Abstract
Porcupine (PORCN) er et membranbundet O-acyl transferase som er nødvendig for palmitoylation av Wnt proteiner, og det er viktig i ulike Wnt trasé for Wnt-Wntless (WLS) bindende, Wnt sekresjon, og Wnt signalaktivitet. Vi testet om PORCN var nødvendig for spredning av transformerte celler. Knockdown av PORCN ved flere uavhengige sirnas resulterer i en defekt cellevekst i en undergruppe av epiteliale kreftcellelinjer. Veksten feilen er transformasjon avhengig i menneskelige mammary epitelceller (HMEC) celler. I tillegg induserbar PORCN knockdown av to uavhengige shRNAs markant reduserer veksten av etablerte MDA-MB-231 krefttilfeller i ortotopiske transplantater i immunsvikt mus. Uventet, defekten spredning som følge av tap av PORCN forekommer i en Wnt-uavhengig måte, som det blir reddet ved re-ekspresjon av katalytisk inaktive PORCN, og blir ikke sett etter RNAi-mediert knockdown av Wnt bærerprotein WLS, og heller ikke etter behandling med PORCN inhibitor iwp. I samsvar med en rolle i en Wnt uavhengig vei, knockdown av PORCN regulerer et distinkt sett av gener som ikke endres av andre hemmere av Wnt signalering. PORCN protein ser dermed ut til Moonlight i en roman signalveien som er hastighetsbegrensende for kreftcellevekst og tumordannelse uavhengig av sin enzymatisk funksjon i Wnt biosyntese og sekresjon
Citation. Covey TM, Kaur S, Tan Ong T , Proffitt KD, Wu Y, Tan P, et al. (2012) PORCN Moonlights i en Wnt-Uavhengig Pathway som regulerer Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 7 (4): e34532. doi: 10,1371 /journal.pone.0034532
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 08.12.2011; Akseptert: 1 mars 2012; Publisert: 11 april 2012
Copyright: © 2012 Covey et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av hertugen-NUS Signatur Research Program og Singapore translasjonell forskning (STAR) Investigator Award (til DMV) finansiert av Direktoratet for Science, Technology and Research, Singapore, og Helsedepartementet, Singapore. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Wnts skilles acylerte glykoproteiner som kan fungere som autokrin eller kort rekkevidde signalmolekyler og langtrekkende morphogens. Den 19 forskjellige menneskelige Wnts regulere flere signalveier, og deres feilregulering er innblandet i diverse forstyrrelser i utvikling, stamcellebiologi, spredning og angiogenese [1], [2]. Det er derfor stor interesse i manipulasjon av Wnt veien om intervensjon på ulike punkter i Wnt produksjon og nedstrøms signal kaskader. En strategi for å oppnå bred forstyrrelse av Wnt signalveier er å hindre Wnt sekresjon via hemming av PORCN protein.
Porcupine (PORCN) ble først oppdaget som en Drosophila segment polaritet genet er nødvendig for normal fordeling av Vingeløse (WG ), Drosophila homolog av WNT [3]. PORCN er et medlem av den membran-bundet O-acyl transferase (MBOAT) familien og er konservert blant arter [4], [5]. PORCN er en multi-pass integral membran enzym bosatt i det endoplasmatiske retikulum, og er nødvendig for modifisering av lipid wnt proteiner. Acylering av PORCN ser ut til å være helt avgjørende for riktig sekresjon og aktivitet av alle virveldyr Wnts [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11] og genetisk delesjon av PORCN er embryonale dødelig [12], [13]. PORCN har ingen kjent funksjon utover dens rolle i den biogenese av Wnts, og er derfor et attraktivt terapeutisk mål i sykdommer med økt Wnt signalering. Faktisk er flere lavmolekylære inhibitorer av PORCN funksjon har nylig blitt rapportert, inkludert inhibitor av Wnt Produksjon 1 og 2 (iwp-1 og iwp-2) [14]. Det er to generelle metoder for inhibering PORCN, farmakologisk og genetisk. Spesielt, kan disse metodene for PORCN hemming gi forskjellige resultater. Dette kan være på grunn av ulik varighet og grad av inhibering, men også på grunn genetisk ablasjon av et enzym kan uventet avsløre flere uavhengige funksjoner for et enkelt genprodukt
to områder i wnt proteiner kan acyleres. Serin tilsvarer S209 av WNT3A er palmitoleated, mens det cystein som svarer til Cys77 er palmitoylated [4], [11], [15]. Ser209 acylering er nødvendig for WNT binding til Wntless (WLS) [16], et sterkt konservert multipass transmembranprotein spesielt involvert i Wnt sekresjon [17], [18], [19]. WLS transporterer Wnts til plasmamembranen, hvor de blir deretter sluppet inn i det ekstracellulære rom i en pH-avhengig måte. I samsvar med WLS rolle i Wnt sekresjon, celler som mangler funksjonell WLS akkumuleres Wg i Golgi [17] og mus som mangler WLS ha dødelige utviklingsmessige fenotyper i samsvar med en nøkkelrolle i Wnt signalering [20]. Rollen Wnt cystein acylering er mindre klart [21]. Cys77 ser ut til å være involvert i signaleringsaktiviteten av det utskilte proteinet, som mutasjon av området resulterer i et utskilt protein med variabelt redusert signaleringsaktivitet [15]. Palmitoylation på dette nettstedet kan være nødvendig for å binde seg til frizzled eller andre reseptorer.
Mens PORCN er helt klart avgjørende for Wnt sekresjon og funksjon, det er ikke kjent om det spiller flere roller skiller seg fra sin enzymatisk funksjon i Wnt veien . For eksempel kan PORCN acylere ytterligere ikke-Wnt underlag. Alternativt, ettersom PORCN er en evolusjonært gammel protein som er tilstede i de enkleste metazoans [22], kan det ha utviklet seg sammen enzym-uavhengig, «svart arbeid» funksjoner i tillegg. Som PORCN er både kritisk under utvikling, og et potensielt terapeutisk mål i human sykdom, er det viktig å forstå rollen til PORCN protein i cellene. Å dissekere rolle PORCN i Wnt avhengig versus Wnt-uavhengige retninger, sammenlignet vi effekten av inhibering av Wnt sekresjon av flere måter, inkludert PORCN knockdown, WLS knockdown, og lite molekyl hemming av PORCN. Vi finner at PORCN fungerer i minst to uavhengige veier, som styrer Wnt sekresjon, og en andre som ikke krever palmitoyl-transferase-aktivitet, men det er hastighetsbegrensende for vekst av transformerte epitelceller og regulerer ekspresjon av et distinkt sett av gener . PORCN er Wnt-uavhengig rolle i rask spredning har viktige implikasjoner for både fosterutvikling og kreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle eksperimenter utført på mus løse relevante og nødvendige vitenskapelige spørsmål. Disse ble utført ved hjelp av anbefalt bedøvelse og smertestillende under prosedyrer og avsluttet i tide for å hindre unødig smerte eller belastning på mus. Alle forsøkene ble utført med godkjenning av NUS Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
Cells, plasmider og reagenser
Alle kreftcellelinjer ble hentet fra ATCC. STF og STF3A celler ble avledet fra HEK 293-celler som tidligere beskrevet [23]. HMEC forvandlet (hTERT + H-Ras-V12 + p53 knockdown) og udødeliggjort (hTERT) celler var en gave fra Mathijs Voorhoeve, Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore. Mann murine embryonale stamceller (ES) celler med en målrettet PORCN locus som plasserer loxP områder oppstrøms ekson 8 og nedstrøms av ekson 10 ble gjort av Ozgene. PORCN null genet målrettet ES-celler ble valgt for Davor SOLTER laboratorium (Institutt for medisinsk biologi, Singapore). MDA-MB-231 celler som uttrykker pTRIPZ ble gjort ved hjelp lentiviral transduksjon (Åpne Biosystems). De shRNA sekvenser som ble brukt var P1: 5’CCT GGA TAT CCT TCC ACA GCT -3 «P2: 5’TAT TTA GCC AAT AAG ACA TGG T -3», W1: 5’ACC AAG AAG CTG TGC ATT GTT – 3 «, W5: 5’TGG ACA TTG CCT TCA AGC TAA-3». pMKIT-HA-mPORC-D (gave fra Tatsuhiko Kadowaki) ble klonet inn i retrovirale plasmid MSCV-puro (gave fra Mathijs Voorhoeve). Pek og siRNA-immune mutantene ble gjort ved hjelp av Stratagene QuikChange seterettet mutagenese. MDA-MB-231 og MCF7 celler som stabilt uttrykker villtype og mutant PORCN ble generert av retrovirale transduksjon og seleksjon i puromycin. Den lille molekylet PORCN hemmere iwp-en og iwp-2 ble sjenerøst gitt av Dr. Lawrence Lum. sirnas var fra Dharmacon: Kontroll /Non-targeting (# D-001810-01-05), PORCN 7 (# J-009613-07), PORCN 8 (# J-009613-08), WLS 5 (# J-018728 -05), beta-catenin 11 (# J-093415-11).
RT-PCR /qPCR.
Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp av Qiagen RNeasy Kit, en mikrogram RNA var revers transkribert ved hjelp av Bio-Rad iScript cDNA syntese kit, og qPCR ble gjennomført med Bio-Rad SsoFast EvaGreen Supermix.
mus tumormodeller.
For transient knockdown, 100000 MDA-MB-231 -celler ble transfektert med de angitte sirnas (Start eller P7) og deretter injisert i 4
th stilling melkefettpute av 6 uker gamle hunnkjønns NOD-SCID-mus. For PORCN og WLS tumormodeller, ble 500.000 MDA-MB-231 celler i 50 pl DMEM injisert orthotopically inn i fire
th posisjon melkefettpute av seks uker gamle Balb /c nakne mus. En uke etter injeksjon, stifter ble fjernet og tumorvekst ble kvantifisert ved skyvelære måling. Å indusere PORCN knockdown, var drikkevann supplert med doksycyklin på 0,5 mg /ml og oppdateres annenhver dag. Ved avslutning av studien, ble svulstene høstet, veid, og genekspresjon ble analysert.
Formerinasanalyse Studies.
Celler ble sådd ut i 70-80% konfluens i 6-brønners plater og transfektert med de angitte sirnas 100 nm ved hjelp Dharmafect en følge produsentens protokoll. 24 timer etter transfeksjon ble cellene trypsinert og sådd ut ved en 1:40 til 1:80 fortynning i 12-brønners plater. For spredning studier med iwp ble cellene sådd ut i 12-brønners plater på 10% konfluens. Media inneholder kjøretøy (DMSO) eller iwp-1/2 ble oppdatert daglig. De 12-brønns plater ble samlet opp i løpet av en 7-dagers periode, fiksert med iskald MeOH, og farget med krystallfiolett (0,5% CV i 25% MeOH). For å kvantifisere celleantall ble krystallfiolett oppløst i 1% natriumdeoksycholat i vann, og absorbans ble målt ved 590 nm. Parallelle eksperimenter ble utført og cellene ble trypsinert og talt med en Beckman Coulter Counter over en 7-dagers periode.
Mikromatrise.
MDA-MB-231 celler (70-80% konfluent) var transfektert med 50 nM siRNA i 48 timer. RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy rensing kit fra Qiagen. Merket cRNA var forberedt og hybridisert til Affymetrix U133_Plus_2.0 mikromatriser i henhold til produsentens protokoller. Matrisen data ble normalisert ved hjelp av RMA algoritme. 1482 forskjellige gener blir oppdaget av en vei ANOVA algoritme (False Discovery Rate (FDR) = 0,01). Hierarkisk clustering analyse identifiserer vesentlig ulike grupper av prøver fra 1482 ulike gener. Analysen ble utført ved hjelp av Partek programvare.
Resultater
PORCN er nødvendig for Wnt sekresjon
For å generere verktøy for å undersøke PORCN funksjon, vi identifisert og validert to uavhengige og ikke- overlapp sirnas, siP7 og siP8, som er rettet mot alle spleisevarianter av PORCN og ga mer enn 90% knockdown av PORCN mRNA (figur 1A) i HEK-293 celler. Som forventet, knockdown av PORCN i nærvær av transfekterte WNT3A resulterte i en reduksjon i β-catenin /TCF-drevet luciferase-ekspresjon i HEK-293-celler med en integrert SuperTopFlash reporter (STF-celler) (figur 1B). Likeledes knockdown av PORCN i STF celler med stabil integrasjon av WNT3A (STF3A celler) resulterte i en defekt av WNT3A sekresjon inn i mediet (figur 1C), i samsvar med PORCN er essensiell rolle i Wnt sekresjon.
A. STF3A celler ble transfektert med 100 nM av det angitte siRNA og PORCN meldingen ble analysert 48 timer senere av kvantitativ real time PCR. Histogram representerer relative PORCN mRNA normalisert til Actin mRNA. NT, ikke tilført; SiC, siRNA kontroll; siP7 og siP8, spesifikk PORCN sirnas. B. PORCN knockdown blokker Wnt /β-catenin signal. Relativ Wnt /β-catenin signal ble målt i STF3A celler transfektert med 100 nM av SiC, siP7, eller siP8 siRNA. C. PORCN knockdown hemmer WNT3A sekresjon. STF3A-celler ble transfektert med 100 nM av den angitte siRNA. Mediet ble endret til 1% FCS media 48 timer etter transfeksjon, og samlet 16 timer senere. Overflod av WNT3A ble vurdert i 30 ul kondisjonert medium (medier) og 15 ug av helcellelysater (WC) ved SDS-PAGE og immunblotting med de angitte antistoffer. Actin immunoblotting demonstrerer lik belastning av helcellelysater. D. De relative antall av MDA-MB-231 brystcancerceller er redusert etter PORCN knockdown. Cellene ble transfektert med de angitte sirnas og spredning vurdert som i eksperimentelle prosedyrer. Feilfelt angir standardavvik. E. PORCN knockdown bremser veksten av flere brystcancercellelinjer. Celle nummer ble vurdert 4 dager etter transfeksjon av siP7 siRNA og plottet som% av spredning av kontroll siRNA-transfekterte celler. *, P 0,05; **, P 0,01 for forskjellen fra kontrollen. F. PORCN knockdown selektivt bremser veksten av transform hMECs. Effekten av PORCN knockdown på veksten av hMECs udødeliggjort med hTERT eller HMEC-hTERT celler transformert ved ekspresjon av H-RasV12 og stabil knockdown av p53 ble bedømt 6 dager etter transfeksjon med kontroll eller siP7 siRNA. Transfeksjon effektivitet i begge celletyper var 80% som vurderes av GFP uttrykk. *, P 0,05 sammenlignet med kontroll siRNA. G. PORCN knockdown endrer uttrykk for Wnt /β-catenin målgener. Relativ melding av PORCN og andre Wnt /β-catenin målgener i MDA-MB-231 celler (øverst) og SK-BR-3-celler (nederst) ble bedømt ved QRT-PCR 72-timer etter transfeksjon med 100 nM av den indikerte siRNA.
Tap av PORCN hemmer brystkreft cellevekst
for å teste om PORCN var viktig for brystkreft celleproliferasjon vi først vurderes sitt uttrykk i et panel av brystkreftcellelinjer. PORCN mRNA var tilstede i alle linjene som ble testet, med MDA-MB-231 og SUM-159-celler som viser den mest tallrike meldingen (fig S1A). Vi har i tillegg analyseres disse cellene for basal Wnt /β-catenin signalering, men se ikke konsekvent eller statistisk signifikant aktivering av TOPFlash løpet av den negative kontroll FOPFlash reporter i noen av cellelinjene som ble testet (data ikke vist). Selv om noen av disse cellelinjene er blitt rapportert å ha endogene Wnt /β-catenin aktivering på grunn av oppregulering av Wnts og lyddemping av utskilt wnt inhibitorer [24], [25], [26], i henhold til våre kulturbetingelser var det ingen indikasjon på en Wnt autokrin løkke.
Fordi Wnt signalering kan aktivere både β-catenin avhengig og β-catenin-uavhengige veier, testet vi om PORCN knockdown påvirket proliferasjon og overlevelse av disse humane brystcancercellelinjer selv i fravær av påvisbare endogene β-catenin signalering. PORCN sirnas siP7 og siP8 var i stand til å produsere minst 75% knockdown av PORCN mRNA i MDA-MB-231-celler (figur 1G). Uventet, dette forårsaket en markert nedgang i celleproliferasjon over tid (figur 1D). Disse funnene ble utvidet i ytterligere fem brystkreft cellelinjer; RNAi-mediert knockdown av PORCN forårsaket en statistisk signifikant reduksjon i proliferasjon (figur 1E) i hver cellelinje testes. RNAi-mediert knockdown av PORCN er blitt rapportert å forårsake apoptose i humane lungekreftceller [27], selv om dette funnet ikke kunne være uavhengig reproduseres [28]. Mens vi har funnet en reduksjon i vekst i et antall av brystkreftcellelinjer, ble PORCN knockdown ikke resulterer i apoptose eller en endring i cellesyklusfordelingen i en hvilken som helst av de kreftlinjene som ble testet (figur S1B, og data ikke vist). Spesielt, tillater PORCN knockdown ikke påvirke proliferasjon av alle celler. For eksempel ble mesoderm-avledede cancerlinjer slik som HT-1080-celler fibrosarkom og transformerte fibroblaster BJ ikke målbart påvirket (data ikke vist). Dessuten er PORCN ikke er vesentlig for vekst av embryonale stamceller og mus embryo fibroblaster [12], [13]. Viktigere, veksten effekten av PORCN knockdown er transformasjon spesifikk i epitelceller. Transform hMECs er følsomme for PORCN knockdown mens udødelig HMECs ikke blir påvirket (figur 1F). I samsvar med funn at effekten av PORCN knockdown på vekst er ikke avhengig av Wnt signal, trenger de transform hMECs ikke vise noen tegn til Wnt /β-catenin autokrint signale (data ikke vist).
Konsekvensene av PORCN knockdown ble undersøkt videre ved å analysere endogene wnt målgener i SK-BR-3 og MDA-MB-231 celler, som de hadde den største spredningen mangelen etter PORCN knockdown. Disse linjene har blitt rapportert å ha autokrin Wnt signal [24], [29], selv om vi ikke kunne oppdage dette i TOPFLASH analyser i vårt spesifikke cellelinjer. PORCN knockdown i MDA-MB-231 celler førte til en beskjeden, men statistisk signifikant reduksjon i overflod av vitnemål som koder for Wnt målgener AXIN2, Cyclin D, og LEF1 (figur 1G, topp panel). En betydelig reduksjon av både AXIN2 og LEF1 mRNA ble funnet i SK-BR-3-celler (figur 1G, bunn panel). Til sammen ble redusert PORCN knockdown veksten av en rekke av transformerte cellelinjer, og dette korrelert ufullkomment med knockdown av Wnt /β-catenin target genet inkludert AXIN2, Cyclin D og CMYC.
knockdown av PORCN bremser svulst vekst i en orthotopic musemodell
for å ta om PORCN knockdown kan bremse veksten av kreftceller i et mer komplekst miljø der flere stroma-avledet signaler kan også stimulere spredning undersøkte vi frekvensen av etablering av svulster
in vivo
. MDA-MB-231-celler transfektert med siControl eller siP7 siRNA ble orthotopically injisert i NOD-SCID-mus og tumor take ble overvåket. MDA-MB-231 celler med forbigående PORCN knockdown vises en to-ukers forsinkelse i tumor ta sammenlignet med kontroller (figur S1C). Stans i svulstdannelse antydet at PORCN gen-funksjon er viktig å tumor ta og /eller progresjon og oppfordret oss til å forfølge en stabil knockdown tilnærming.
For å teste om tap av PORCN vil påvirke veksten av etablerte tumorer, vi skjermet 25 MIR-30 baserte konstruksjoner og identifiserte to uavhengige microRNAs som ga robust PORCN knockdown. Disse ble klonet inn i en induserbar lentiviral vektor, pTRIPZ, som gir to uttrykk for røde fluorescerende protein (RFP) og den shRNAmir i nærvær av doksycyklin. MDA-MB-231-celler ble samlet med stabilt integrert pTRIPZ kjører enten kryptert shRNAmir (shControl) eller en av to uavhengige shRNAmirs mot alle spleisevarianter av PORCN (her kalt shP1 og shP2). I dyrkede celler, tilsetning av doksycyklin resulterte i induksjon av den shRNAmir med ca 75% reduksjon av PORCN meldingen og høy ekspresjon av RFP (figur 2A). Som forventet, denne reduksjonen i PORCN mRNA i MDA-MB-231-celler førte til en reduksjon i WNT3A-aktivert signalering fra STF reporter (figur 2B). For å teste om PORCN knockdown kan bli indusert
in vivo
, celler ble injisert orthotopically inn BALB /c nakne mus. Når svulster nådd en håndgripelig størrelse (~0.2 cm), ble doksycyklin lagt til drikkevann. Etter 7 dager på doksycyklin, ble tumorer samlet og analysert for PORCN meldingen. Begge shP1 og shP2 svulster hadde en reduksjon i PORCN melding, noe som indikerer at doksycyklin er nå cellene og indusere PORCN knockdown
in vivo plakater (Figur 2C).
A. Etablering av PORCN induserbar knockdown. MDA-MB-231 celler med stabil integrasjon av pTRIPZ- SHC (kontroll), -shP1, eller -shP2 shRNAmir ble behandlet med 5 ng /ml Doksycyklin (til høyre) eller bærerkontroll (til venstre). PORCN og aktin mRNA ble bestemt ved hjelp av RT-PCR, og RFP ekspresjon ble bestemt ved fluorescens mikroskopi. B. induserbar knockdown av PORCN hemmer Wnt /β-catenin signalering. De stabile MDA-MB-231 cellelinjer ble transient transfektert med WNT3A ekspresjonsvektor og SuperTOPflash og Renilla luciferase reporter-plasmider, og deretter behandlet med 5 ng /ml Dox i 48 timer før vurderingen av Wnt /β-catenin signalering som beskrevet. Histogram representerer SuperTOPflash signaliserer i forhold til Renilla luciferase uttrykk. C. induserbar knockdown av PORCN mRNA i ortotopiske xenografter. De stabile cellelinjer ble injisert orthotopically inn i 4
th melkefettpute av BALB /c nakne mus. Etter etablering av palpable tumorer (15 dager), Dox ble tilsatt til vannet for en 7 dagers periode, ble tumorer høstet og mRNA-overflod ble bedømt ved QRT-PCR. Histogram representerer relative PORCN mRNA normalisert til Actin mRNA. D. PORCN knockdown bremser kreft vekst. Svulster ble høstet og veid 19 dager etter starten av doksycyklin behandling. E. Cancer veksten hemmes av induserbar PORCN knockdown. Tumor volum ble målt ved calipers ved de angitte tider.
For å teste om PORCN knockdown påvirker tumorvekst, ble de samme cellelinjene injisert orthotopically inn BALB /c nakne mus. Tumorene fikk nå ~0.2 cm i diameter (omtrent to uker etter injeksjon), og deretter PORCN knockdown ble indusert ved tilsetning av doksycyklin til vannet. Etter induksjon av Doxycyline, var det en betydelig reduksjon i veksten av svulster som uttrykker enten shP1 eller shP2 (figur 2E). Dette så ut til å være doseavhengig, som shP1 produsert både en større knockdown av PORCN og en større reduksjon i tumorvekst (figur 2C og E). Når styre tumorene nådde ~ 1 cm i diameter, ble musene avlivet. Svulster ble skåret ut, veid og målt. Svulster var betydelig mindre og lettere hvis de inneholdt den induserte shP1 eller shP2 shRNAmir (figur 2D). Disse resultater viser at knockdown av PORCN mRNA i en etablert ortotopiske brystkreft resulterer i en betydelig forsinkelse i tumorvekst. Dermed spiller PORCN en avgjørende rolle i MDA-MB-231 celleproliferasjon både i kultur, og i xenografter.
Tap av PORCN påvirker kreftcellevekst i en Wnt-uavhengig måte
Listen resultatene viser at knockdown av PORCN regulerer proliferasjon av flere brystcancercellelinjer. Effekten på spredning er ikke på grunn av off-target effekter av RNAi, siden vi fått identiske resultater med to uavhengige sirnas og ytterligere to uavhengige shRNAmirs mot totalt 4 ulike regioner av PORCN. Viktigere, alle RNAi-konstruksjonene var innenfor kodingssekvensen som finnes på hver av de fire humane PORCN spleisevarianter. Fordi effekten av PORCN knockdown ikke korrelerer sterkt med sin virkning på β-catenin avhengige gener som AXIN2, cyclin D, og CMYC, vurderte vi muligheten for at PORCN knockdown kan redusere cellevekst gjennom et β-catenin uavhengige autokrint Wnt sløyfe eller alternativt har som PORCN noen flere, Wnt-uavhengige funksjoner. For å skille mellom disse mulighetene, hemmet vi Wnt sekresjon av to nye uavhengige tilnærminger.
Acvlerinq av Wnts av PORCN er nødvendig for deres binding til transportproteinet, WLS, som bærer Wnts fra ER eller Golgi til plasma membran før sekresjon [16]. Som sådan, farmakologisk inhibering av acylering og tap av WLS både hemmer sekresjon Wnt beslektet knockdown PORCN [17], [18]. I den grad vi kjenner til nå, alle pattedyr Wnts kreve både PORCN og WLS for sekresjon. Som forventet, siRNA knockdown av WLS og PORCN alle på samme måte og effektivt hemmet WNT3A drevet signalering (figur 3A). PORCN enzymatiske funksjon kan bli hemmet med den lille molekyl inhibitor iwp-1 [14]. I likhet med publiserte resultater, fant vi at iwp-1 hemmer Wnt utskillelse i medium med en IC
50 av rundt 200 nM (figur 3B). Iwp-en også effektivt hemmer WNT3A drevet signalisering i MDA-MB-231 celler ved lignende doser (Figur 3C). Ved hjelp av disse alternative tilnærminger, undersøkte vi konsekvensen av redusert Wnt sekresjon på kreftcellevekst.
A. WLS, β-catenin, og PORCN knockdown alle hemme Wnt /β-catenin signal i STF3A celler. Følgende sirnas ble brukt ved 100 nM: for PORCN, siP7; for WLS, siW5; for β-catenin, siβC11. B. iwp-1 hemmer WNT3A sekresjon. Kondisjonert medium fra STF3A-celler ble vurdert for WNT3A som beskrevet etter at cellene ble inkubert i 16 timer i nærvær av den angitte konsentrasjon av iwp-1. C. iwp-1 hemmer WNT3A drevet signalisering i MDA-MB-231 celler. MDA-MB-231-celler ble ko-transfektert med WNT3A og STF og behandlet over natten med bærer (DMSO) eller indikerte doser av iwp-1. D. De angitte cellelinjer ble transfektert med enten sirnas som ovenfor, eller behandlet med iwp-1 eller bærerkontroll. Totalt celletall på dag 6 ble bedømt som beskrevet og sammenlignet med ubehandlede celler. Iwp-en ble brukt på 2 mikrometer og oppdateres hver 24. time. E. Western blot av WLS i MDA-MB-231 celler som stabilt uttrykker SHC, shW1, og shW5 shRNAs. F. WLS knockdown ikke bremse tumorvekst. MDA-MB-231 celler som stabilt uttrykker SHC, shW1, og shW5 shRNAs ble injisert orthotopically inn BALB /C nakne mus og tumorvekst overvåkes som beskrevet. G. WLS beskjed nivåer i svulster hentet fra (E), vurdert av QRT-PCR og normalisert til Actin.
Overraskende, i motsetning PORCN knockdown, knockdown av WLS hadde liten eller ingen effekt på spredning av en hvilken som helst cancercellelinje ble testet, inkludert MDA-MB-231, MCF7, DLD-1, SK-BR-3, T47D, og HeLa-celler (figur 3D og data ikke vist). Likeledes fant β-catenin knockdown ikke påvirke cellevekst i MDA-MB-231 eller MCF7 celler. Bekrefter effektiviteten av knockdown, tap av β-catenin betydelig redusert spredning av DLD-1-celler, som har stabilisert β-catenin på grunn av en mutasjon i adenomatøs polypose coli (APC) genet (Figur 3D). Den lille effekt av β-catenin knockdown på MDA-MB-231-celleformering i dette eksperimentet ble ikke sett i gjentatte eksperimenter. Videre er tilsetning av iwp-1 ved doser som gir 80% reduksjon av Wnt /β-catenin signale hadde ingen virkning på celleveksten eller levedyktigheten av MDA-MB-231, MCF7, og DLD-1 celler, linjer som var følsomme for både PORCN siRNA og shRNA (figur 3D). Vi utvidet dette resultatet til et panel av andre kreftcellelinjer og også ingen effekter av iwp-1 eller relatert molekyl iwp-2 på cellevekst og levedyktighet (fig S2). Disse resultatene viser at blokade av Wnt sekresjon av WLS knockdown eller iwp behandling endret ikke kreftcelle spredning og overlevelse, noe som tyder på at disse cellene ikke er avhengige av autokrint Wnt signalering. Viktigere, antyder disse dataene at tap av PORCN kan derfor påvirke veksten i en Wnt selvstendig måte.
Tap av WLS påvirker ikke svulst ta eller vekst
På grunn av den overraskende mangel på effekt av WLS knockdown i cellekultur, vi søkt å utvide dette resultatet til en svulst modell. MDA-MB-231 celler ble stabilt transduced med en av to shRNA målretting WLS (shW1 og shW5) eller en kontroll shRNA, (SHC). Begge shRNA målrettet mot WLS ga en effektiv knockdown på mRNA-(mer enn 80%) og på proteinnivå (figur 3E). Disse cellene ble injisert orthotopically inn i BALB /c nakne mus og tumorprogresjon ble overvåket. Svulster fra alle tre linjene vokste på en svært lik hastighet (figur 3F). Når tumorer nådde ~ 1 cm i diameter, ble de fjernet og vurdert for persistens av WLS knockdown. Både shW1 og shW5 opprettholdt en 60% knockdown av WLS i svulstene (Figur 3G). Således, mens WLS knockdown er effektiv, vedvarende, og reduserer β-catenin signalering, har det ingen virkning på MDA-MB-231 cellevekst eller xenograft tumorer. Tatt sammen med effekten av PORCN knockdown på tumorvekst (figur 2E), disse dataene ytterligere støtter ideen om en Wnt-uavhengige rolle PORCN i kreftcellevekst
in vivo
Wild Type og mutant PORCN både rednings vekst effekter
PORCN knockdown bremset kreft spredning, i motsetning til hemming av PORCN enzymatisk aktivitet med lite molekyl iwp-en. Dette paradoksale antydet at PORCN proteinet kan spille en rolle i nødvendige strukturelle celler. For å bekrefte at tap av PORCN protein er ansvarlig for de observerte vekst effekter, forsøkte vi å redde denne fenotype ved å bruke en siRNA-immune versjon av mus PORCN-D. Ved hjelp av en MSCV-3XHA-merket mPORCN-D konstruksjon [4], brukte vi seterettet mutagenese for å gi immunitet til siP7 siRNA. For å gjøre katalytisk inaktiv PORCN, vi muterte H341, en invariant MBOAT katalytisk rest spådd til å delta i PORCN katalytisk aktivitet. Eksperimenter i flere PORCN-null cellelinjer bekreftet at mPORCN (H341A) er helt katalytisk inaktiv (Figur 4E og data ikke vist). I tillegg har PORCN (H341L) har nylig vist seg å være katalytisk inaktive i PORCN null ES-celler [13]. I forbigående transfeksjoner ble PORCN mutante proteinet uttrykt på nivåer som ligner villtype PORCN og virker i en dominant negativ måte, effektivt inhiberer både Wnt sekresjon og TCF-drevet luciferase-ekspresjon i STF3A celler (figur S3, A-C). Ved hjelp av siRNA-immune versjoner av disse konstruksjonene, kotransfektert vi MDA-MB-231-celler med siP7 siRNA og viste at det ikke hadde noen effekt på overflod av ektopisk PORCN proteinet (figur 4A, øvre panel), noe som bekrefter immunitet til siP7 siRNA. MDA-MB-231 celler som uttrykker villtype mPORCN har økt WNT3A drevet STF aktivitet (figur 4B). Spesielt, har MDA-MB-231 celler som uttrykker H341A mPORCN redusert WNT3A drevet β-catenin signaleringsaktivitet, i samsvar med en dominant negativ funksjon i MDA-MB-231-celler i tillegg. Både hvete og H341A PORCN co-lokalisere med calnexin (figur 4C), en ER markør [30], i samsvar med tidligere rapporter som viser PORCN lokalisering til ER [4].
A. Western blot-analyse av MDA-MB-231-celler transfektert med P7 immun konstruksjoner av HA-merket WT og H341A PORCN. Den PORCN konstruksjonen inneholder 2 ekstra stille mutasjoner som gjør det immun mot P7 siRNA knockdown. EV, tom vektor; WT, hvete PORCN-HA; MT, H341A-PORCN-HA. B. hvete men ikke mutant PORCN stimulerer Wnt /β-catenin signalering. MDA-MB-231-celler ble ko-transfektert med plasmider som koder for WT og H341A-PORCN, WNT3A, og den SuperTOPflash reporter. H341A-PORCN har en betydelig dominant negativ effekt på Wnt /β-catenin signalering. C. villtype og mutant PORCN er hensiktsmessig lokalisert. Indirekte immunfluorescens mikroskopi ble utført med anti-HA antistoff og endoplasmatiske retikulum markør calnexin. D. hvete og dominant negativ H341A PORCN er like effektiv på å redde veksten defekt som skyldes PORCN knockdown. MDA-MB-231 ble co-transfektert med P7 siRNA og PORCN uttrykk konstruerer som angitt. Celletall ble målt som beskrevet.
