Abstract
Bakgrunn
Anti-mitotiske forbindelser (mikrotubulidynamikk de-stabilisatorer) som vinkristin og vinblastin har vist kliniske suksess i behandling av ulike kreftformer. Men utvikling av resistens celler begrenser deres efficacies i kliniske situasjoner. Derfor ble eksperimenter utført for å bestemme mulige medikament resistensmekanismer knyttet til anvendelsen av anti-mitotisk cancerterapi.
Hoveddeler
A KB-avledet mikrotubul-de-stabilisator-resistente KB-
L30
cancercellelinje ble generert for denne studien. KB-
L30
celler viste kryssresistens overfor ulike mikrotubulidynamikk de-stabilisatorer inkludert BPR0L075, vinkristin og kolkisin gjennom flere resistent (MDR)-Uavhengig mekanismer. Overraskende, KB-
L30
celler viste hypersensitivitet til microtubuli-stabilisator, paclitaxel. Resultatene av RT-PCR-analyse viste at ekspresjon av både klasse II og III β-tubulin ble nedregulert i KB-
L30
celler sammenlignet med dens paren KB-kreftceller. I tillegg er DNA-sekvensanalyse viste seks nye mutasjon områder som er tilstede i exon fire av de βI-tubulin-genet. Computational modellering indikerte at en direkte sammenheng mellom βI-tubulin mutasjoner og endringer i microtubule montering og dynamisk ustabilitet i KB-
L30
celler og dette spådd modellen ble støttet av en økt microtubule montering og redusert microtubule dynamisk ustabilitet i KB-
L30
celler, som vist ved Western blot analyse.
Konklusjoner og Betydning
Vår studie viste at disse nye mutasjoner i ekson fire av βI-tubulin indusert motstand mikrotubul til de-stabilisatorer og hypersensitivitet til mikrotubul stabilisatoren gjennom en endring i sammenstillingen mikrotubuli og dynamikk i kreftceller. Viktigere, denne studien viser at kreftceller kan erverve resistens evne til anti-mitotiske forbindelser gjennom flere endringer i mikrotubulidynamikk nettverk. Denne studien videre forsynt molekyl informasjon i medikamentseleksjon for pasienter med spesifikke tubulin mutasjoner
relasjon:. Cheung CHA, Wu S-Y, Lee T-R, Chang C-Y, Wu J-S, Hsieh H-P, et al. (2010) Kreftceller Acquire Mitotiske resistens Properties Gjennom Beta I-Tubulin Mutasjoner og endringer i uttrykket av Beta-Tubulin isotyper. PLoS ONE 5 (9): e12564. doi: 10,1371 /journal.pone.0012564
Redaktør: Wen-Liang Zhou, Sun Yat-Sen University, Kina
mottatt: 21 juni 2010; Godkjent: 12 august 2010; Publisert: 3. september 2010
Copyright: © 2010 Cheung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av egenutført tilskudd NSC98-3114-M-006-002 og NSC98-2323-B-400-004 fra National Science Council, Taiwan, Kina, DOH99-TD-C-111-004 fra Department of Health , Taiwan, Kina og CA-097-PP-02 fra National Health Research Institutes, Taiwan, Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikrotubuli er proteinfilamenter av cytoskjelettet består av α-tubulin og p-tubulin molekyler. I celler, mikrotubul filamenter hurtig vekslende mellom faser av vekst og krymping (dynamisk ustabilitet) i løpet av cellesyklusen [1]. Siden mikrotubuli spiller avgjørende roller i regulering av den mitotiske apparatur, kan avbrudd av mikrotubuli indusere cellesyklusarrest i M fase, dannelsen av unormale mitotiske spindler, og til slutt aktivering av signaler for apoptose. Oppdagelsen av at den cytotoksiske aktivitet av forskjellige forbindelser er gjennom påvirkning av mitotisk spindel apparatet har fått mye oppmerksomhet i løpet av de siste to tiårene, og mikrotubuli har blitt et attraktivt farmakologisk mål for kreft medisiner. Anti-mitotiske forbindelser så som vinkristin, vinblastin (mikrotubuli-destabiliserende
Vinca alkaloid
) og paclitaxel (mikrotubulus-stabiliserende taksan) er blitt utviklet for å målrette mot kreft klinisk [2], [3]. Selv om taxaner og
Vinca alkaloider
er effektive for behandling av forskjellige maligniteter, er deres potensial begrenset av utviklingen av multimedikamentresistens (MDR) [4], [5]. MDR er flere faktorer, med en vei som fører til resistens mediert av over-ekspresjon av transmembran efflukspumper, nemlig
M
r 170000 P-glykoprotein (P-gp170 /MDR) og multimedikamentresistens proteinet (MRP) [5], [6]. Foruten ekspresjon av MDR, har tilleggsmekanismer for motstand mot anti-mitotiske midler også blitt beskrevet tidligere. Disse omfatter endringer i tubulin isotype uttrykk og mutasjoner i genet tubulin [7], [8]. Celler som inneholder mutasjoner som D45Y, S172A, D197N, D224N, S234N, L240I og K350N i klasse I beta-tubulin er funnet resistente mot kolkisin og
Vinca
alkaloid [7]. På den annen side har celler som inneholder mutasjoner som P173A, Q292E og Y422C i klasse I beta-tubulin blitt funnet å være resistent til epotilon (mikrotubul-stabiliserende middel) [9]. Interessant, over-ekspresjon av SIII-tubulin er vist i paclitaxel-resistente celler [10], [11], [12]. Imidlertid er kombinerte endringer (vekslinger i i tubulin isotype ekspresjon og mutasjoner i β-tubulin-genet) i de mikrotubul nettverkene sjelden demonstrert i de anti-mitotiske medikamentresistenskreftceller.
I denne studien ble en microtubule de -stabilizer-resistent cancercellelinje ble brukt for å undersøke nye endringer som er tilstede i cellene som var i stand til å indusere resistens overfor anti-mitotiske forbindelser. KB-
L30
er en KB-avledet BPR0L075 (microtubule de-stabilisator) motstandsdyktig kreftcellelinje. Vår publiserte studie viste at KB-
L30
celler over-uttrykte Survivin, som fører til stabilisering av mikrotubul-nettverk og som resulterer i motstand mot mikrotubul de stabiliserende forbindelsene [13]. Imidlertid, nedregulering av Survivin bare delvis gjenopprettet den medikamentsensitivitet til mikrotubul-de-stabilisatorer kolkisin og BPR0L075, noe som tyder på at ytterligere resistent mekanisme er til stede i denne cellelinjen [13]. Her undersøkte vi flere mekanismer som kan være ansvarlig for resistens til mikrotubulidynamikk de-stabilisatorer i KB-
L30
celler.
Resultater
KB-
L30
celler viser resistens til mikrotubulidynamikk de-stabilisatorer og hyper-følsomhet for microtubule stabilisator
En KB-avledet BPR0L075-resistente kreftcellelinje, KB-
L30
ble generert i vårt laboratorium. I korte trekk, KB-
L30
var en monoklonal cellelinje som er valgt for resistens ved kontinuerlig eksponering av den parenkreftcellelinje, KB, for økende konsentrasjoner av mikrotubuli de-stabiliserende forbindelse, BPR0L075. KB-
L30
celler dyrkes i medium med 30 nm BPR0L075 å opprettholde sin resistent kjennetegn. Denne spesifikke medikament-resistent cancercellelinje er seks ganger mer motstandsdyktige mot BPR0L075 i forhold til dets parentale celler (Tabell 1) (figur 1A). I tillegg KB-
L30
celler utviser kryssresistens med en annen mikrotubul de-stabiliseringsmidler, colchicin (7-ganger resistent) og vinkristin (7-ganger resistent) (tabell 1) (figur 1 B og C) . Overraskende nok er dette multiresistent kreft cellelinje fem ganger mer sensitive til microtubule stabiliseringsmiddel paclitaxel som sammenlignet med KB-celler (tabell 1) (figur 1D).
KB og KB-
L30
celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BPR0L075 (A), colchicin (B), vinkristin (C) og paclitaxel (D) i 3 dager og cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse av cellenes levedyktighet.
Multiple resistent protein (MDR) er ikke tilstede i KB-
L30
celler
Forrige studien viste at microtubule de-stabilisere forbindelsen BPR0L075 var like effektive i begge MDR /MRP negative og positive kreftceller [14], indirekte antyder at BPR0L075-motstand KB-
L30
celler utvise resistensegenskaper MDR /MRP-uavhengig mekanisme. For å støtte den ovennevnte funn ytterligere, ble RT-PCR utført for å bestemme hvorvidt KB-
L30
celler over-uttrykte MDR-1. RT-PCR-analyse viste at verken KB eller KB-
L30
celler uttrykker MDR-1 (figur 2A). I motsetning til dette ble MDR-1 uttrykt i vincristin-resistent cancercellelinje, KB-VIN10 (positiv kontroll) (figur 2A). Videre er resultatene fra den kvantitative real-time PCR avslørte at en annen viktig medikament efflukspumpen, MPR-1, var ikke overuttrykt i KB-
L30
celler sammenlignet med dens paren KB-celler (figur 2B). I motsetning til dette, MRP-1 ble overuttrykt i den positive kontrollcellelinje, KB-20a (figur 2B). Samlet utgjør disse resultatene antydet at KB-
L30
celler indusert motstand mot mikrotubulidynamikk de-stabilisatorer gjennom MDR-uavhengige mekanismer.
uttrykk for MDR-1 i KB, KB-
L30
og KB-VIN10-celler ble analysert ved RT-PCR (A). Uttrykket av MRP-en i KB, KB-
L30 Hotell og KB-20a celler ble analysert ved real-time PCR (B). GAPDH ble brukt som en intern kontroll i både RT-PCR og Real Time PCR-analyser.
KB-
L30
celler viser endringer i beta tubulin isotype uttrykk
siden KB-
L30
celler indusert BPR0L075 og cochicine-motstand gjennom MDR /MRP-uavhengig mekanisme, har andre legemiddelresistensmekanismer blitt undersøkt. Det har blitt mye vist at endringer i ekspresjonen av p-tubulin-isotyper på mRNA-nivå er knyttet til induksjonen mitotiske legemiddelresistens i cancerceller [15], [16]. Her uttrykk for p-tubulin isotypes i KB og KB-
L30
celler ble analysert ved RT-PCR. På mRNA-nivå, ble ekspresjonen av klasse II og III β-tubulin isotyper redusert i KB-
L30
celler sammenlignet med de mikrotubul de-stabilisatorer sensitive KB-celler (figur 3A). Mengden av klasse II og III beta-tubulin isotyper uttrykt i KB-
L30
celler ble redusert med 35% og 40% i forhold til sine foreldre celler. I motsetning til dette var det ingen signifikant forskjell i ekspresjonen av klasse I, IV
a og IV
b p-tubulin-isotyper mellom de to cellelinjer (figur 3A).
Ekspresjon av forskjellig β-tubulin isotypes i KB og KB-
L30
celler ble analysert ved RT-PCR. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll (A). RT-PCR og nestet-PCR analyser av eksoner 1, 2, 3 og 4 i klasse III β-tubulin genet av KB og KB-
L30
celler. Først kjørefelt, KB-celler og andre kjørefelt, KB-
L30
celler (B). PCR-SSCP analyser av eksoner 1, 2, 3 og 4 i klasse III β-tubulin genet av KB og KB-
L30
celler. Første kjørefelt, KB celler og andre kjørefelt, KB-
L30
celler (C).
KB-
L30
celler stille flere mutasjoner i ekson fire av βI-tubulin-genet
bidraget av p-tubulin punktmutasjoner i indusering av medikamentresistens til en rekke anti-mitotiske forbindelsene ble også beskrevet tidligere [7], [8], [17]. Siden klasse I p-tubulin representerer ~90% av den totale intracellulære i celler, gensekvensen av βI-tubulin av KB-
L30
-celler ble analysert. Først ble RT-PCR utført for å bestemme om noen stor skala sekvens innskudd eller delesjon var tilstede i exon 1, 2, 3 og 4 av den βI-tubulin-genet fra KB-
L30
celler. Resultater av RT-PCR og gelelektroforese viste ingen signifikante forskjeller i molekylstørrelsen (lengden) av noen av eksoner av βI-tubulin gen mellom KB-
L30 Hotell og KB celler (Figur 3B). Dette resultatet viste at stor skala sekvens innsetting eller sletting var ikke til stede i βI-tubulin genet av KB-
L30
celler. Vi videre bestemmes tilstedeværelsen av enkelt punkt mutasjon i KB-
L30
celler ved å utføre Single-strand Konformasjon Polymorphism (SSCP) analyse. SSCP er den elektroforetiske separasjon av enkelt-trådede nukleinsyrer basert på små forskjeller i sekvens (ofte et enkelt basepar), som resulterer i en annerledes sekundærstruktur og en målbar forskjell i mobilitet gjennom en gel. Her er resultatene av SSCP-analyse av βI-tubulin genomisk DNA viste ingen mobilitet bånd forskyvning av ekson 1, 2 og 3 av KB-
L30
, sammenlignet med den for KB-celler (Figur 3C). Overraskende, SSCP analyse avdekket et mønster skifte i exon 4 av βI-tubulin i KB-
L30
celler.
DNA-sekvensering ble utført for å re-bekrefte resultatene over. I samsvar med resultatene fra både RT-PCR og SSCP-analyse, DNA-sekvensering av βI-tubulin av KB-
L30
-celler viste ingen mutasjoner til stede i sin ekson 1, 2 og 3 regioner (data ikke vist). Interessant, DNA-sekvensering avslørt flere mutasjoner stede i exon 4 av βI-tubulin av KB-
L30
celler. Sekvenseringsdata er resultater av minst to eksperimenter. Seks punktmutasjoner ble funnet ved nukleotid 947 fra T til A (forstand), 1114 fra A til T, 1145 fra C til T, 1213 fra G til A, 1294 fra G til A og 1310 fra G til T (Figur 4A). Disse mutasjonene svarer til aminosyre-mutasjoner V316D, T372S, S382L, E405K, E432K og G437K (figur 4B).
DNA sekvensering av βI-tubulin genomisk DNA viser seks punktmutasjoner er tilstede i exon 4 (A) . Oversatt amino-syresekvensen av den muterte exon 4 av den βI-tubulin-gen (B). Uttrykket av det muterte βI-tubulin protein og dens inkorporering i mikrotubulidynamikk nettverk ble avslørt av immun-fluorescerende mikroskopi. Celler ble probet med anti-βI-tubulin-antistoff (C). Transfeksjon av det muterte βI-tubulin-genet inn i KB-cellene reduserte medikamentsensitivitet til BPR0L075 in vitro (D).
Immunofluorescence farging ble utført for å bestemme hvorvidt det muterte βI-tubulin-genet ble føre til proteiner som ble senere innlemmet i mikrotubulidynamikk nettverk i KB-
L30
celler. KB-
L30
celler ble farget med anti-βI-tubulin antistoff og FITC-konjugert sekundært antistoff. Resultatene av immunfluorescens-mikroskopi viste at det muterte βI-tubulin-protein var til stede som en del av de mikrotubul nettverk (figur 4C). For å demonstrere at tubulin mutasjoner var faktisk ansvarlig for å forårsake at BPR0L075-resistent fenotype, gen transfeksjon og over-ekspresjon av βI-tubulin mutant som inneholder de ovennevnte mutasjoner ble utført i KB-celler. MTT celleviabilitet analyse avslørte at KB-celler transfektert med den muterte βI-tubulin viste økt motstand mot BPR0L075 (IC
50 11 nM) sammenlignet med celler transfektert med kontroll tomme plasmidet (IC
50 7 nM) og villtype βI-tubulin (IC
50 7 nM) (figur 4D). Dermed uttrykk for det muterte βI-tubulin fikk spille en rolle i narkotika følsomhet for BPR0L075 i KB-celler.
Computer modelleringsstudier for βI-tubulin mutasjoner i BPR0L075 motstand
Tubulin mutasjoner kan være assosiert med enten endret narkotika-bindingssetet eller endringer i microtubule stabilitet. Her ble beregningsorientert modellering ansatt for å gi strukturelle innsikt. Den tredimensjonale struktur tubulin (PDB-kode: 1SA0) ble anvendt [18], og programmet Discovery Studio 2,1 (Accelrys, Inc) ble påført for å bygge modellen ved å mutere rester og utføre energi minimalisering. I denne modellen, V318D rest (tilsvarende V316D i KB-
L30
) ligger i kolkisin-bindingssetet på βI-tubulin (figur 5A). Val318 (villtype) dannet hydrofobe interaksjoner med kolkisin. Imidlertid, den muterte resten (V mutert til D) forskyvninger bort fra kolkisin til å danne en hydrogenbinding med rest R320, noe som resulterer i tap av hydrofob interaksjon med kolkisin (figur 5A) i modelleringen studien. Dette resultatet indikerer at V318D kan svekke bindingsaffiniteten kolkisin p-tubulin. På den annen side, mutasjoner av rest 392 (lokalisert i Helix 11) og aminosyrerest 382 (som befinner seg i sløyfen i nærheten av Helix 11) endrer konformasjonen til Helix 11, som kan øke de langsgående interaksjoner og dermed endre stabiliteten av mikrotubuli (figur 5B ) [19]. E415K (tilsvarende E405K i KB-
L30
) ligger i H11-H12-regionen nær dimer grensesnitt som er involvert i langsgående kontakter. Rest 415, fra mutert til Lys Glu, bryter hydrogen-bindingen interaksjoner med rest K402 og følgelig fører til bevegelse av K402 nærmere α-tubulin. Skiftet av K402 rest (figur 5C) fører til tett kontakt med rester? V260, Y262 og W346 i α-tubulin, øke samspillet mellom β-tubulin og α-tubulin. Helix 11 er plassert i grenseflaten av α-tubulin, og tubulin β-dimer. I konklusjonen, indikerer beregningsorientert modellering studie som tubulin mutasjoner i KB-
L30
celler kan øke microtubule montering og stabilitet.
KB-
L30
celler få økte microtubule montering og reduserte mikrotubulidynamikk
for å finne ut om stabilitet og dynamikk microtubule i KB-
L30
celler ble påvirket av mutasjoner i βI-tubulin som betinget av matematisk analyse, Western blot analyse ble utført. Her, Western blot-analyse avslørte at mengden både α- og β-tubulin pellets som er tilstede i KB-
L30
celler ble øket sammenlignet med dens paren KB-celler (figur 6A). I motsetning til den løselige form av β-tubulin til stede i KB-
L30
celler ble redusert sammenlignet med den for KB-celler (figur 6A). Immunfluorescens farging ble også brukt til å støtte den ovennevnte resultat ytterligere. Mikrotubuli ble merket med rodamine-konjugert anti-β-tubulin-antistoff og cellene ble sett på under mikroskop. KB-
L30
cellene ser ut til å ha høyere microtubule innhold i forhold til KB celler (Figur 6b). I tillegg er bruken av mikrotubuli de-stabilisator, BPR0L075, var i stand til å redusere mikrotubul innholdet i KB-
L30
celler (Figur 6B). Til sammen våre resultater antydet at KB-
L30
celler viste økt microtubule montering.
Hvor mye løselig og uløselig α- og β-tubulin i KB og KB-
L30
-celler ble analysert ved Western blotting. Aktin ble anvendt som en laste kontroll (A). Integriteten mikrotubulidynamikk nettverk i KB og KB-
L30
celler ble vist ved immun-fluorescerende mikroskopi. Celler ble probet med anti-β-tubulin-antistoff (B). Mikrotubul-dynamikk i celler ble analysert ved hjelp av western blot-analyse. Acetylert-α-tubulin ble anvendt som en indirekte indikator på mikrotubul-dynamikk og mengden av acetylert-α-tubulin ble analysert i BPR0L075 og paciltaxel-behandlede KB-celler ved Western blotting. Alfa-tubulin (total form) ble anvendt som laste- kontroll (C). Mengden av endogent acetylert-α-tubulin i KB og KB-
L30
-celler ble analysert ved Western blotting. Alpha-tubulin (total form) ble brukt som lastekontroll (D).
microtubule dynamisk ustabilitet preges av brå stokastiske overganger mellom faser av forlengelse og forkorting. På molekylært nivå, økes α-tubulin acetylering ansett for å være en markør for den reduserte dynamiske av mikrotubuli. Her, Western blot-analyse avslørte at mengden av acetylert α-tubulin ble redusert i BPR0L075-inkubert KB-celler i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 6C). I motsetning til dette, ble mengden av acetylert α-tubulin økt i paclitaxel-inkubert celler (figur 6C). Mikrotubuli-de-stabilisator ble funnet å fungere i å indusere mikrotubul dynamisk ustabilitet og mikrotubuli-stabilisator ble funnet å virke for å redusere mikrotubul dynamisk ustabilitet [20], [21]. Således kan mengden av acetylerte α-tubulin til stede i celler være relatert til følsomheten av celler til forskjellige anti-mitotiske forbindelser. For å bestemme hvorvidt KB-
L30
celler oppviste redusert mikrotubul-dynamikk, Western blot-analyse ble benyttet for å bestemme nivået av α-tubulin acetylering til stede i de medikamentresistente celler. Her, Western blot-analyse avslørte at mengden av acetylerte α-tubulin ble øket i KB-
L30
celler, sammenlignet med KB-celler (figur 6D). I samsvar med den spådommen fra beregningsmodell, våre resultater viser at KB-
L30
celler utstilt både forbedret microtubule stabilisering og reduserte mikrotubulidynamikk. Videre våre data tyder på at den endring av mikrotubuli stabilitet og dynamisk i KB-
L30
celler kan være forårsaket av tilstedeværelse av muterte βI-tubulin, noe som resulterer i at motstanden mot mikrotubul-de-stabilisatorer og hyperfølsomhet mikrotubulidynamikk stabilisatorer.
Diskusjoner
Anti-mitotiske forbindelser har blitt vist vellykket i behandling av ulike kreftformer. Men utvikling av resistens celler begrenser deres efficacies i kliniske situasjoner. Derfor er det viktig å bestemme mulig legemiddelresistensmekanismen relatert til anvendelsen av anti-mitotisk kreftterapi. Positiv korrelasjon mellom ekspresjonen av multimedikamentresistens proteiner MDR-1, MRP-1 og induksjon av legemiddelresistens til anti-mitotiske forbindelser kreft har blitt mye rapportert tidligere [4], [5]. Imidlertid er medikamentresistens til anti-mitotiske forbindelser i kreftceller antas å skyldes flere faktorer. Her viste vi at BPR0L075 bestandig KB-
L30
celler ikke uttrykker MDR-1 og MRP-en. Viktigere, denne studien identifiserer nye områder av mutasjon i ekson 4 av βI-tubulin som er i stand til å fremkalle både legemiddelresistens til mikrotubulidynamikk de-stabilisatorer og hyper-følsomhet for mikrotubulidynamikk-stabilisatorer gjennom både endringer i narkotika-bindingssetet og microtubule stabilitet.
De BPR0L075-resistente KB-
L30
celler brukt i denne studien ser ut til å erverve resistente egenskaper gjennom MDR /MRP-uavhengige mekanismer. For det første, KB-
L30
celler ikke uttrykker to av de vanligste legemiddel efflukspumper, MDR-1 og MRP-en. I tillegg, i motsetning til tradisjonelle mikrotubul-inhibitorer så som vinkristin og paclitaxel, er BPR0L075 effektiv i å undertrykke cellevekst både MDR /MRP-positive og -negative tumorcellelinjer [14].
In vivo
, BPR0L075 viste potent aktivitet mot veksten av xenografttumorer av gastrisk karsinom MKN-45, human cervical carcinoma KB, og KB-avledet P-gp170 /MDR -overexpressing KB-VIN10 celler i nakne mus [14]. Men BPR0L075 var ineffektive i å indusere død KB-
L30
celler i denne studien. Derfor vår studie indikerte at MDR /MRP ikke spille en viktig rolle i motstanden mot mikrotubulidynamikk de-stabilisatorer som BPR0L075, kolkisin og vinkristin i KB-
L30
celler.
Siden MDR og MRP ikke spille en viktig rolle i induksjon av legemiddelresistens i KB-
L30
celler, andre medikament resistensmekanismer må være tilstede i cellene. Tubulin-bindende forbindelser, så som vinkristin, colchicin og paclitaxel, hemme utviklingen av celle mitosen gjennom inhibering av den dynamiske dannelsen av den mitotiske spindel under G
2 /M-fasen. Derfor er mutasjoner i medikamentmål, tubulin, kan forstyrre effektiviteten til anti-mitotiske forbindelser. Faktisk har mutasjoner i både α- og β-tubulin i kinesisk hamster-ovarieceller blitt vist å føre til resistens mot colchicin og vinblastin [8]. Videre mutasjoner i β-tubulin i eggstokkreft celler har vist seg å føre til resistens mot taxaner epotilon og [22]. I denne studien ble seks nye mutasjonssider funnet tilstede i βI-tubulin genet av KB-
L30
celler. Disse mutasjonene tilsvarer aminosyre-mutasjoner V316D, T372S, S382L, E405K, E432K og G437K. Disse mutasjons områdene er presentert i ekson fire regioner i stedet for exon én, to og tre som tidligere er blitt identifisert [7]. Dette er særlig viktig som mutasjoner i exon fire i å forårsake anti-mitotisk medikamentresistens blir mindre demonstrert i forhold til exon 1, 2 og 3. I denne studien, over-ekspresjon av de mutante tubulins (inneholdt flere muterte-sites) i KB-cellene reduserte medikamentsensitivitet til de mikrotubul-stabiliserende forbindelse BPR0L075 sammenlignet med celler transfektert med tom vektor eller villtype-tubulin. De små forskjellene mellom celler transfektert med mutert-tubulin, og tubulin villtype var sannsynligvis på grunn av den store mengden av endogent uttrykte villtype-tubulin til stede i de transfekterte cellene KB. Transfeksjon av konstruksjoner som inneholder β-tubulin med forskjellig enkelt sete-mutasjon i KB-cellene ble også utført for å bestemme hvorvidt et bestemt område enkelt mutasjon i genet var faktisk nok til å forårsake resistens til BPR0L075 (data ikke vist). Men resultatene fra vår studie viste ingen signifikant forskjell i stoffet følsomhet mellom celler transfektert med mutant (enkelt område mutasjon) og hvete βI-tubulin (data ikke vist). Dette resultatet kan muligens forklares med følgende: 1) mutasjons nettstedene ble ikke direkte plassert på den spesifikke stoffet bindingsseter og 2) den tredimensjonale strukturen av βI-tubulin ble ikke signifikant endret av noen enkelt nettsted mutasjon som ble avslørt i denne studere. I stedet kan alle seks mutasjoner stede på exon 4 sammen bidra til endring av βI-tubulin tre dimensjonale strukturer, noe som resulterer i endringer av narkotika følsomhet i KB-
L30
celler.
Med bruk av beregnings modellering, ble de mutante regionene i beregningsmodell som vi forutsagt analysert for å sammenligne med økning eller reduksjon av interaksjonene før og etter mutasjoner. I vår modell, ble plasseringen av βI-tubulin mutasjoner identifisert og de resulterende conformation endringer i βI-tubulin protein ble betinget med potensielle virkninger på microtubule montering og stabilitet. Etter avtale med beregningsmodell, ble det observert økt tubulin polymer nivåer i BPR0L075 bestandig KB-
L30
celler i forhold til sine narkotika-sensitive foreldre celler (Figur 6A og 6B). I tillegg ble nivået av acetylerte α-tubulin også øket i KB-
L30
celler (figur 6D), noe som indikerer at redusert mikrotubulus dynamisk ustabilitet var til stede i denne spesifikke cellelinje. En rolle for endrede mikrotubulus polymernivå i vinkristin motstand av akutt lymfatisk leukemi har blitt demonstrert
in vivo
tidligere [23]. I tillegg ble en vincristin-resistent xenograft med høyt innhold av polymerisert tubulin vist seg forholdsvis sensitivt for mikrotubuli-polymerisering av medikament paclitaxel [23]. Videre, en studie rapporterte også at den dynamiske ustabilitet av mikrotubuli av paclitaxel-resistent A549-T12 cancerceller var signifikant økt sammenlignet med dens parentale celler [24]. Dermed forbedret microtubule polymerisasjon og redusert dynamisk ustabilitet forårsaket av tubulin mutasjoner kan representere en overlevelsesmekanisme mot mikrotubulidynamikk de-stabiliserende forbindelser. På den annen side kan den forbedrede mikrotubuli-polymerisering og redusert dynamisk ustabilitet forbedre effektiviteten av mikrotubul-stabiliserende forbindelser slik som paclitaxel. Faktisk vår publisert studie viste at nedregulering av survivin (IAP) indusert microtubule de-polymerisasjon, som resulterer i økt narkotika følsomheten KB celler til kolkisin og BPR0L075 [13]. I tillegg er den samme behandling delvis gjenopprettet følsomhet av KB-
L30
celler til BPR0L075 gjennom prosessen med mikrotubuli de-polymerisasjon [13]. Imidlertid, nedregulering av Survivin ikke påvirker aktiviteten av caspaser [13]. Samlet utgjør disse resultatene indikerte at balansen mellom polymerisert og ikke-polymerisert tubulin kan være en viktig faktor for respons på anti-mitotisk kjemoterapi.
Det er også verdt å merke seg at nedregulering av βII- og SIII-tubulin isotyper ble observert i KB-
L30
celler. Litteratur avslørt at over-ekspresjon av SIII-tubulin indusert paclitaxel- og docetaxel-motstand i kreftceller [7], [10], [16]. Høyt nivå av SIII-tubulin ekspresjon ble også vist å være forbundet med motstanden til paclitaxel og redusert overlevelse hos pasienter med karsinom [25]. Interessant, en fersk studie fra Tseng
et al.
Har gitt en mulig forklaring på dette fenomenet. Matematiske og beregningsmodeller av sin studie viser at microtubule de-stabiliseringsmidler, colchincine og dets derivater, fell sterkest til SIII-tubulin som sammenlignet med andre p-tubulin isotypes [26]. Således kan endringer i ekspresjonen av SIII-tubulin endre følsomheten for colchicin-derivater som inhiberer polymerisasjonen av mikrotubuli. Derfor kan nedregulering av SIII-tubulin også bidra til økt følsomhet for paclitaxel og redusert følsomhet for kolkisin /BPR0L075 i KB-
L30
celler.
I konklusjonen, vi viste at romanen mutasjoner i ekson 4 av βI-tubulin indusert motstand mot mikrotubulidynamikk de-stabilisatorer og hyper-følsomhet for microtubuli stabilisator gjennom endring i microtubule montering og dynamikk i kreftceller. Denne rapport indikerer videre at kreftceller kan endre stabiliteten og dynamikken i mikrotubul-nettverk gjennom flere mekanismer som for eksempel tubulin mutasjoner og differensial isotype uttrykk samtidig, noe som resulterer i motstandsdyktig mot anti-mitotisk kreftterapi. Resultatene av denne studien tilveiebringe molekyl informasjon i medikamentseleksjon for pasienter med spesifikke mutasjoner tubulin og også har viktige implikasjoner for utviklingen av fremtidige anti-mitotiske forbindelser som er i stand til å målrette medikamentresistente kreftceller. Likevel er ytterligere undersøkelser for å finne ut om disse spesifikke βI-tubulin mutasjoner kan bli funnet i kliniske prøver (etter behandling) og dens korrelasjon til resistens.
Materialer og metoder
Cellelinjer antistoffer og reagenser
Menneskelige munnhulekarsinomer celler (KB) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Denne spesifikke kreftcellelinje ble også beskrevet som en HeLa-forurensning ved ATCC. KB og KB-avledede KB-
L30
-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco, Grand Island, NY), supplert med 5% føtalt bovint serum, penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og L-glutamin (0,29 mg /ml), ved 37 ° C. Antistoffene anvendt i denne studien inkluderte: et mus anti-αtubulin antistoff (Upstate cellesignalisering, Lake Placid, NY), et muse-anti-βtubulin antistoff (BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ) og et muse anti-actin-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Etablering av KB-avledede BPR0L075-resistent cellelinje
menneskelige munn karcinomaceller (KB) ble dyrket i RPMI 1640 medium som tidligere beskrevet.
