) 0-2, og adekvat organfunksjon.
KRAS Hotell og
BRAF
status avgjøres inkludering i TIRASMUS og PG prøvelser, men ikke i cetuximab eller GemCap studier.
RECIST versjon 1.1 og NCI-CTCAE versjon 4.0 var brukes til å undersøke endepunktene i GemCap og PG studier, mens det i tidligere studier ble RECIST versjon 1.0 og NCI-CTCAE versjon 3.0 brukes.
Alle pasienter gitt signert informert samtykke før studiestart og relevante regulatoriske og etikk komiteer (danske legemiddelverk og Regional Scientific Etisk Komité for Syddansk) godkjent studiene før oppstart. De kliniske studiene ble utført i samsvar med god klinisk praksis retningslinjer som er fastsatt av International Conference on Harmonisering og Helsinkideklarasjonen.
Behandling
The Cetuximab Study.
behandling består irinotecan (350 mg /m
2) hver tredje uke, med ukentlig 250 mg /m
2 av cetuximab (startdose var 400 mg /m
2), inntil progresjon eller uakseptabel toksisitet. Response Evalueringen ble utført hvert tredje behandlingskurer.
TIRASMUS.
Pasientene fikk behandling med mTOR-hemmer temsirolimus 25 mg hver uke inntil progresjon. Deretter ble pasientene behandlet med kombinasjonsterapi bestående av annenhver uke irinotecan (180 mg /m
2) og ukentlig temsirolimus til progresjon eller uakseptabel toksisitet. Response evaluering ble utført hver 6. uke.
PG.
Pasientene fikk pemetrexed (opprinnelig 500 mg /m
2 hver 3.uke) + gemcitabin (1250 mg /m
2, dager 1 og 8) inntil progresjon eller uakseptabel toksisitet. Response Evalueringen ble utført hvert tredje behandlingskurer.
GemCap.
Pasientene fikk kapecitabin (2000 mg /m
2, dag 1-7 q2w) kombinert med gemcitabin (1000 mg /m
2, dag 1) til progresjon eller uakseptabel toksisitet, og responsen ble evaluert hver 12. uke.
sunn kontrollgruppe
den sunne enkelte kohorten ble valgt fra Diabetes Biobank Vejle (godkjent av danske data Protection Agency (journal nr. 2006-53-1385) og den danske vitenskapskomiteen (prosjekt ID S-20080097)).
Individer ble valgt basert på aldersgrupper, og The National danske pasientregister ble åpnet for ICD-10-koder for å sikre en mangel på betydelig komorbiditet (ICD-10 C, D, i og M-koder). Informert samtykke ble innhentet fra den enkelte for bruk av blodprøver, og studien er godkjent av Regional Scientific etiske komité for Syddansk for denne ekstra markør analyse.
Sampling for translasjonsforskning undersøkelser
innsamling av primærtumorvevet og blodprøver for translasjonsforskning er en standard prosedyre i studier utført i vår avdeling. Etter informert samtykke, ble forbehandling av blodprøver trukket før den første behandlingssyklus. Metodene for kvantifisering av cfDNA og mutert
KRAS
alleler i plasma har tidligere blitt beskrevet [11], og informasjon av primere og prober er tilgjengelig på nettet. Plasma ble erholdt fra blodprøver samlet i EDTA-rør og sentrifugert ved 2000
g
i 10 min i løpet av 2 timer etter innsamling, før den ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. Alle prøvene ble analysert, blindet for studie endepunkter.
DNA rensing
DNA ble renset fra en ml plasma ved hjelp av en QIAsymphony virus /bakterier midi-kit på en QIAsymphony robot (Qiagen), i henhold til produsentens instruksjoner. DNA ble eluert i 110 ul. AVE buffer som ble levert med settet.
Cell-free DNA kvantifisering
For å bestemme nivået av cfDNA, mengden av peptidylprolyl isomerase A (cyklofilin A) gen (gCYC, HUGO genet forkortelse PPIA) ble målt ved en in-house qPCR-analyse som beskrevet i [11]. Analysene ble gjennomført i dublicates eller tre paralleller og 5 ul av DNA ble anvendt i hvert 25 ul PCR-reaksjon. For hver PCR et basseng av genomisk DNA ble inkludert som en positiv kontroll, og vann som negativ kontroll. CV av gCYC analyse basert på den positive kontrollen bassenget var fast bestemt på å være 19%. Vann kontroller var alltid negativt.
Primere og prober for in-house gCYC ble utformet med OLIGO 7-programvaren (Molecular Biology Insights Inc, Cascade, CO) (tilgjengelig på nettet, sekvens sjonsnummer NG_029697.1). Termin primer ligger i intron 1-2, sonden i exon 2 og revers primer i intron 2-3 (Forward ACATGGGTACTAAGCAACAAAATAAG, Reverse CACAATTGGAACATCTTTGTTAAAC, Probe Fam-TTGCAGACAAGGTCCCAAAGACAGCA-Tamra). BLAST søk ble utført og ingen uspesifikke mål ble spådd. Analyse av qPCR data ble gjort ved hjelp av SDS-programvare ver. 2.2.2 og CQ verdier ble bestemt ved hjelp av automatisk baseline innstilling og fast terskel på 0,2. Kvantifisering av cfDNA ble gjort ved beregning av kopiantallet av
gCYC
alleler som 10
y-aksen (gCYC) -mean Cq (gCYC) /skråning (gCYC) og normalisering av dette til plasmavolumet.
KRAS mutasjon deteksjon og kvantifisering
KRAS
analyse av arkiv svulstvev fra FFPE ble utført i Cetuximab studie med FDA-godkjente
KRAS
DxS kit (Qiagen), som tidligere rapportert. Tumorprøver fra TIRASMUS, PG og GemCap studiene ble analysert med en validert in-house analysen. De interne analyser er basert på Amplification Ildfast Mutation System-Kvantitativ PCR (ARMS-qPCR) metodikk og oppdager 6 mutasjoner i
KRAS
kodon 12 (Gly12Ala, Gly12Arg, Gly12Asp, Gly12Cys, Gly12Ser, og Gly12Val) og en mutasjon i kodon 13 (Gly13Asp). Primere og prober for in-house
KRAS
analyser, samt
KRAS
mutasjon kontroll PCR-fragmenter, ble utformet med OLIGO 7-programvaren (Molecular Biology Insights Inc, Cascade, CO) ( tilgjengelig på nettet, sekvens sjonsnummer NW_001838052.1). Analysen er lokalisert i exon 2 av det KRAS genet. Analysen ble utført som beskrevet ovenfor. En sammenligning av de to metodene for mutasjonsdeteksjon i svulstvevet har blitt publisert tidligere, og viste fullstendig enighet [19] og standardkurvene er tilgjengelig som elektronisk materiale [11]. Den deteksjonsfølsomhet varierte mellom 0,03% -0,001%, avhengig av typen av mutasjon detektert, 12ASP (1/200000, 0,0005%), 12Cys (1/200000, 0,0005%), 12ser 1/7000, 0,0143%), 13ASP 1 /3000, 0,0333%), 12ALA (1/100000, 0,0010%), 12VAL (1/200000, 0,0005%), 12arg (1/200000, 0,0005%), henholdsvis). En blanding av mutasjon positiv kontroll fragmenter og genomisk donor DNA ble inkludert i hver PCR-kjøring og vann som negativ kontroll. En prøve av ren genomisk donor-DNA ble inkludert for å bestemme spesifisiteten av analysene (Dataene presentert i [11]). CV for KRAS mutasjonsassay og for gCYC analysen ble bestemt basert på data fra PCR-analyser i løpet av et tidsrom på 20 måneder og var mellom 18% og 32%. Vann kontroller var alltid negativt. Kvantifisering av
KRAS
ble gjort ved å beregne kopiantallet av mutert
KRAS
alleler som 10
y-aksen (KRAS) -mean Cq (KRAS) /skråning (KRAS) og normalisering dette til plasmavolumet.
Statistisk analyse
En beskrivende sammenligning av cfDNA nivåer ble utført med tosidig t-test og Wilcoxon rank sum test. Den øvre normale grense, som definert av den midlere + 2SD i kontrollgruppen, ble anvendt for den utforskende cut-off-verdi for overlevelsesanalyse. Kaplan-Meier metoden ble brukt for å estimere PFS og OS. En multivariat Cox regresjonsanalyse ble utført for å undersøke om de ulike variablene var assosiert med redusert overlevelse, inkludert cfDNA nivåer og testing for baseline karakteristika (alder, kjønn og PS) med potensielt innflytelse (kjent prognostiske faktorer eller vesentlige eller border parametere for eksempel p 0,02 ) på overlevelse. En mottaker driftskurve (ROC) analyse ble brukt for å beskrive utførelsen av cfDNA og pKRAS. P-verdier referert til to-tailed tester og ble betraktet som signifikant når p ≤ 0,05. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av NCSS statistisk programvare 2007 v.07.1.5 (NCSS statistisk programvare, Utah 84037, USA, www.ncss.com).
Resultater
Pasient egenskaper
sykdom og forbehandling pasientkarakteristika er presentert i tabell 1. median alder i total kohort av pasienter var 63 år (range 35-82) og de fleste var menn, for det meste i god allmenntilstand. Det var ingen signifikante forskjeller i alder, kjønn eller funksjonstilstand mellom 5 kohortene.
Den sunne enkelte kohorten inkluderte 10 menn og 10 kvinner i alderen 25-44 år, 20 menn og 20 kvinner i alderen 45- 59 og 60-75.
de fleste av pasientene i studiene hadde tilgjengelige blodprøver. Dermed ble totalt 229 pasienter inkludert fra de fire studiene, og 223 hadde tilgjengelig svulstvev og 211 en matchende baseline plasmaprøve. De manglende resultatene var på grunn av dårlig kvalitet svulst DNA eller på grunn av utilstrekkelig mengde plasma i prøvene.
Cell-free DNA og forbehandling egenskaper
Median cfDNA nivåer i de enkelte kohorter er gitt i tabell 1. Cellefrie frie~~POS=HEADCOMP DNA-nivåer ble analysert for korrelasjon til sykdom og pre-behandlingskarakteristika. Det var ingen signifikante forskjeller i median cfDNA nivåer i henhold til alder eller kjønn, men betydelig høyere cfDNA konsentrasjoner med økende PS (tabell 1).
Cell-free DNA i kreftpasienter sammenlignet med friske individer
den midlere og median konsentrasjoner av cfDNA i kontrollgruppen var 2800 og 2400 alleler per ml plasma, henholdsvis innenfor et område på 800 til 14000-alleler per ml plasma. Medianverdien av cfDNA i hele kullet av kreftpasienter var 17900 alleler per ml plasma (range 800-4618400). Figur 1A illustrerer forskjellene i cfDNA konsentrasjoner i plasma hos friske kontroller og grunnlinjeprøver fra forskjellige kullene av kreftpasienter. Data er presentert som en eske plotting av verdiene på en logaritmisk skala, og nivåene hos kreftpasienter var betydelig høyere enn i friske kontrollgruppen. Nivåene av cfDNA var lik mellom kohorter av kreftpasienter. Forskjellene i cfDNA var svært signifikant mellom kontrollgruppen og alle enkelte grupper av kreftpasienter (alle p-verdier var 0,0001). Kraften til å skjelne mellom friske individer og kreftpasienter ble testet ved å estimere ROC og arealet under kurven (AUC) som vist i figur 1B. AUC var 0,9486 (95% KI 0,9182 til 0,9679, p 0,00001).
En skildrer Box og whisker tomter med 25%, 50%, 75% percentil, øvre og nedre grenser verdier og utliggere (prikker) . Horisontalt fire kliniske studier kohorter og kontrollgruppen, vertikalt cfDNA konsentrasjon på en logaritmisk skala. C cetuximab studien, GemCap GemCap kohort, PG PG studiekohorten, T TIRASMUS studiekohorten Controls friske kontrollgruppen. B viser en mottaker driftskurve (ROC) estimere ytelsen cfDNA å diskriminere mellom pasienter med kolorektal kreft og kontroller. AUC var 0,9486, (95% KI 0,9182 til 0,9679, p 0,00001).
Den prognostiske verdien av cfDNA hos kreftpasienter
Survival analyse ifølge cfDNA nivåer presenteres separat for de enkelte kreftgrupper med de primære studieresultatene [11-13]. En samlet analyse av alle pasienter bekreftet en kortere total overlevelse med økende nivåer av baseline cfDNA. 2A illustrerer Kaplan-Meier-kurver av OS i pasientene delt inn i fire grupper etter kvartiler av cfDNA nivåer. OS av pasienter kategorisert i lav eller høy konsentrasjon cfDNA grupper basert på det øvre normale område for kontrollgruppen (definert som midlere cfDNA + 2SD = 7100 alleler per ml) er vist i figur 2B. Cox regresjon multivariat analyse inkludert alder ( / 63 år), kjønn, PS og cfDNA kvartiler (behandlet som en kontinuerlig variabel) bekreftet en uavhengig prognostisk verdi av cfDNA i hele kullet. Som en kontinuerlig variabel, det var et OS Hazard Ratio på 1,5 (95% KI 1,3-1,7) for hver økning i cfDNA nivå kvartil (tabell 2).
A. Pasientene er gruppert etter kvartiler av cfDNA (fra høyre) lavest, nest laveste, nest høyeste og høyeste kvartil av cfDNA. Median OS ifølge cfDNA kvartiler var; 10,2 måneder (95% CI 8.9-12.8), 7,8 måneder (5.7-9.3), 5,0 måneder (4.3-6.0) 3,5 måneder (3,0-3,9), henholdsvis. B. Pasientene er gruppert etter den øvre normalområdet som er definert av middel cfDNA + 2SD i kontrollgruppen (7100 alleler per ml.) Lav risikogruppe (full line), Median OS, 10,2 måneder (8.3-11.7). Høy risikogruppe (stiplet linje) Median OS, 5,2 måneder (04.06 til 05.09). HR 1,78, p = 0,0006.
Påvisning av KRAS-mutasjoner i tumor og plasmaprøver
I alt 211 pasienter hadde både kreft og plasmaprøver tilgjengelig for pålitelig deteksjon av
KRAS
mutasjoner. Plasmaprøver med et lavt antall cfDNA alleler ble ikke ekskludert fra analysen. Tumor-spesifikke
KRAS
mutasjoner ble oppdaget i totalt 119 plasmaprøver. Den totale samsvar mellom mutasjonsstatus i svulsten og plasma var høy: (180/211 = 85%) og 112 av de 140 tumorprøver med mutasjoner påvist
KRAS
mutasjoner i plasmaprøver også, mens bare tre tilfeller ble observert hvor pasientene hadde en påvisbar mutasjon i plasma, men ikke i den primære tumoren.
Cell-free DNA og korrelasjon med tumorspesifikke mutasjoner KRAS
korrelasjonen mellom antall totale celle frie DNA-alleler og antallet av muterte KRAS-alleler i KRAS mutant pasientene ble analysert ved hjelp av Spearman rang korrelasjon. På grunn av det store omfanget av kvantitative nivåer en logaritmisk skala ble brukt. Som det fremgår av figur 3, som viser den cellefrie DNA vertikalt, og antallet av muterte alleler KRAS horisontalt disse var sterkt korrelert Fig 3 (R «> 2 = 0,97, Spearman rang = 0,86, p 0,000). Dette bekrefter de foreløpige data fra undersøkelsen cetuximab [11), og indikerer at en betydelig andel av cfDNA opprinnelse fra tumor-DNA (som representert ved DNA med tumorspesifikke mutasjoner KRAS)
Dette plottet illustrerer den sterke korrelasjonen mellom det totale antall DNA-alleler og antallet av muterte alleler i pasienter med KRAS mutasjoner som detekteres. Den Spearman rank korrelasjon ble beregnet til 0,86 og r
2 = 0,97 (
p
0.0000). De forskjellige symbolene representerer de enkelte årskull av kreftpasienter. (Square PG korrelasjon = 0,9, sirkel cetuximab korrelasjon = 0,88, trekant GemCap korrelasjon = 86, femkant TIRASMUS korrelasjon = 0,67).
Diskusjoner
Økt fokus på translasjonsforskning og nyere teknologisk fremskritt har gitt ny innsikt i den kliniske viktigheten av cfDNA i kreft og dens potensial for påvisning av tumor-spesifikke mutasjoner i perifer sirkulasjon.
Som et mål på den totale mengden av cfDNA, denne studien undersøkte antall alleler av den cyklofilin genet, og bekreftet et høyere nivå i mCRC pasienter enn hos friske kontroller. Et søk etter lignende studier viser sprikende resultater; imidlertid forskjeller i prøvingsmetoder foreta direkte sammenligninger vanskelig. Generelt er det variasjoner i fremgangsmåten anvendt for DNA-rensing, referansegenet målt, og gruppene av de undersøkte individer. Likevel, noen få studier i CRC pasienter støtter våre data [21-24]. En veldig fersk studie utforsket flerbruks nytten av sirkulerende plasma DNA hos pasienter med avansert kreft ved hjelp av en annen metodisk tilnærming, viser generelt høyere nivåer av cfDNA i CRC, bryst, prostata og andre kreftformer enn i friske kontroller [8]. Men den prøvestørrelse på denne studien ikke tillater etablering av en normalområdet (n = 20), men dens resultater ikke støtter de foreliggende data. En fersk observasjon i lokal avansert endetarmskreft, til tross for bruk av en annen metode for å måle cfDNA, viste også en signifikant forskjell i cfDNA nivåer mellom kontroller og tidlig fase kreft i endetarmen [25]. Evnen til å diskriminere cfDNA nivåer mellom våre kolorektal kreftpasienter og friske kontroller var utmerket, støtter behovet for videre studier av cfDNA i tidligere kreft stadier og forstadier til kreft. Videre variasjonen av cfDNAin personer med ikke-kreft komorbiditet må ytterligere belyst, for å ta høyde for potensiell bias. Denne studien understreker også viktig biologisk rolle cfDNA i denne sykdommen. Den forhøyede konsentrasjonen av cfDNA i kreftpasienter og korrelasjon med en rekke muterte alleler indikerer også at cfDNA er stort sett tumor avledet, selv om opprinnelsen fremdeles udefinert.
Det er et behov for nye metoder for bedre utvalg pasienter for behandling i tungt forbehandlet mCRC. I fire fortløpende gjennomført kliniske fase II-studier har vi bekreftet en ensartet cfDNA og en klar prognostisk verdi.
En nylig publisert studie fra vår gruppe har vist at cfDNA er ikke bare et mål på tumorbelastning [ ,,,0],26]. I stedet foreslår vi at total cfDNA er mer sannsynlig å reflektere både tumorbelastning og biologiske mekanismer og er derfor et mer sammensatt bilde av sykdommen på et visst stadium. Likheten av baseline nivåer mellom de fire fase II-studier vi observerte illustrerer homogenitet av pasientenes kohorter. Pasientene ble alle valgt basert på sanne kjemoterapi ildfast status snarere enn linjer av terapi, som kan variere basert på definisjoner og tidligere behandlingsstrategier, og er dermed en mindre presis definisjon av avansert stadium av sykdommen. En sammenligning mellom våre kohorter og påfølgende pooling av data er derfor berettiget som også støttes av den multivariate analysen. Forskning i kjemoterapi naive pasienter bør være fokus for fremtidige studier.
Høyere utgangsnivået viste en sterk sammenheng med dårlig prognose, først når analysert i den enkelte fase II-studier, andre når vurdert i henhold til kvartiler av cfDNA nivåer i den totale CRC årsklasse, og til slutt da delt inn i høy og lav konsentrasjon grupper basert på maksimal cfDNA nivået hos friske individer. Videre er den kombinerte analysen er tillatt for en pålitelig multivariat analyse, som bekreftet en sterk prognostisk virkningen av cfDNA som en kontinuerlig parameter. Den prognostiske verdi av cfDNA er blitt beskrevet i en rekke kreftformer, men bare noen få i forhold til kjemoterapi [15-16, 27]. Den nylig publisert rapport fra Perkins et al er i samsvar med våre data, og er en av de få studier som undersøker cfDNA hos pasienter behandlet for avansert kreft [8].
Terapi for CRC vil utvilsomt fortsette å utvikle mot målretting individuelle molekylære egenskaper av sykdommen. Men svulst heterogenitet, genomisk ustabilitet, og klonale molekylær evolusjon stiller høye krav til en presis og rettidig karakterisering. Utføre gjentatte tumor biopsier har blitt gjort, men er upraktisk og innebærer en risiko for pasienten. Ved hjelp av plasma som en flytende biopsi for mutasjonsdeteksjon har mange fordeler, og kunne overvinne problemene forbundet med gjentatte tumor biopsier. Gjentatt testing under behandlingen gjøres enkelt og nåtid metode utviklet for påvisning av
KRAS
mutasjoner er gjennomførbart, relativt billig, rask og kan utføres på en storstilt basis. Imidlertid vil den foreliggende qPCR-teknologien tillater bare et begrenset antall PCR-reaksjoner kjøres per prøve. Siden
KRAS
har en dominerende klinisk effekt og høy frekvens i mCRC denne tilnærmingen er fortsatt mulig, mens metoder som neste generasjons sekvensering kan bli aktuelt hvis flere mutasjoner med potensial klinisk betydning og tilgjengelige mål blir avslørt. Men på dette tidspunktet, synes en enkel og gjennomførbare metoden for disse undersøkelsene den mest rasjonelle tilnærming, spesielt med tanke på at tilstrekkelig utvalgsstørrelser for pålitelige kliniske undersøkelser er av største betydning.
oppklaringsprosenten av tumorspesifikke mutasjoner i plasma er avhengig av spesifisiteten og sensitiviteten til analysen, som kan økes ved pre-analyse forsterkningstrinn, så vel som på mengden av cfDNA i prøven. Sistnevnte kan overvinnes ved å øke den initiale volum av plasma analysert. Disse aspektene må vurderes når adressering samsvar mellom primærtumor og plasma mutasjonsstatus, som var høyt med vår metode i forhold til de få relevante studier i litteraturen [28-30]. Årsaker til disharmoni inkluderer mulige dårlige kvaliteten på DNA ekstrahert fra parafin innebygd arkiv svulstvev, eller ekte sykdom heterogenitet og klonal molekylær evolusjon i løpet av flere linjer med terapi.
Det er klinisk relevant å undersøke om p
KRAS
kan brukes som et utvalgskriterium for EGFR-hemmer behandling i stedet for t
KRAS
gjenkjenning. De foreliggende data og en tilsvarende tidligere rapport [31] tyder på at p
KRAS
status har en sterk prediktiv verdi i denne innstillingen. Dette gjelder også for de kohorter av våre pasienter som ikke ble behandlet med EGFR-hemmere. Imidlertid bør resultatene fra våre små ikke-randomiserte studier tolkes med forsiktighet, og nærmere undersøkelser i større utvalgsstørrelser, fortrinnsvis i randomiserte studier, er garantert.
Vi har gitt test og validerings kohorter med tilstrekkelig utvalgsstørrelser for multivariat analyse av den prognostiske verdi og for definisjonen av et normalt område av cfDNA. Denne studien bekrefter prognostisk nytten av cfDNA i plasma og gjennomførbarhet for mutasjonstesting med metoden presentert. Vi oppfordrer til felles innsats for å sammenligne, validere og prospektivt undersøke hvilken rolle cfDNA kvantifisering i kreft, med helhetsperspektivet oversette resultatene i klinisk behandling av pasienter med avansert kreftsykdommer.
Takk
Vi takker Forskningsrådet, Lillebælt Hospital, Asta og Peter Götz-Petersens Fundation, og Novo Nordisk Foundation for finansiering av studien.
