Abstract
Nylig godkjente kjemoterapeutiske midler til behandling av tykktarmskreft ( CRC) har gjort noen innvirkning; men det er et presserende behov for nyere målrettede midler og strategier for å omgå CRC vekst og metastasering. CRC stiller ofte naturlig motstand mot kjemoterapi og de som svarer i utgangspunktet senere erverve resistens. En mekanisme for å sensibilisere potensielt CRC-celler er ved blokkering av DNA-polymerase β (Pol-β) aktivitet. Temozolomide (TMZ), et alkyleringsmiddel, og andre DNA-samspill agenter utøver DNA-skade primært reparert av en Pol-β-rettet basen excision reparasjon (BER) veien. I tidligere studier har vi brukt strukturbasert molekylær dokking av Pol-β og identifisert en potent lite molekyl inhibitor (NSC666715). I denne studien har vi fastslått at mekanismen som NSC666715 og dets analoger blokk Fen1-indusert strand-forskyvning aktivitet av Pol-β-rettet LP-BER, forårsake apurinic /apyrimidinic (AP) site akkumulering og indusere S-fase cellesyklus arrestere. Induksjon av S-fase cellesyklus-stans fører til begynnende alderdom og apoptose av CRC-celler via p53 /p21 pathway. Vår første funn viser også en 10-fold reduksjon av IC
50 av TMZ i kombinasjon med NSC666715. Disse resultatene gir en veiledning for utvikling av en target-definert strategi for CRC kjemoterapi som vil være basert på virkningsmekanismer av NSC666715 og TMZ. Denne kombinasjonen strategien kan bli brukt som et rammeverk for å ytterligere redusere TMZ doser og motstand i CRC pasienter
Citation. Jaiswal AS, Panda H, Law BK, Sharma J, Jani J, Hromas R, et al. (2015) NSC666715 og analoger Hemme Strand-Displacement aktivitet av DNA polymerase β og potensere Temozolomide-indusert DNA Damage, Senescence og apoptose i tykktarmskreftceller. PLoS ONE 10 (5): e0123808. doi: 10,1371 /journal.pone.0123808
Academic Redaktør: Robert W. Sobol, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 22 juli 2014; Godkjent: 07.03.2015; Publisert: 01.05.2015
Copyright: © 2015 Jaiswal et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. den økonomiske støtten til disse studiene ble gitt av National Institutes of Health (NIH) tilskudd R01-CA097031. Celprogen Inc. gitt støtte i form av lønn for forfattere Jay Sharma og Jitesh Jani, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Jay Sharma og Jitesh Jani er ansatt av Celprogen Inc. og har økonomiske interesser i selskapet. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft dødsfall blant amerikanske menn og kvinner (Cancer Tall og fakta 2014, American Cancer Society, Atlanta, GA). Den nåværende metode for å oppdage anti-tumormidler er avhengig av semi-empiriske screeningprosedyrer. Imidlertid har identifisering av midler ved denne metode vist seg å være ineffektive ved behandling av CRC på grunn av en manglende forståelse av deres farmakologi og deres sum-total effekt på skjebnen til cellene i en
in vivo
miljøet, innenfor sammenheng med avvikende trasé, og i svulsten mikromiljøet [1-4].
det er godt etablert at en kompenserende DNA-reparasjon kapasitet i tumorceller begrenser i stor grad effektiviteten av DNA-alkylere anti-kreft-midler og, viktigst, fører til tilbakefall av resistente svulster [5-7]. Anvendelsen av DNA-alkylerende midler som kjemoterapeutiske medikamenter er basert på deres evne til å utløse en respons celledød [8] og deres terapeutiske effekt er bestemt av balansen mellom DNA-skade og reparasjon. De DNA-alkylerings skade-indusert lesjoner er reparert av DNA polymerase β (Pol-p) -rettet basen excision reparasjon (BER), O
6-metylguanin DNA-metyltransferase (MGMT), og mismatch reparasjon (MMR) veier. Spesielt, inhibitorene som er utviklet som kreft narkotika hovedsakelig rettet mot disse tre veier [9, 10]. Den aktive nedbrytningsproduktet fra DNA-alkylere prodrug-TMZ (NSC362856; 3,4-dihydro-3-metyl-4-oxoimidazo [5,1-
d
] -1,2,3,5-tetrazine -8-karboksamid) er 5- (3-methyltriazen-1-yl) imidazol-4-karboksamid (MTIC) [11, 12], som methylates DNA i N
7-metylguanin (N
7meG), N
3-metyladenin (N
3meA), N
3-metylguanin (N
3meG) og O
6-metylguanin (O
6meg) i synkende reaktivitet. BER er ansvarlig for reparasjon av 70%, 5% og 9% av N
7-MEG, N
3-Meg og n
3-Mea lesjoner indusert av TMZ, henholdsvis [13- 16]; har imidlertid den potensielle nytten av Pol-β som et mål av den BER veien blokade ikke blitt utforsket.
I tidligere undersøkelser, har vi vist at det lille molekylet NSC666715 [4-klor-N- [5- (4-kloranilino) -1 H-1,2,4-triazol-3-yl] -5-metyl-2-sulfanylbenzenesulfonamide] ligner interaksjonen av adenomatøs polypose coli (APC) med Pol-β og klaff endonuklease 1 (Fen1) , blokkerer Pol-β-rettet BER vei, og forbedrer cytotoksisitet av TMZ til CRC [17]. TMZ produserer trådbrudd i løpet av BER-mediert reparasjon av N
7-Meg og N
3-mea addukter. Avbrytelse av BER reaksjonsveien kan bidra til cytotoksisiteten av TMZ på grunn av opphopning av AP områder etter generering av DNA-trådbrudd [18]. TMZ-indusert celledød er blitt rapportert å være formidlet av flere veier avhengig av typen av kreftceller og konsentrasjonen av medikamentet.
Hvis AP-områdene ikke er reparert, samler de seg og føre til single-strand DNA pauser (SSBs) som stall DNA replikasjonsgaffelen og danner dobbel tråd (og singel-strand) DNA pauser under S-fasen. Disse unwound gafler utløse apoptose når de kollapser å danne ensidige dobbel-strand DNA pauser (DSB sin) [19]. Kjemoterapi-indusert DSB er forbundet med alderdom og apoptose [20, 21]. I denne studien undersøkte vi hvordan blokaden av BER veien ved NSC666715 (og dets analoger) kan være involvert i TMZ-indusert AP stedet akkumulering, og senescence og apoptose i HCT116 CRC celler. Vår sentrale hypotese er at blokkeringen av BER vil indusere signifikant akkumulering av TMZ-medierte AP områder som fører til begynnende alderdom, etterfulgt av aktivering av kaspase 3 /PARP1 spalting. Dette er forutsagt å resultere i CRC vekstinhibering ved apoptose, forårsaket av redusert nivå av anti-apoptotiske protein, BCL2, og økte nivåer av de pro-apoptotiske protein, Bax [22, 23].
Materialer og metoder
Vedlikehold av celler og behandling
HCT116 humane tykktarmskreft cellelinjer med vill-type
p53
genet (p53
+ /+) eller med
p53-genet
-knockout (p53
– /-) eller
p21
gen-knockout (p21
– /-) ble dyrket i McCoys 5a-medium supplert med 10% føtalt bovint serum ( FBS; HyClone), 100 E /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Den HCT116-cellelinjen ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA). Denne cellelinje ble anvendt fordi den er motstandsdyktig mot alkyleringsmidler som følge av MMR-mangel. Den HCT116 (p21
– /-) og HCT116 (p53
– /-). Cellelinjer ble gitt av Dr. Bert Vogel (Johns Hopkins University) [24, 25]
Oligonukleotider og kjemikalier
oligonukleotider for lang patch (LP) -BER analysen ble kjøpt fra Sigma-Genosys (Woodlands, TX). T4-polynukleotidkinase (PNK) ble kjøpt fra New England Biolabs (Ipswich, Massachusetts) og radionuklide [γ-
32P] ATP ble kjøpt fra Perkin Elmer, Inc. (Boston, MA). Lavmolekylære inhibitorer (SMIs) NSC666715 og dets analoger NSC661073 [N- (5-anilino-1H-1,2,4-triazol-3-yl) -4-klor-5-metyl-2-sulfanylbenzenesulfonamide], NSC666713 [2- – [2 – [(5-anilino-1H-1,2,4-triazol-3-yl) sulfamoyl] -5-klor-4-metylfenyl] sulfanylacetic syre], NSC666717 [4-klor-N- [5- (3-metoksyanilino) -1H-1,2,4-triazol-3-yl] -5-metyl-2-sulfanylbenzenesulfonamide], og NSC666719 [4-klor-5-metyl-N- [5- (naftalen-2- ylamino) -1 H-1,2,4-triazol-3-yl] -2-sulfanylbenzenesulfonamide], og TMZ ble hentet fra Developmental Therapeutics Program av National Cancer Institute of National Institutes of Health (DTP, NCI-NIH ). Den kjemiske strukturen til disse SMIs er vist i figur 1.
De kjemiske strukturer av NSC666715 og dets analoger NSC661073, NSC666713, NSC666717 og NSC666719 er utarbeidet ved hjelp av ChemDraw programvare.
Syntese og merking av DNA Underlag
for å undersøke effekten av SMIs på Pol-β-rettet strand-fortrengning og LP-BER aktiviteter, ble en 63-mer oligonukleotid syntetisert som beskrevet tidligere [26]. Nukleotidsekvensen av dette oligonukleotid inneholder en AP-område analogt kjent som F (3-hydroksy-2-hydroksymetyltetrahydrofuran), som er plassert ved 24-nt og betegnet som F-DNA (5′-CTAGATGCCTGCAGCTGATGCGCFGTACGGATCCACGTGTACGGTACCGAGGGCGGGTCGACA-3 «). F-DNA ble gelrenset og merket med [γ-
32P] ATP ved 5′-enden ved bruk av T4-polynukleotidkinase og hybridisert til et komplementært oligonukleotid tråd.
In vitro
Strand-forskyvning syntese og LP-BER analysen
Pol-β-rettet strand-forskyvning analysen reaksjons~~POS=TRUNC blandingen~~POS=HEADCOMP ble satt sammen i en 30 mL volum med 30 mM Hepes, pH 7,5, 30 mM KCl, 8,0 mM MgCl
2, 1.0 mM DTT, 100 ug /ml BSA, 0,01% (v /v) Nonidet P-40, 2,5 nM av
32P-merket 63-mer F-DNA-substrat, 2 nM av AP-endonuklease 1 (APE1), 5 nM av Pol-β og 0-125 iM SMIs. LP-BER Reaksjonen ble rekonstituert ved å bruke rensede proteiner i et endelig reaksjonsvolum på 30 pl inneholdende 30 mM HEPES, pH 7,5, 30 mM KCI, 8 mm MgCl
2, 1 mm ditiotreitol, 100 pg /ml bovint serumalbumin, 0,01% Nonidet P-40, 0,5 mM ATP, og 10 um hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP. Reaksjonsblandingen ble satt sammen på is ved tilsetning av 0,5 nm APE1, 2,5 nm Pol-β, 10 nm klaff endonuklease 1 (Fen1), og 100 nm DNA-ligase I og deretter inkubert i 5 min. Reaksjonene ble initiert ved tilsetning av 2,5 ng
32P-merket 63-mer F-DNA, etterfulgt av inkubasjon ved 37 ° C i 45 min. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av stopp-buffer (0,4% (vekt /volum) SDS, 5 mM EDTA, 1 pg proteinase K) og inkubert ved 37 ° C i ytterligere 30 minutter [17, 26-29]. Etter inkubering ved 37 ° C, ble DNA utvunnet ved fenol /kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling. Det gjenvunne DNA ble vasket med kald 70% etanol og suspenderes i prøven lasting fargestoff. Reaksjonsproduktene ble separert på en 15% akrylamid og 7 M ureagel. De radioaktive signalene ble visualisert ved autoradiografi.
Western blot analyse
For Western blot analyse, ble encellede suspensjoner av HCT116 cellene belagt (0,5 x 10
6 celler per 60 mm tallerken ) i triplikat. Etter 24 timer, når cellene var festet til platene, ble de behandlet med lite molekyl-inhibitor (er) alene eller i kombinasjon med TMZ i 48 timer. Endringer i proteinnivåer etterfølgende behandling av SMI tallet ble bestemt ved Western blot-analyse ved bruk av hel-celle-ekstrakter. Antistoffene som anvendes til å påvise nivåene av p53, p21, BCL2, Bax, Poly [ADP-ribose] polymerase 1 (PARP-1), spaltes PARP1, spaltes caspase 3, caspase 3, apoptose induserende faktor (AIF) og GAPDH ble oppnådd fra cellesignalisering Technologies (Danvers, MA).
Evaluering av AP steder i genomisk DNA
for estimering av antall AP nettsteder, en encellet suspensjon av HCT116-celler ble belagt ( 0,5 x 10
6-celler per brønn) i triplikat i seks-brønns plater. Når cellene var festet til platene, de ble forbehandlet i 2 timer med 25 uM av NSC666715, NSC666717 og NSC666719 etterfulgt av 500 uM av TMZ behandling i ytterligere 48 timer. Celler ble høstet og AP-områder ble bestemt ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i tidligere studier [30, 31]. Genomisk DNA fra de behandlede og ubehandlede grupper ble isolert ved hjelp av GenElute pattedyr genomisk DNA isolasjonskit (Sigma Aldrich-, St. Louis, MO). Fem til 10 ug av det genomiske DNA i 150 ul av 1 x PBS ble inkubert med 1 mM aldehyd reaktiv probe (ARP) (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) ved 37 ° C i 10 min, deretter etanolpresipitert og til slutt løst opp i 1x TE-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,2) og kvantifisert.
ARP reagerer med AP sete-inneholdende genomisk DNA og danner et kompleks, som kvantitativt kan påvises ved hjelp av kjemiluminescens deteksjon. I korthet, en ug av ARP-behandlede varme-denaturert DNA ble spalte-blottet på en positivt ladet nylonmembran (Amersham Corp., Piscataway, New Jersey). Nylonmembranen ble fuktet med 5 x SSC (0,75 M NAC1, 0,075 M trinatriumcitrat) ved 37 ° C i 15 min, kort lufttørket og bakt i en vakuumovn ved 80 ° C i 1-2 timer. Membranen ble preinkubert med 10 ml Tris-NAC1-buffer inneholdende BSA (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NAC1, 1 mM EDTA, 0,5% kasein, 0,25% BSA og 0,1% Tween 20) ved romtemperatur i 1 time. Membranen ble deretter inkubert i den samme løsning inneholdende streptavidin-konjugert pepperrotperoksidase (BioGenex, San Ramon, CA) ved romtemperatur i 30-45 min. Membranen ble skylt tre ganger i 10 minutter hver med vaskebuffer (0,26 M NAC1, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HC1, og 0,1% Tween 20, pH 7,5) ble, og pepperrotperoksydase enzymatiske aktivitet på membranen visualisert ved hjelp ECL-reagens (Amersham Corp., Piscataway, New Jersey). Membranen ble deretter eksponert for røntgenfilm (Kodak XAR 5x, Kodak) i 5-10 sek. Den utviklede Filmen ble analysert for kvantifisering av AP nettsteder som bruker ImageJ programmet (Rasband, WS, ImageJ, amerikanske National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014 ). Alle forsøk ble utført in triplo.
Senescence forbundet β-galaktosidase-aktivitetsanalyse (SA-βgal Assay)
Senescence forbundet-β-gal-aktivitet ble målt som beskrevet tidligere [32, 33] med mindre modifikasjoner [34]. HCT116-celler ble forbehandlet i 2 timer med SMIs fulgt av TMZ behandling i ytterligere 48 timer. Celler i sub-konfluente kulturer ble vasket med is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS), fiksert i 4% (v /v) paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved romtemperatur, og vasket igjen tre ganger med PBS. Celler ble inkubert med nylaget fargeløsning som inneholdt 1 mg /ml 5-brom-4-klor-3-indolyl β-D-galaktosid (X-gal), 40 mM sitronsyre-natriumfosfat (pH 6,0), 5 mM kalium ferricyanid, 5 mM kaliumferrocyanid, 150 mM NaCl og 2 mM MgCl
2 i 24 timer ved 37 ° C. De blå-farget celler ble observert under mikroskop (Leica DMI 4000B). ble observert antall senescence tilknytte β-gal-positive celler og analysert under et mikroskop (Leica DMI 4000B), og antallet SA-β-gal-positive celler (blå fargede celler) ble tellet i en total fanget område av bilde. Vi vilkårlig satt den visuelle grensen for å utelukke de falske positive celler som bakgrunn for SA-β-gal-positive celler i et definert område på bildet. Resultatene er uttrykt som prosent av SA-β-gal-positive celler til totale celler [35].
fluorescensaktivert cellesortering (FACS)
For bestemmelse av cellesyklusprogresjon profil, vi belagt HCT116-celler i 60 mm vevskulturstudier retter og vokste dem før de nådde 60% samløpet. HCT116-celler ble forbehandlet i 2 timer med NSC666715 (50 uM) og PFTα (10-30 mikrometer) etterfulgt av TMZ (500 pM) i ytterligere 48 timer som angitt i tabell 1 legende. Cellene ble høstet, vasket en gang med iskald PBS, og behandlet for FACS-analyse som tidligere beskrevet [36]. Det cellulære DNA-innholdet ble analysert ved anvendelse av en Becton-Dickinson FACScan strømningscytometer (San Jose, CA). Minst 10.000 celler per prøve ble vurdert i gated regioner brukes til beregninger. Områdene for G
0 /G
1, S, G
2 /M og sub-G
1 fase (apoptotiske) celler ble etablert basert på deres tilsvarende DNA-innholdet i histogrammene. Resultatene ble analysert og uttrykkes i prosent av de totale gated celler ved hjelp av ModfitLT 3.1 programmet (Verity Software House, Topsham, NE).
Statistisk analyse
Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger, og resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE. One Way variansanalyse (ANOVA) ble beregnet med Sigmaplot 9 (Systat Software, San Jose, California). En en-halet t-test ble anvendt for å sammenligne noen signifikant forskjell mellom kontroll og behandlede grupper. Kriteriet for statistisk signifikans var p 0,05. For vestlige blotting resultater, ble bandet intensiteter målt ved hjelp av ImageJ og normalisert med GAPDH.
Resultater
Pol-β-hemmer NSC666715 og dets analoger hemmer LP-BER i en
i vitro
rekonstituert system
i denne studien har vi testet flere analoger av NSC666715 som NSC661073, NSC666713, NSC666717, og NSC666719 for deres evne til å blokkere LP-BER. De representative LP-BER-resultater er vist i figur 2. Utseendet av de 23-mer innsnitt produkt i Bane 2 viser den funksjonelle aktiviteten til det APE1 proteinet. Pol-β-mediert 1-nt innlemmet 24-mer produkt i Lane tre og Strand-forskyvning produkter i Lane 4. Stimulering av strand-forskyvning syntese av Pol-β ved Fen1 er en etablert funksjon i Fen1-mediert LP-BER [28, 29, 37, 38]. I disse eksperimenter viste vi at SMIs redusert Fen1-mediert tråd-Fortrengningsaktiviteten Pol-β (figur 2, sammenlign spor 5 med 6-9, 10-13, 14-17, 18-21, og 22-25, henholdsvis), en konsekvens av blokkert LP-BER (fig 2, sammenligner 63-mer reparert produkt av kjørefelt 4 med 6-9, 10-13, 14-17, 18-21, og 22-25, henholdsvis). Den SMIs viste videre blokaden av LP-BER på 50 mikrometer; men den maksimale sammenlign blokaden ble sett ved lavere konsentrasjoner var NSC666715 og sine to analoger NSC666717 og NSC666719 (figur 2, sammenlign spor 5 med 14-17, 18-21 og 22-25, henholdsvis).
LP-BER ble bestemt ved å bruke en
in vitro
rekonstituert analysesystem.
Panel A
viser forsøksprotokoll. Analyse detaljer er gitt i materialer og metoder.
Panel B
viser et autoradiogram av LP-BER, som er representative for tre forskjellige eksperimenter. Lane 1 viser
32P-merket 63-mer F-DNA og Lane 2 viser 23-mer produkt etter APE1 snitt. Felt 3 viser Pol-β-mediert trådfortrengningssyntese. Felt 4 viser Pol-β-mediert trådfortrengningssyntese stimulert ved Fen1 (spor 4). Felt 5 viser den fullstendige reparasjon av 63-mer-DNA-F gjennom LP-BER bane i nærvær av APE1, Pol-β, Fen1 og DNA-ligase I. Kolonnene 6-9, 10-13, 14-17, 18 -21 og 22-25 viser effekten av ulike konsentrasjoner av Pol-p-hemmere NSC 661073, 666713, 666715, 666717 og 666719 på LP-BER aktivitet.
Pol-B Strand-forskyvning hemmere øke byrden av AP områder i CRC-celler etter behandling TMZ som en konsekvens av cellulær toksisitet
i disse forsøk fastslått at det er graden av DNA-skade eller genereringen av AP områder etter TMZ behandling i nærvær eller fravær av SMIs i HCT116-cellelinjen. Den testede SMIs (NSC666715, NSC666717 og NSC666719) viste en økning i AP områder (figur 3, sammenlign spor 1 med 2), og byrden av AP områder ble ytterligere økt med kombinasjonsbehandling med TMZ (figur 3, sammenlign spor 1, med 3 og 4, henholdsvis). Siden SMIs blokkere Pol-β sti og ikke forstyrre med MMR sti, som forventet var det ingen signifikant forskjell på nivået av AP nettsteder i både MMR-mangelfulle og MMR-dyktig HCT116 cellelinjer etter TMZ behandling alene eller i kombinasjon med SMIs (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at SMIs NSC666715, NSC666717, og NSC666719 er spesifikke for Pol-β-rettet blokade av BER vei, og er derfor involvert i TMZ-indusert opphopning av AP nettsteder.
Celler ble forbehandlet for 2 h med 25 pM av de lavmolekylære inhibitorer NSC666715, NSC666717 og NSC666719, etterfulgt av behandling med 500 uM av TMZ i ytterligere 48 timer. Genomisk DNA ble isolert og behandlet for AP-området bestemmelse som beskrevet i Materialer og Metoder.
Panel A
viser sporet blot analyse av AP steder i HCT116 cellene behandlet med 25 mikrometer av NSC666715, NSC666717 og NSC666719 og 500 mikrometer TMZ.
Panel B
viser kvantitativ analyse av AP nettsteder. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SE av tre forskjellige bestemmelser. * = Signifikant forskjellig fra den ubehandlede kontrollgruppen (P 0,05).
TMZ induserer p21 nivåer via p53 pathway
For å avgjøre om TMZ aktiverer p53 /p21 sti og om NSC666715 viser noen effekt på denne veien, behandlet vi HCT116-celler med TMZ alene eller i kombinasjon med NSC666715. Resultatene viste en signifikant økning i både p53 og p21 nivåer etter TMZ-behandling alene (figur 4A og 4B, sammenlign spor 1 med 2). Behandling med NSC666715 alene hadde ingen effekt på p53-nivåer, men p21 nivåene øket (figur 4A og 4B, sammenlign spor 1 med 3). Dette tyder på at NSC666715 kan kreve svært lite p53 aktivitet for p21-aktivering, eller indusere p21 gjennom en p53-uavhengig mekanisme. Kombinasjonen av TMZ og NSC666715 økt p53 og p21 nivåer, men i en lignende grad som deres individuelle behandlinger (figur 4A og 4B, sammenlign spor 1-4).
HCT116-celler ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av PFTα og 50 uM NSC666715 i 2 timer og deretter med 500 pM TMZ alene eller i kombinasjon i ytterligere 48 timer. Cellene ble høstet, og cellulære lysater ble fremstilt og bearbeidet for Western blot-analyse. Panel A viser immunoblot av p53, p21, GAPDH og p-aktin-proteiner. Panel B er kvantitativ representasjon av p53 og p21 proteinnivåer etter normalisering med GAPDH. Felt 1 viser p53 og p21 proteinnivåer fra den ubehandlede kontrollgruppen og i felt 2 og 3 etter behandling med 50 og 500 uM NSC666715 og strålebehandling, respektivt. Resultatene i Lane fire er fra kombinasjonsbehandling med 50 mikrometer NSC666715 og 500 mikrometer TMZ. Resultater i Lane fem er fra kombinasjonsbehandling med 50 mikrometer NSC666715 og 30 mikrometer PTFα. Resultater i baner 6-8 viser p53 og p21 nivåer etter behandling med 10, 20 og 30 uM PFTα, henholdsvis. Resultatene i kolonnene 9-11 og 12-14 er fra kombinasjonsbehandling med enten 500 uM TMZ og 10, 20 og 30 uM PFT, eller henholdsvis med 50 uM NSC666715, 500 uM TMZ og 10, 20 og 30 uM PFT,. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SE av tre forskjellige eksperimenter. * Og
# = Signifikant forskjellig fra ubehandlet kontroll (P 0,05).
For ytterligere å forstå om økningen i p21 nivåer etter TMZ og NSC666715 behandling var p53-avhengige, vi bestemt p53 og p21 nivåene i HCT116-celler (som inneholdt vill-type p53 og p21) og HCT116 (p53
– /-) celler (p53-knockout og villtype p21) med TMZ alene eller i kombinasjon med NSC666715. Resultatene viste en signifikant økning i både p53 og p21 nivåer etter TMZ-behandling alene (figur 4A og 4B, sammenlign spor 1 med 2) i HCT116-celler. For å undersøke hvorvidt den TMZ-mediert økning i p21-nivå ble forårsaket av p53, behandlet vi HCT116 (p53
– /-) celler med TMZ og bestemmes p21 nivåer. Resultatene viste ingen økning i p21 i HCT116 (p53
– /-) celler etter TMZ behandling, noe som tyder på at funksjonell p53 er nødvendig for p21 induksjon (fig 4A). For ytterligere å bekrefte dette, vi pre-behandlet HCT116-celler med pifithrin-α (PFTα), en p53 inhibitor som nedregulerer
p21
genuttrykk [39], etterfulgt av behandling med TMZ. Resultatene viste at behandling med PFTα alene i HCT116-celler stabilisert p53 og p21 reduserte nivåer samtidig p21 i HCT116 (p53
– /-) celler forble upåvirket (figur 4A, sammenlign spor 6-8) indikerer at p53 er involvert i p21 regulering (figur 4A og 4B, sammenlign spor 6-8). PFTα også redusert p21 nivåer på en doseavhengig måte etter behandling med TMZ alene eller i kombinasjon med NSC666715 (figur 4A og 4B, sammenlign spor 9-11 og 12-14, respektivt). PFTα og NSC666715 behandlede celler viste akkumulering av p53 og p21 proteiner (fig 4A og 4B, kjørefelt 5), noe som tyder på at NSC666715 kan også kreve at p53 /p21 veien for sin aktivitet.
TMZ-behandlede HCT116-celler som er arrestert i S-fasen av cellesyklus er utgitt av PFTα behandling
Vi adressert rollen p53 i cellesyklus arrest etter NSC666715 og TMZ behandling. Vi forhåndsbehandlet HCT116-celler med forskjellige konsentrasjoner av PFT-α fulgt av TMZ behandling for FACS-analyse. De FACS-analyse Resultatene viste en signifikant S-fase arrest av celler etter TMZ behandling, som ble redusert i nærvær av PFTα på en konsentrasjonsavhengig måte (tabell 1). Mens det ikke var noen effekt av NSC666715 behandling alene, PFTα behandling førte til en signifikant S-fase rest ved lavere konsentrasjoner. Men ved høyere PFTα konsentrasjoner ble cellene frigjort fra S-fase og samlet opp i G
1-fase. PFTα behandling reduserte S-fasen arrestasjonen av HCT116-celler etter behandling med TMZ eller i kombinasjon med NSC666715. PFTα og NSC666715 behandling sammen ikke hadde noen effekt på S-fase arrest. Akkumulering av celler i G
2 /M fase før apoptose begynte 48 timer etter behandling med enten TMZ alene eller i nærvær av NSC666715, men virkningen var ikke signifikant. Disse resultatene tyder på at TMZ induserer en S-fase cellesyklus-stans som involverer p53 signalveien, som kan bli opphevet ved PFTα. Men vi erkjenner at PFTα effekter kan skyldes både p53-avhengig og uavhengig mekanismer.
NSC666715 forbedrer TMZ-indusert senescence i HCT116 cellene
Først bestemmes vi enten TMZ kan indusere senescence i HCT116-celler. Resultatene viste en økning i SA-βgal flekker; en indikator av senescens, i TMZ-behandlede HCT116-celler (figur 5A og 5B). NSC666715 alene ikke signifikant induserer senescence i tykktarm kreft celler. Imidlertid NSC666715 i kombinasjon med TMZ utløst og økt hyppighet av senescens forbindelse β-gal-positive celler på en doseavhengig måte og fortsatte å vise statistisk signifikant økning i begynnende alderdom. Tilsetning av TMZ til cellene resulterte i en 36%, 48%, 60%, 64% og 60% induksjon av senescens (figur 6A og 6B). Disse resultatene korrelerer med en NSC666715-mediert økning i akkumuleringen av AP områder og økt p53 /p21-aktivitet med forbedret begynnende alderdom i TMZ-behandlede HCT116-celler.
HCT116-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TMZ i 48 timer og deretter bearbeidet for SA-βgal farging. Panel A viser SA-βgal farging. Panel B representerer en kvantitativ analyse av SA-βgal farging. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE av fire ulike beregninger. * = Signifikant forskjellig fra ubehandlet kontrollgruppe (p 0,05).
HCT116-celler ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av NSC666715 i 2 timer fulgt av behandling med 250 uM av TMZ i ytterligere 48 timer. Etter behandling ble cellene behandlet for SA-βgal farging. Panel A viser SA-βgal farging. Panel B representerer en kvantitativ analyse av SA-β gal farging. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE av fire ulike beregninger. * Og
# = Signifikant forskjellig fra den ubehandlede kontroll eller 10, 25, 50 og 100 uM NSC666715 behandlede gruppene, henholdsvis (p 0,05).
TMZ-indusert senescens er p53 /p21 avhengige
Etter behandling av
p53 Hotell og
p21
genet knockout HCT116 (p53
– /-) og HCT116 (p21
– /-) cellelinjer [25, 40] med 500 pM av TMZ i 48 timer, ble det observert en sterk økning i SA-βgal farging i HCT116-celler, og markert lavere flekker både i HCT116 (p53
– /-) og HCT116 ( p21
– /-) cellelinjer (figur 7A og 7B). Disse resultater antyder at p53-avhengig p21-aktivering er nødvendig for TMZ-indusert senescens i HCT116-celler.
HCT116-celler med eller uten p53 og p21 ekspresjon ble behandlet med 500 uM TMZ i 48 timer, og deretter bearbeidet for SA -βgal farging. Panel A viser involvering av p53 og p21 i TMZ-indusert alderdom. Panel B representerer kvantitativ analyse av de data som er presentert som gjennomsnitt ± SE av fire ulike beregninger. * = Signifikant forskjellig fra ubehandlet kontroll (p 0,05).
PFTα blokker TMZ-indusert senescence i HCT116-celler med eller uten NSC666715 behandling
For ytterligere å fastslå at den forbedrede senescence i HCT116 etter behandling med TMZ alene eller i kombinasjon med NSC666715 krever at p53 /p21 vei, undersøkte vi SA-βgal farging i HCT116-celler behandlet med PFTα, NSC666715 og strålebehandling alene eller i kombinasjoner (figur 8A og 8B). Behandlingsbetingelsene var de samme som i eksperimentene ovenfor. Behandling med NSC666715 og PFTα alene viste ingen økning i SA-βgal farging (figur 8A [AIII] og 8A [b]) sammenlignet med kontroll (figur 8A [ai]). PFTα behandling redusert TMZ-indusert SA-βgal farging av HCT116-celler på en doseavhengig måte (sammenlign figur 8A [Aii] med 8A [c]). Videre styrking av SA-βgal flekker etter TMZ og NSC666715 kombinasjonsbehandling ble også redusert når HCT116-celler ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av PFTα (sammenlign figur 8A [AIV] med 8A [d]). Disse resultatene ytterligere etablerte rollen som p53 /p21 bane i TMZ-indusert senescens i HCT116-celler, og dette indikerer at NSC666715-mediert signalisering BER er avhengig av p53 /p21 svei.
HCT116-celler ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner PFTα (10-30 mm) og /eller 50 uM av NSC666715 i 2 timer etterfulgt av behandling med 500 uM TMZ i ytterligere 48 timer. Panel A viser SA-βgal farging av cellene. Panel B representerer en kvantitativ analyse av antall SA-βgal positive celler. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE av fire ulike beregninger.
¶ = vesentlig annerledes enn den ubehandlede kontroll (p 0,05).
# = Signifikant forskjellig enn 50 mikrometer NSC666715 alene behandlede gruppen (p 0,05).
§ og
§§ = Signifikant forskjellig fra 10 og 20 uM PFTα alene behandlede grupper, henholdsvis, (p 0,05). *, ** Og *** = Betydelig annerledes enn 500 mikrometer TMZ i kombinasjon med 10, 20 og 30 mikrometer PFTα behandlede grupper, henholdsvis (p 0,05).
TMZ-indusert senescence
