Abstract
uorganisk fosfat (Pi) er nødvendig ved alle levende organismer for utvikling av organer som ben, muskel, hjerne og lunger, som regulerer ekspresjonen av flere kritiske gener, så vel som signaltransduksjon. Men lite er kjent om effektene av langvarig kost Pi forbruk på lungekreft progresjon. Dette studium undersøkte effekten av en høy-fosfat-diett (HPD) i en musemodell av adenokarsinom. K-ras
LA1 mus ble foret med en normal diett (0,3% Pi) eller et HPD (1% Pi) i 1, 2 eller 4 måneder. Musene ble deretter avlivet og underkastet induktivt koblet plasma masse /optisk emisjonsspektroskopi og laserablasjon induktivt koblet plasma massespektrometri analyser, Western blot-analyse, histopatologiske, immunhistokjemiske, og immuncytokjemisk analyse for å vurdere tumordannelse og progresjon (inkludert celleproliferasjon, angiogenese, og apoptose), endringer i nivåer ion og metabolisme, autofagi, epitelial-til-mesenchymale overgang, og proteintranslasjon i lungene. En HPD akselerert tumorigenesis, som dokumentert av økte adenom og adenokarsinom priser samt tumorstørrelse. Men etter 4 måneder av HPD, ble celleproliferasjon arrestert, og en markert økning i leveren og lungene ion nivåer og i energiproduksjon via ble observert trikaboksylsyre syklus i leveren, som ble ledsaget av økt autofagi og redusert angiogenese og apoptose. Disse resultatene indikerer at en HPD innledningsvis fremmer men senere hemmer lungekreft progresjon på grunn av metabolsk tilpasning som fører til tumorcelle quiescence. Videre tyder resultatene på at nøye regulert Pi forbruk er effektive i å forebygge lungekreft
Citation. Lee S, Kim J-E, Hong S-H, Lee A-Y, med e-J, Seo HW, et al. (2015) High uorganisk fosfat Intake Fremmer tumorigenesis på tidlige stadier i en musemodell for lungekreft. PLoS ONE 10 (8): e0135582. doi: 10,1371 /journal.pone.0135582
Redaktør: Libing Song, Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center, KINA
mottatt: 16 februar 2014; Godkjent: 24 juli 2015; Publisert: 18 august 2015
Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: En del av dette arbeidet er støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT Future Planning (2012M3A9C4048819). M.H. Cho ble også delvis støttet av Research Institute for veterinærhøgskole, Seoul National University. LA-IPC-MS-eksperimenter ble utført med støtte fra den australske Forskningsrådet, Agilent Technologies, og Kenelec Scientific som en del av Heis Projects (LP100200254). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
uorganisk fosfat (Pi) kreves av alle levende organismer for ulike cellulære funksjoner-inkludert mineralmetabolismen og energiproduksjon fra membran fosfolipider og nukleotider-og som et substrat for fosforylerte mellomprodukter i cellesignale [1]. Pi kan skaffes passivt gjennom matinntaket eller aktivt via cellenes stoffskifte. Det er ofte brukt som et tilsetningsstoff ikke av helsemessige årsaker, men for funksjoner som opprettholde mat farge og smak, syre bufring, heve, stabilisering tekstur, og forlenget holdbarhet. En rekke matvarer inneholder Pi, inkludert cashewnøtter, mandler, bacon, hermetisk fisk, fordampet melk, bearbeidet ost, bakepulver, bakegjær, egg, linser, og isotoniske og cola drikker [2]. Menneskelig Pi forbruket øker på grunn av tilgjengeligheten av disse matvarene; studier tyder på at bruk av Pi i tilsetningsstoffer i mat har økt jevnt og trutt mens Pi inntak har økt med nesten 17% de siste tiårene [3].
De siste rapportene tyder på at unormal Pi inntak er nært korrelert med forekomst av ulike typer av kreft [4]. Pi spiller også en avgjørende rolle for genregulering i løpet av cellesyklusen, så vel som i signaltransduksjon og transkripsjonskontroll in vitro [5]. I tillegg ble en høy-fosfat-diett (HPD) vist seg å fremme lunge tumorgenese gjennom forandres Akt signale [6]. Men det har vært noen studier til dags dato vurderer homeostatic vedlikehold i lungene i forbindelse med en HPD eller rolle Pi i metabolsk tilpasning og kreft progresjon, som innebærer autofagi, apoptose, ion nivå regulering, og adenosintrifosfat (ATP) syntese via trikarboksylsyre (TCA) syklus. Denne studien undersøkte effekten av høy Pi inntak på lungekreft progresjon og de underliggende mekanismene i K-ras
LA1 mus, der konstitutiv aktivering av K-ras onkogen fører til utvikling av lunge adenokarsinom. Resultatene tyder på at en HPD utgangspunktet fremmer men senere hemmer lungekreft progresjon som følge av metabolsk tilpasning fører til tumorcelle quiescence.
Materialer og metoder
Dyr og kosthold
metoder som brukes i denne studien ble godkjent av Animal Care og bruk komité ved Seoul National University (SNU-120904-3-2). Forsøkene ble utført på 5 uker gamle hann K-ras
LA1 mus hentet fra Human Cancer Consortium of National Cancer Institute (Frederick, MD, USA). Dyrene ble holdt i et laboratorium ved en standard temperatur på 23 ° C ± 2 ° C og en relativ fuktighet på 50% ± 10% under en 12:12 timers lys /mørke syklus. Totalt 36 mus ble tilfeldig fordelt på seks grupper på seks mus hver; halvparten av musene (1, 2, og 4 måneders gruppene) ble foret med en standard American Institute of Nutrition (AIN) 93-diett inneholdende 0,3% Pi (normal diett, North Dakota), mens den andre halvparten (1, 2, og 4 måneders grupper) fikk samme diett supplert med 1,0% Pi (HPD). Sammensetningen av den modifiserte AIN-93g renset gnagerdiett [7] er vist i tabell 1. kroppsvekt, så vel som mengden av pellet og volumet av vann som forbrukes, ble målt en gang i uken. Etter 1, 2 eller 4 måneder på diett, ble musene bedøvet med 15 mg /kg Zoletil (Laboratories Virbac, Carros, Frankrike) og 3 mg /kg xylazin (Laboratories Calier, Barcelona, Spania), og transcardial perfusjon ble utført . Under obduksjonen ble hjerne, thymus, hjerte, lunge, lever, milt, nyre og testikler fjernet. Svulster på hele lungen overflaten ble talt opp, og lesjon diameter ble målt med digitale calipers under et mikroskop som beskrevet tidligere [8].
Histopatologisk undersøkelse, immunhistokjemi, og immunocytochemistry
Tissue prøvene ble fiksert i 10% bufret formalin, innstøpt i parafin, og kuttet med en tykkelse på 5 mikrometer, med deler som er samlet på ladde glassplater (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). For histopatologiske analyse, ble deler deparaffinized i xylen og rehydrert gjennom en gradert serie av alkohol, og deretter farget med hematoxylin og eosin (H E; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). For immunhistokjemi, ble seksjoner deparaffinized i xylen og rehydrert gjennom en gradert serie med alkohol, vasket og deretter inkubert i 3% hydrogenperoksid (AppliChem, Darmstadt, Tyskland) i 30 minutter for å stanse endogen peroksidase-aktivitet, og deretter vasket i fosfat-buffret saltvann (PBS) og inkubert med 3% bovint serumalbumin i Tris- /Tween-bufret saltvann i 1 time ved værelsestemperatur for å blokkere ikke-spesifikk binding. Primære antistoffer mot prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) (PC10, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) og caspase-3 (# 9662S, Abcam, Cambridge, MA, USA) ble brukt til seksjoner på 1: 200 og 1 : 1000 fortynninger, respektivt, over natten ved 4 ° C. Den følgende dag, Snitt ble vasket og inkubert med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff (1:50) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking, ble deler kontra med Mayers hematoksylin (DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) og vasket med xylen, og montert ved hjelp Permount (Fisher Scientific). Objektglassene ble sett under et lysmikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA). For immunocytokjemi, ble kjernene farget med 1 pg /ml DAPI etter blokkering og vasking tre ganger med PBS. Et antistoff mot mikrotubul-assosiert protein 1A /1B lettkjede (LC) 3 ble påført på 1: 400 fortynning over natten ved 4 ° C. Snittene ble skylt, inkubert med fluoresceinisotiocyanat-konjugert sekundært antistoff, og deretter montert på glassplater ved hjelp Faramount vandig montering medium (DakoCytomation). Fargeintensitet ble vurdert ved å telle antall positive celler i tilfeldig utvalgte felt ved hjelp I Studio versjon 3.01 software (Pixera, San Jose, CA, USA).
Western blot analyse
Totalt proteinkonsentrasjonen i homogenislunge prøvene ble bestemt ved bruk av Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Western blotting ble utført i henhold til en tidligere beskrevet prosedyre [9] med antistoffer mot disse proteinene: acetyl-koenzym (Co) A (# 3676), fosforylert (p) acetyl CoA (# 3661), LC3 (# 2275), autophagy protein (ATG) 5 (# 2630), fosforylert (p) -p70 S6 kinase
Thr389 (# 9205), 4EBP1 (# 9644S), og p-Akt
Thr308 (# 2965) (alle fra Cell Signaling teknologi, Danvers, MA, USA); suksinat-dehydrogenase-komplekset, subenhet A (SDHA) (ab14715) og cytokrom c oksidase subenheten (COX) -IV (ab33985) (begge fra Abcam); cytokrom c (A-8), Rieske (A-5), B-celle lymfom (BCL) -2 (C-2), Bcl-2-assosiert død promoter (Bad) (C-7), Bcl-2- forbundet X-protein (Bax) (B-9), eIF4E (P-2), fibroblast vekstfaktor (FGF) -2 (147), prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) (PC10), N-cadherin, og aktin (I -19) (alle fra Santa Cruz Biotechnology); og glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (LF-PA0212, AbFrontier, Seoul, Korea). Proteinbåndene ble påvist ved hjelp av LAS-3000 lysende bilde analysator (Fujifilm, Tokyo, Japan) og kvantifisert ved hjelp av Multi Gauge versjon 2.02 software (Fujifilm).
QRT-PCR-analyse
QRT-PCR analysen ble utført ved å isolere RNA ved hjelp av total RNA ble isolert ved hjelp av QuickGene RNA kit (Fujifilms Life Science System, Tokyo, Japan). Komplementær DNA ble produsert med SuPrimeScript RT Premiks (Genet Bio, Cheonan, Korea). Reaksjonene ble satt opp i tre eksemplarer med stats Q-Mastermix (Genet Bio) og kjøre på CFX96T Sanntidssystem (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De genekspresjon er presentert som uttrykket i forhold til aktin. Sekvensene til primerne som ble brukt for qPCR var som følger mus E-cadherin, forover (5′-TCGAGGAAATCTGCATTCATACTC-3 «), omvendt (5′-TCTCCGCTGCCATTTCTAAC-3′), mus β-aktin, forover (5»- – TTTCCAGCCTTCCTTCTTGGGTATG-3 «), og omvendt (5’CACTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTAC-3»)
Påvisning av sporstoffer i vev
Laser ablasjon induktivt koplet plasma-massespektrometri (LA-ICP. MS) ble utført ved hjelp av en New Wave Forskning UP-213 laser ablasjon system (Kenelec Technologies, New South Wales, Australia) er utstyrt med en neodymium-dopet yttrium aluminium granat laser sender ut et nanosekund laserpuls i femte harmonisk med en bølgelengde på 213 nm . Laseren ble forbundet med en 7500ce ICP-MS (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) ved Tygon-rør. Detaljer om analysemetoder har tidligere blitt publisert [10]. I korte trekk ble laserstrålen rastered langs prøvens overflate i en rett linje. Data ble kjøpt med en laser spot størrelse på 65 nm, laserskannehastighet på 20 mikrometer s
-1, og ICP-MS total integrasjon tid på 0,325 sek. For ICP-optisk emisjonsspektroskopi (ICP-OES) elementanalyse, ble vevsprøver spaltet i svovelsyre og hydrogenperoksyd. Alle kjemiske reagenser var av analytisk kvalitet. Vann (resistivitet på 18,2 Megohm) ble de-ionisert med et Milli-Q-system (Millipore, Bedford, MA, USA). Salpetersyre (65% v /v) og svovelsyre (95% -97% volum /volum) (begge fra Samchun Chemical Co., Seoul, Korea) ble anvendt for prøvepreparering. Acid fordøyelse av vevsprøver fortynnet med Milli-Q-vann under anvendelse av en syrekonsentrasjon på 0,2% ble utført ved 70 ° C i 24 timer fulgt av hydrogenperoksyd (70 ° C) fordøyelse over natten. Konsentrasjoner av elementært Mn, Fe, Cu, og Zn ble kvantifisert ved ICP-MS og konsentrasjonene av elementært Na, Ca, S og P ble målt ved hjelp av ICP-OES. Operasjonelle forhold for begge prosedyrene er vist i tabell 2.
Statistisk analyse
Studentenes
t
-test ble brukt til å evaluere forskjeller mellom to grupper (GraphPad programvare , San Diego, CA, USA). Stjerner (*) indikerte statistisk signifikante forskjeller til ND.
Resultater
Høy Pi inntak akselererer tumorigenesis på tidlige stadier i en lungekreft modell
For å undersøke effekten av høy Pi inntak på lungekreft cellevekst, ble svulster på lungene overflaten målt i HPD- og ND-matet mus (fig 1A). Alle HPD-matet mus viste progressiv adenokarsinom og adenom, som observert av H E-farging (fig 1C). Et høyt forbruk Pi indusert utvikling av lungekreft over perioder på 1, 2 og 4 måneder (tabell 3 og 4). Antallet og størrelsen av tumorknuter var høyere i HPD enn i ND gruppe 1 og 2 måneder (P 0,05), selv om forskjellen mellom de to gruppene var ikke statistisk signifikant ved 4 måneder (figur 1B). Svulsten Volumet var også høyere hos mus forbruker en HPD enn i ND mus, men bare i 2- og 4-måneders grupper (figur 1B). En histopatologisk undersøkelse avdekket en ca. 2 ganger høyere forekomst av adenokarsinom og adenom i 1- og 2-måneders HPD grupper enn i sine ND kolleger. Men i 4-måneders HPD gruppe Forekomsten av adenokarsinom og adenom var sammenlignbar med ND gruppe på 4 måneder (tabell 4), noe som tyder på at frekvensen av tumordannelse hadde redusert på dette tidspunkt.
Mus (n = 6 per gruppe) ble foret med et IF (0,3% Pi) eller HPD (1% Pi) i 1, 2 eller 4 måneder. (A) adenokarsinom og adenom i lungevevet. (B) Totalt antall tumorer, antall tumorer med diameter 1,5 mm, og tumorvolumet i Nd og HPD-matet mus. Resultatene er gjennomsnitt ± standardavvik (SD) av seks uavhengige målinger. Feil bar representerer SD. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. (C) svulster på lungene av Nd og HPD-matet mus, som visualiseres ved H E farging. Skala:. 100 mikrometer
Endringer i lunge ion nivåer er forårsaket av en HPD
Endringer i nivåene av ulike ioner ble bestemt ved ICP-MS , ICP-OES, og LA-ICP-MS. I motsetning til mus i ND gruppe, ble markert høyere ione-nivåer påvist i HPD-matet mus: P, ble S, Fe, Mn og Zn forhøyet i lever og lunger, og Ca-nivå var også høyere i lungene ved 4 måneder (tabell 5 og figur 2). Forskjeller i lunge ion nivåer mellom ND og HPD grupper ble også påvist ved 1 og 2 måneder, men mer levende forskjell eksisterte mellom ND og HPD gruppe på fire måneder. Disse resultatene antyder at et høyt inntak av Pi over en forlenget periode forandrer ikke bare P-homeostase, men også innholdet av andre ioner.
LA-ICP-MS-analyser representerer middelverdier fra tre forsøk med oppløsning ICP-MS /ICP-OES data (n = 6 per gruppe). Den vertikale linjen i gradert farge fra blå til rød representerer ion nivå fra lav til høy, henholdsvis.
Pi induserer energiproduksjon via TCA syklus i leveren
for å undersøke virkningene av en HPD på cellulær metabolisme, nivåene av total og p-acetyl CoA, og komplekser II, ble III, IV og evaluert ved western blotting. En nedregulering i uttrykket av p-acetyl CoA i leveren ble observert i HPD gruppen sammenlignet med kontrollgruppen mus ved 4 måneder, mens acetyl CoA ekspresjon var nesten fraværende (figur 3). Omvendt nivåene av komplekser II, III og IV ble oppregulert på 1, 2 og 4 måneder i HPD gruppe i forhold til de i ND gruppen i leveren. I tillegg ble nivået av Fe-S Rieske kompleks økes i den HPD gruppe i forhold til ND gruppen. Disse resultatene indikerer at høy Pi inntak fører til en feilregulering av cellulær metabolisme, noe som fører til større ATP produksjon.
Protein ekspresjon av p-acetyl CoA, acetyl CoA, SDHA (kompleks II), cytokrom c (kompleks III), COX IV (kompleks IV), og Rieske (Fe-S-kompleks) i forhold til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) i leveren vevshomogenater fra K-ras
LA1 mus tilført en ND eller HPD for 1, 2, eller 4 måneder (n = 6 per gruppe), som bestemt ved western blotting og kvantifisert ved densitometri. Resultatene er gjennomsnitt ± SD. Feil bar representerer SD. * P 0,05; ** P 0.01.
En HPD øker autofagi og epitelial til mesenchymale overgang i lungene
De tidligere resultatene indikerte at høy Pi forbruk i utgangspunktet fremmer men senere hemmer tumorigenesis. For å vurdere om endringene i samsvar med tumor suppresjon forekomme som et resultat av langvarig høy Pi forbruk, ble markører for autofagi og epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) undersøkt. Ekspresjonen av den autophagosomal markører LC3 og ATG5 ble øket i lungene til HPD-matet mus i forhold til ND matet mus ved 4 måneder, som påvist ved western blotting (figur 4A). I lunge vevsprøver, ble sporadiske signaler LC3 observert i 1- og 2-måneders HPD grupper ved immunocytokjemi (data ikke vist), mens ved 4 måneder, det fluorescente signalet var signifikant høyere i HPD enn i ND gruppen (fig 4B ). I tillegg, ekspresjon av EMT markør N-cadherin var høyere i HPD enn i de ND gruppene, selv om forskjellen mellom de to diettbetingelser var størst ved 4 måneder (figur 4C). I QRT-PCR-analyse, uttrykk for epitelial markør E-cadherin var lavere i HPD enn i ND grupper (Fig 4D). Disse resultatene tyder på at tumorprogresjon blir undertrykket ved høyt Pi forbruk på senere stadier på grunn av aktivering av autophagy og EMT.
(A) Protein ekspresjon av autophagy markører LC3 og ATG5 i lungevev homogenater som bestemt ved western blotting, ved hjelp av aktin som en lasting kontroll. (B) LC3 uttrykket (grønn) i lunge vevssnitt ble bedømt ved immunocytokjemi. Den høyeste immunoreaktivitets ble observert i fire måneder HPD gruppe i forhold til tilsvarende kontroll (ND) gruppe. Skala: 10 mikrometer. (C) Protein ekspresjon av EMT markør N-cadherin i lunge vevshomogenater av K-ras
LA1 mus tilført en ND eller HPD for 1, 2 eller 4 måneder (n = 6 per gruppe), som bestemt ved western blotting, ved hjelp av aktin som en lasting kontroll. Resultatene er gjennomsnitt ± standardavvik SD. Feil bar representerer SD. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. (D) QRT-PCR-analyse av epiteliale markører, E-cadherin. Resultatene er gjennomsnitt ± standardavvik SD. Feil bar representerer SD. * P 0,05; *** P 0,001.
HPD forbruket øker protein oversettelse på tidlige stadier av svulst utvikling
mTOR pathway regulerer protein oversettelse via eukaryote hemming faktor 4E binding protein 1 (eIF4E-BP1) fosforylering og 70-kDa ribosomalt protein S6-kinase (p70S6K), og dermed påvirke tumorcelle-proliferasjon. En betydelig økning i eIF4E og p70S6K-ekspresjon ble observert i prøvene fra de 1- og 2-måneders HPD gruppene i forhold til kontrollgruppen (figur 5). I motsetning til dette, ble nivåene av begge proteiner ble redusert ved 4 måneder i HPD gruppen sammenlignet med gruppen ND. Disse dataene antyder at protein oversettelsen ble forbigående stimulert av Pi i de tidlige stadier av kreftutvikling.
uttrykk for oversettelsesrelaterte proteiner p70S6K, eIF4E, p-4E-BP-1/2, og 4e BP-1/2 i lungevev homogenater av K-ras
LA1 mus tilført en ND eller HPD for 1, 2 eller 4 måneder ble bestemt ved western-blotting og kvantifisert ved densitometri (n = 6 per gruppe) i forhold til ekspresjonsnivået av aktin. Resultatene er gjennomsnitt ± standardavvik SD. Feil bar representerer SD. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.
En HPD stimulerer celleproliferasjon og angiogenese på tidlige stadier av svulst utvikling
Effekten av Pi på tumorprogresjon ble også undersøkt ved å evaluere celleproliferasjon og angiogenese i K-ras
LA1 mus. Uttrykket nivåer av PCNA og FGF-2-markører for proliferasjon og angiogenese, henholdsvis-i lungene til mus i 1- og 2-måneders HPD grupper ble øket sammenlignet med de i de tilsvarende ND gruppene, som bestemt ved Western-blotting (fig 6A). I motsetning til dette ble en signifikant reduksjon i disse proteinene er observert i den fire-måneders HPD gruppe. Disse resultatene ble også bekreftet av immunhistokjemi, som avslørte større PCNA immunoreaktivitets i prøver fra 1- og 2-måneders HPD grupper enn i de fra fire måneders HPD gruppe (fig 6B). Disse resultatene viser at tumor celleproliferasjon og angiogenese ble fremskyndet av Pi på tidlige stadier, men at disse effektene ble avskaffet ved langvarig Pi forbruk.
spredning og angiogenese ble evaluert i lungene til K-ras
LA1 mus matet en ND eller HPD for 1, 2 eller 4 måneder (n = 6 per gruppe). (A) Ekspresjon av proteiner forbundet med proliferasjon (PCNA) og angiogenese (FGF-2) i lungevev homogenater ble undersøkt ved western blotting, ved hjelp av aktin som en lasting kontroll. (B) PCNA-uttrykke celler i svulsten regionen (øverst til høyre i hvert panel) ble visualisert ved immunhistokjemi. Skala: 20 mikrometer. Resultatene er gjennomsnitt ± standardavvik SD. Feil bar representerer SD. * P 0,05; ** P 0.01.
Pi reduserer mitokondriene-mediert apoptose i lungene
Evasion av apoptose er en medvirkende faktor i kreftutvikling, kreft progresjon, og oppkjøpet av resistens mot behandlingen. For å undersøke hvorvidt Pi forbruk påvirker mitokondriene-mediert apoptose, uttrykket nivåer av Bad, Bax, og cytokrom C-proteinene i lungen ble vurdert ved Western blotting. Alle tre proteiner ble nedregulert i HPD-matet mus ved alle tidspunkter (Fig 7A). Videre caspase-3 aktivitet i tumor-regionen ble også redusert ved 1, 2 og 4 måneder i HPD gruppen sammenlignet med gruppen ND (Fig 7B). Disse resultatene indikerer at en HPD kan redusere mitokondriene-mediert apoptose i lungene til K-ras
LA1 mus.
apoptose i lungene ble analysert i K-ras
LA1 mus tilført en ND eller HPD for 1, 2 eller 4 måneder (n = 6 per gruppe). (A) Ekspresjon av mitokondrie apoptose-relaterte proteiner dårlig, Bax, og cytokrom c ble bestemt ved Western-blotting av lunge vevshomogenater, med aktin anvendt som en lasting kontroll. (B) Immunhistokjemisk analyse av caspase-3 ekspresjon i tumor-regionen. Skala: 20 mikrometer. Resultatene er gjennomsnitt ± standardavvik SD. Feil bar representerer SD. * P 0,05; ** P 0.01.
Diskusjon og Konklusjon
neoplastiske progresjon innebærer en forstyrrelse av den homeostatiske kontroll av celleproliferasjon, celledød, og DNA-reparasjon som følge av endogene faktorer eller eksponering for eksogene kreftfremkallende kjemikalier [ ,,,0],11]. Pi fungerer som en global signalmolekyl som regulerer genekspresjonen på sopp, bakterier og planter, samt ulike celletyper i dyr [12] i prosesser såsom mineral- eller intermediær metabolisme og energioverføring. I tillegg er Pi en essensiell komponent av fosfolipider og nukleotider, og er nødvendig for protein-fosforylering [13]
Inhibering av Na-avhengig fosfat ko-transportør 2b undertrykkes veksten av kreft lunge.; proteinet ble også funnet å være sterkt uttrykt i trinn I og III prøvene humane lungekreft vev [14]. I en musemodell for lungekreft, har høy Pi inntak vært knyttet til økt cap-avhengig oversettelse samt tumorigenesis via Akt signalveien i hjerne, lunge, lever og [6,15-17]. Men effekten av langvarig høyt Pi forbruk på lunge kreft progresjon har ikke tidligere blitt rapportert; Dette ble undersøkt i dette studiet i K-ras
LA1 mus tilført en HPD over en periode på 1, 2 eller 4 måneder.
Musene forbrukes en modifisert versjon av AIN-93 diett, som mangler Ca og P. sammensetningen av pelletene ble endret basert på AIN-93g diett ved å erstatte de manglende elementer (for eksempel, ved å tilsette natriumfosfat for P) for å møte ND (0,5% Ca, 0,3% P) og HPD (0,5% Ca, 1% P) forhold. Daglig inntak av Pi ble økt mens daglige matinntak var uendret (tabell 3). Dessuten var det ingen forskjell i kroppsvekt mellom ND og HPD grupper (S1 Fig). Likevel markerte endringer i nivåene av ulike ioner, inkludert P, ble observert i fire måneder HPD gruppe, i forhold til ND-gruppen (tabell 5).
Leveren er et viktig organ for fordøyelsen samt som xenobiotisk metabolisme. Blood spennende magen og tarmene passerer gjennom leveren, som bryter ned næringskomponenter [18]. Etter denne prosessen involverer endringer i ione-nivåer, ble en kvantitativ analyse utført for å vurdere endringer i konsentrasjonene av forskjellige ioner i mus foret en HPD. En analyse av Fe-S Rieske komplekset ved LA-ICP-MS viste høyere Fe og S-nivåer i lever av HPD-matet mus enn kontroll-mus som var sannsynligvis på grunn av økt cellulær metabolisme. P-nivået ble også økt i alle HPD grupper. En høyere metallion inntak øker risikoen for kreft ved å stimulere celleproliferasjon eller inhibering av tumor suppressorer slik som p53. For eksempel, cytoplasmatiske Ca
2 + virker som en mitogen [19]. Kreftforekomst har også vært knyttet til økt opptak og redusert effluks av Fe [20]. Videre er en høy Fe
3+ nivå aktiverer Fe
3 + -avhengige proteiner som fremmer cellevekst [21]. Makrofager i svulsten mikromiljøet kan akselerere tumorvekst delvis ved å gi tumorceller med Fe [22], mens forhøyede Fe
3+ nivåer kan øke risikoen for kreft. Høy Zn
2 + nivåer kan indusere tap av mitokondriell potensial og fører til nedbrytning av Bcl-2 [23]; Zn
2+ spiller en nøkkelrolle i downregulating apoptose relaterte gener som
Bax
,
BCL-2
, og
survivin
, noe som fører til tumorigenesis [ ,,,0],24]. Skade på BCL-2 er en årsaksfaktor i ulike kreftformer, inkludert melanom, bryst, lunge, og prostata kreft og kronisk lymfatisk leukemi [25]. Disse funnene, sammen med resultatene fra denne studien viser at høy Pi forbruk over en lang sikt endrer nivået av bestemte metallioner og kan indusere tumorigenesis. Merarbeid er for tiden i gang med å fastslå den nøyaktige rollen disse ionene i kreftutvikling og progresjon.
TCA syklus er en energigenererende metabolismeveien som begynner med overføring av en to-karbon acetyl gruppe fra acetyl CoA til oksaloacetat [26]. Komplekser I-IV spiller viktige roller i cellulær respirasjon og ATP produksjon [27]. Vi fant ut at basal metabolic rate var høyere i HPD enn i ND-gruppen, noe som tyder på at Pi aktivert TCA syklus i leveren gjennom rask forbruk av acetyl-CoA. Faktisk, en HPD indusert oppregulering av elektrontransportkjede-assosierte proteiner som SDHA, cytokrom c, COX-IV, og Rieske (figur 3). De fleste primære og metastatisk kreft er preget av økt glykolyse, noe som fører til økt glukoseforbruk [28]. Glykolyse mellomprodukter blir anvendt for biosyntesen av kreftceller, som derfor krever mer ATP enn ikke-delende celler [29]; kreftceller kan også bruke aerob glykolyse til å metabolisere glukose, et fenomen kjent som Warburg virkning [28]. En fersk studie rapporterte at det endoplasmatiske retikulum enzymet ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase 5 stimulerer ATP forbruk og favoriserer aerob glykolyse, og dermed fremme kreft celle overlevelse [30]. Resultatene av denne studien viser at høy Pi utløser cellulær metabolisme og fører til større ATP produksjon.
Autophagy aktivering observeres under både sult og hypoksiske forhold i svulsten mikromiljøet [31]. Autophagy fremmer celleoverlevelse etter forbigående næringsstoff sult og vekstfaktor-tilbaketrekning [32] som svar på lav glukoseopptak og glykolyse, noe som fører til en reduksjon i frekvensen av proteintranslasjon [33]. Under hypoksiske betingelser, kreftceller viser endrede metabolske egenskaper som for eksempel en oppregulering av glykolyse og oksidativt stress respons. Kontinuerlig biosyntesen av laktat fra glukose under aerobe forhold representerer en tilpasning til sporadiske hypoksiske forhold i premaligne lesjoner og fremmer kreftcelle dvalen [34], der cellene i svulsten interiøret inn i en tilstand av quiescence utløst av lavt nærings tilgjengelighet og hypoksi. Autophagic aktivitet, som vist ved LC3-II ekspresjon, er indusert som en adaptiv respons [35], mens ekspresjonen av spesifikke proteiner EMT er korrelert med tumor aggressivitet [36]. I denne studien ble det antatt at svulster tilpasset de høye nivåer av Pi som langvarig lav-energi metabolske tilstand, noe som resulterer i tumorceller quiescence i mus i 4-måneders HPD-gruppen. Under metabolsk tilpasning til høy Pi konsentrasjon, kan kreftcellene også utvikle resistens og bli mer aggressive [37]. Her ble det observert at ekspresjonen av autophagy markører LC3-II og ATG5 så vel som av EMT markør N-cadherin ble hevet i lungene til mus i 4-måneders HPD gruppe (figur 4C); dette funnet er konsistent med de av nyere studier som har vist at aktivering av autofagi er korrelert med tumor tilpasning og en påfølgende økning i kreft aggressivitet [38].
En annen fersk studie fant at mTOR-Akt veien var aktivert i omtrent 90% av ikke-småcellet lungekreft celler, som er tillagt overlevelse og resistens overfor terapi [39]. Den ribosomalt protein p70S6K regulerer protein oversettelse via mTOR vei, og dens inaktive undertrykker cellevekst [40]. I tillegg oversettelse og fosforylering av 4E-BP1, som er uttrykt i en rekke kreftformer, er nært knyttet til tumorprogresjon. Translasjonsinitiering inhiberes ved binding av 4E-BP1 og eIF4E, som fører til rekruttering av oversettelsen komplekset til mRNA [41]. Monteringen av eIF4F komplekset er ferdig med utgivelsen av hyperfosforylisert 4E-BP1 fra eIF4E, som lar oversettelse for å fortsette [42]. Oversettelse start er det hastighetsbegrensende trinn i proteinsyntesen og oversettings prisene bestemmes av eIF4E protein nivåer [43]. I den foreliggende studien ble pP70S6K og eIF4E sterkt uttrykt i lungene til mus i 1- og 2-måneders HPD-grupper, noe som tyder på at protein turnover og tumorprogresjon hos disse musene var høyere enn den til mus som forbruker store Pi over en lengre periode .
tumorgenese involverer tumorcelle-proliferasjon og angiogenese [44], som kan bli detektert av PCNA og FGF-2-ekspresjon, respektivt.
