Abstract
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er assosiert med en markert kollagenrikt stromal reaksjon som har vist seg å bidra til kjemoterapi-motstand. Vi har tidligere vist at PDAC cellene er resistente overfor kjemoterapi gemcitabin i kollagen mikromiljøet på grunn av økt ekspresjon av kromatin ombygging proteinet høy mobilitet gruppe A2 (HMGA2). Vi har nå funnet at menneskelige PDAC svulster viser høyere nivåer av histon H3K9 og H3K27 acetylering i fibrotiske regioner. Vi viser at i forhold til celler dyrket på vev kultur plast, PDAC celler dyrket i tredimensjonale kollagen gels demonstrere økt histon H3K9 og H3K27 acetylering, sammen med økt uttrykk av p300, PCAF og GCN5 histone acetyltransferases (HATS). Knocking ned HMGA2 demper effekten av kollagen på histon H3K9 og H3K27 acetylering og på kollagen-indusert p300, PCAF og GCN5 uttrykk. Vi viser også at menneske PDAC svulster med HMGA2 demonstrere økt histon H3K9 og H3K27 acetylering. I tillegg, viser vi at cellene i tre-dimensjonale kollagen geler demonstrere økt beskyttelse mot gemcitabin. Betydelig, nedregulering av HMGA2 eller P300, PCAF og GCN5 hatter sensitizes cellene til gemcitabin i tredimensjonale kollagen. Samlet våre resultater øke vår forståelse av hvordan kollagen mikromiljøet bidrar til cellegift-motstand in vitro og identifisere hatter som potensielle terapeutiske mål mot denne dødelige kreft
Citation. Dangi-Garimella S, Sahai V, Ebine K, Kumar K, Munshi HG (2013) tredimensjonale Collagen jeg Fremmer gemcitabin Resistance in vitro i kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom HMGA2-Dependent Histone acetyltransferase Expression. PLoS ONE 8 (5): e64566. doi: 10,1371 /journal.pone.0064566
Redaktør: Edna Cukierman, Fox Chase Cancer Center, USA
mottatt: 21 januar 2013; Godkjent: 16 april 2013; Publisert: 16 mai 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. National Cancer Institute Grant # R01CA126888 Department of Veterans Affairs Merit Grant # I01BX001363. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for enorm innsats, fremdriften i behandlingen av bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC) har vært frustrerende snaut [1], [2]. PDAC fortsetter å være den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA, med en ~80% ett-års mortalitet for de fleste pasienter [3]. Denne mangelen på fremgang er delvis på grunn av uttalt kollagenrike fibrotisk reaksjon i forbindelse med PDAC svulster [4], [5], som senere begrenser levering og effekt av kjemoterapi [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Nylig publiserte vi at PDAC celler i det tredimensjonale kollagen mikro indusere høy mobilitet gruppe A2 (HMGA2), et arkitektonisk protein som regulerer kromatinstruktur og også medierer chemo-motstand i kollagenrikt mikro [6], [10], [11]. Betydelig, er HMGA2 oppregulert i humane PDAC svulster, særlig i høy grad svulster med lymfeknutemetastaser [12], [13].
PDAC er også assosiert med epigenetiske forandringer, som har vært knyttet til pasientens prognose [ ,,,0],14], [15]. Posttranslasjonelle histone modifikasjon mønstre oppdages av immunhistokjemi ble vist å være prediktiv for prognose i to store kohorter av PDAC pasienter behandlet med kjemoterapi [14], [15]. PDAC pasienter med tumorer viste en lav uttrykk for histon H3 lysin 27 tri-metylering (H3K27Me
3) eller histon H3 lysin 9 di-metylering (H3K9Me
2), som er merker for lukkede kromatin ( «heterochromatin») og gen undertrykkelse [16], [17], [18], hadde signifikant kortere total overlevelse enn PDAC pasienter med kreft som vises høy histone H3K27Me
3 eller histon H3K9Me
2 uttrykk [14], [15]. Men PDAC pasienter med lav histone H3K4Me
2, som er et tegn på en mer åpen kromatin ( «eukromatin») tilstand, også demonstrert kortere total overlevelse enn PDAC pasienter med kreft som vises høy H3K4Me
2 uttrykk [15] . I motsetning til histon metylering, som er forbundet med både genaktivering og undertrykkelse, har histon acetylering bare vært forbundet med genaktivering forbundet med eukromatin tilstand [16], [17], [18]. Til tross for den klare sammenhengen mellom histone acetylering og kreftutvikling [19], [20], bidrag av hatter å PDAC progresjon er ikke godt undersøkt.
uttrykk og aktivitet av HAT proteiner er endret på en rekke -kreft [21], [22]. For eksempel er det p300 HAT er involvert i aktivering av c-myc-promoteren i PDAC celler [23]. P300 HAT er også nødvendig for G1 /S cellesyklus overgang, som nedregulering av p300 HAT forårsaker veksthemming av melanomceller [24]. Hatter også modulere kromatin staten i celler, med GCN5 og PCAF hatter blir vanligvis nødvendig for global histon H3K9 acetylering og p300 HAT blir vanligvis involvert i global histone H3K27 acetylering [22], [25]. Interessant, bidrar GCN5 HAT til omfattende vedlikehold av aktivt kromatin indusert av myc oncoproteinet [26].
I denne rapporten undersøker vi hvilken rolle og regulering av P300, PCAF og GCN5 hatter i PDAC celler. Vi viser at den tredimensjonale kollagen mikromiljøet gjennom HMGA2 uttrykk fremmer histon H3K9 og H3K27 acetylering sammen med P300, PCAF og GCN5 HAT uttrykk i PDAC celler. I tillegg viser vi at menneske PDAC svulster med økt fibrose skjerm høyere histon H3K9 og H3K27 acetylering, og har økt HMGA2 uttrykk. Videre PDAC celler i tredimensjonale kollagen geler demonstrere økt beskyttelse mot gemcitabin. Betydelig, downregulating HMGA2 eller P300, PCAF og GCN5 hatter sensitizes cellene til gemcitabin i tredimensjonale kollagen. Samlet våre resultater øke vår forståelse av hvordan den tredimensjonale kollagen mikromiljøet bidrar til cellegift-motstand in vitro, og etablere hatter som potensielle terapeutiske mål mot denne dødelige kreft.
Resultater
kollagen øker histone H3K9 og H3K27 acetylering
Nylig publiserte vi at PDAC celler vokser i kollagenrike mikromiljøet ble beskyttet mot virkningene av kjemoterapi [6]. Vi viste at chemo-beskyttelse skyldes økt uttrykk av HMGA2 [6], en arkitektonisk protein som er involvert i regulering av kromatin staten [10]. Siden hatter har vært knyttet til endringer i kromatin tilstand og også mediere respons på DNA-skade [19], [20], [21], [22], [27], [28], undersøkte vi hvorvidt fibrose i human PDAC svulster ble forbundet med endringer i histone acetylering. Dessuten, siden P300 og GCN5 hatter er involvert i kromatin avslapping ved å fremme acetylering på områder av DNA-skade og tilrettelegge for reparasjon [27], [28] undersøkte vi endringer i acetylering av histon H3 lysinresidier mediert av disse to hatter. Som P300 HAT er vanligvis involvert i globale histon H3K27 acetylering og GCN5 HAT funksjoner for å regulere globale histone H3K9 acetylering [22], [25], menneske PDAC tumorprøver ble farget for histon H3K9 og H3K27 acetylering av IHC og Trichrome farget for å vurdere for fibrose . Som vist i fig. 1A og 1B, er det økt histon H3K9 og H3K27 acetylering i regioner av fibrose i forhold til de ikke-fibrotiske områder. Kvantifisering av den relative farging viste at det var ~ 2-ganger økning i nukleær farging av histon H3K9 og H3K27 acetylering i områder av fibrose sammenlignet med ikke-fibrøse områder (Fig. 1C). For å finne ut om kollagen mikromiljøet ble årsaks knyttet til histon H3K9 og H3K27 acetylering, PDAC celler (Panc1 og CD18 celler) ble belagt på vev kultur plast eller i tredimensjonale kollagen gels og vurderes for histon H3K9 og H3K27 acetylering ved Western blotting. PDAC celler dyrket i tredimensjonale kollagen gels demonstrert økt histon H3K9 og H3K27 acetylering (Fig. 1 D).
A, B
. Menneske bukspyttkjertelen microarray (TMA) som inneholder 24 prøver ble immunostained med IgG kontroll antistoff eller for histon H3K9 og histon H3K27 acetylering (Ap). Den TMA ble også Trichrome farget for å vurdere for fibrose.
innfellinger
viser høyere forstørrelse bilder av farging med kontroll IgG, og for histon H3K9Ac og histon H3K27Ac.
C
. Kvantifisering av histon H3K9Ac- og histone H3K27Ac-positive celler ble utført ved hjelp av Adobe Photoshop CS3. *, P 0,01 i forhold til seksjoner med lav fibrose.
D
. Panc1 og CD18-celler ble dyrket i vevskultur plast eller tre-dimensjonale kollagen-geler i 24 timer. Cellene ble lysert og immunoblottet for histon H3K9Ac og H3K27Ac bruker α-tubulin som lasting kontroll. Resultatene er representative for minst fire uavhengige forsøk.
Vi undersøkte også effekten av kollagen I-belagte overflater ( «todimensjonal kollagen») på histon H3K9 og H3K27 acetylering. Som vist i Supplemental fig. S1, kollagen-belagte overflater hatt varierende effekt på histon H3K9 og H3K27 acetylering. Histon H3K9 acetylering ble økt på to-dimensjonal kollagen i Panc1 celler, men ikke i CD18-celler. I motsetning til dette ble histon H3K27 acetylering øket på to-dimensjonal kollagen i CD18-celler, men ikke i Panc1 celler. Disse resultater antyder at to-dimensjonale kollagenoverflater kan indusere, i noen grad, histon H3K9 og H3K27 acetylering. Men siden tumorceller in vivo er omgitt av kollagen [4], [5], plating celler i det tredimensjonale kollagen er en mer representativ modell for å undersøke effekten av kollagen på bukspyttkjertelkreft celleadferd.
HMGA2 regulerer kollagenindusert H3K9 og H3K27 acetylering
Vi har tidligere vist at kollagen mikromiljøet øket HMGA2 ekspresjon i PDAC celler [[6] og fig. 2A]. For å avgjøre om HMGA2 mediert kollagen-indusert histon H3K9 og H3K27 acetylering, ble HMGA2 uttrykk nedregulert med 2 forskjellige sirnas i Panc1 og CD18 celler (Fig. 2B) og effekten på histon H3K9 og H3K27 acetylering ble bestemt. Som vist i fig. 2C og 2D, redusert HMGA2 siRNA kollagen-indusert histon H3K9 og H3K27 acetylering i begge Panc1 og CD18 celler. Siden våre in vitro kulturer etablere HMGA2 regulering av histon H3K9 og H3K27 acetylering, vi neste undersøkt i hvilken grad menneske PDAC tumorprøver som overuttrykker HMGA2 viser tegn på økt histone H3K9 og H3K27 acetylering. Som vist på fig. 2E, menneskelige PDAC svulster med HMGA2 uttrykk også demonstrert økt histon H3K9 og H3K27 acetylering. Sammenhengen mellom HMGA2 og H3K9 acetylering i vår TMA var statistisk signifikant (p = 0,03), mens sammenhengen mellom HMGA2 og H3K27 acetylering tendert mot signifikans (p = 0,10).
A
. Panc1 og CD18-celler ble dyrket i vevskultur plast eller tre-dimensjonale kollagen-geler i 24 timer og immunoblottet for HMGA2. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
B Anmeldelser –
D
. Panc1 og CD18-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller med 2 forskjellige HMGA2 sirnas, fikk komme seg over natten og deretter innleiret i tre-dimensjonal kollagen i 24 timer. Lysates ble deretter immunoblottet for HMGA2 (
B
), histon H3K9Ac (
C
) og histon H3K27Ac (
D
) ved hjelp av α-tubulin som lasting kontroll. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
E
. Menneskelig bukspyttkjertelen TMA ble immunostained for HMGA2 (
venstre
), histon H3K9Ac (
midten
) og histon H3K27Ac (
midt
).
F
. Forholdet mellom HMGA2 og histon H3K9Ac eller H3K27Ac ble vurdert ved Fishers eksakte test.
HMGA2 regulerer kollagen-indusert p300, PCAF og GCN5 HAT uttrykk
Vi neste undersøkt effekten av tre dimensjonale kollagen gels på p300, PCAF og GCN5 hatter i Panc1 og CD18 celler. Som beskrevet ovenfor, er p300 HAT vanligvis involvert i global H3K27 acetylering og GCN5 og PCAF hatter funksjon for å regulere globale H3K9 acetylering [22], [25]. PDAC celler i tredimensjonale kollagen gels demonstrere økt uttrykk av p300, PCAF og GCN5 Hatter (Fig. 3A). For å demonstrere at disse hatter faktisk mekle kollagen-indusert H3K9 og H3K27 acetylering i PDAC celler, p300, ble PCAF og GCN5 uttrykk nedregulert ved hjelp av kombinasjonen av tre forskjellige siRNAs i Panc1 og CD18-celler (fig. 3B), og effekten på H3K9 og H3K27 acetylering ble bestemt. Kombinasjonen av siRNAs mot P300, PCAF og GCN5 redusert kollagen-indusert histon H3K9 og H3K27 acetylering i begge Panc1 og CD18-celler (fig. 3C og 3D).
A
. Panc1 og CD18-celler ble dyrket i vevskultur plast eller i tredimensjonale kollagen-geler i 24 timer. Cellene ble lysert og immunoblottet for p300, PCAF og GCN5 histone acetyltrasferases (HATS) ved hjelp av α-tubulin som lasting kontroll. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter
B Z –
D
. Panc1 og CD18 celler ble transfektert med kontroll siRNA eller med kombinasjon av siRNAs mot P300, PCAF og GCN5 (HAT siRNA); tillates å komme seg over natten og deretter innleiret i tre-dimensjonale kollagen-geler i 24 timer. Lysatene ble immunblottet for de tilsvarende HAT proteiner (
B
), og histon H3K9Ac (
C
) og H3K27Ac (
D
). Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
E, F
. Panc1 og CD18 celler ble transfektert med kontroll siRNA eller med individuelle siRNAs mot p300, PCAF og GCN5; tillates å komme seg over natten og deretter innleiret i tre-dimensjonale kollagen-geler i 24 timer. Lysatene ble immunblottet for histon H3K9Ac (
E
) og H3K27Ac (
F
). Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Vi har i tillegg undersøkt hvor stor andel av P300, GCN5 og PCAF på histone acetylering ved hjelp av individuelle sirnas heller enn å kombinere alle tre sirnas. Som vist på fig. 3E, transfeksjon av individuelle siRNAs mot p300, PCAF eller GCN5 redusert histon H3K9 acetylering i Panc1 celler. Men transfeksjon av de enkelte HAT sirnas i CD18 celler hadde minimal effekt eller paradoksalt økt histon H3K9 acetylering i CD18 celler. Transfeksjon av GCN5 siRNA eller PCAF siRNA i CD18 celler økte histone H3K9 acetylering. Interessant, det ble nylig vist at det er økt histon H3K9 acetylering i PCAF-null og GCN5-null mus embryonale fibroblaster [25]. Tilsvarende effekt på histon H3K27 acetylering ble enten minimal eller økt etter transfeksjon av enten GCN5 siRNA eller PCAF siRNA (fig. 3F). Men transfeksjon med p300 siRNA redusert histon H3K27 acetylering både CD18 og Panc1 celler.
Siden vi vise at HMGA2 regulerer kollagen-indusert histon H3K9 og H3K27 acetylering (fig. 2), vi undersøkt i hvilken grad HMGA2 også formidlet kollagen-indusert p300, PCAF og GCN5 uttrykk. Som vist på fig. 4, redusert HMGA2 siRNA p300, PCAF og GCN5 nivåer i både Panc1 og CD18 celler dyrket i 3D kollagen.
Panc1 og CD18 celler ble transfektert med kontroll siRNA eller med 2 forskjellige HMGA2 sirnas, lov til å komme seg over natten og deretter belagt i tredimensjonale kollagen gels for ytterligere 24 timer. Lysatene ble deretter analysert for p300 (
A
), PCAF (
B
) og GCN5 (
C
) hatter bruker α-tubulin som lasting kontroll. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
PDAC celler i tredimensjonale kollagen gels er beskyttet mot gemcitabin
Vi har tidligere vist at PDAC celler i tredimensjonale kollagen gels var beskyttet mot virkningene av gemcitabin og fortsetter å spre [6]. Således undersøkte vi effekten av kollagen på CD18-celler etter behandling gemcitabin. CD18-celler på plast eller i tredimensjonale kollagen geler ble behandlet med gemcitabin i 24 timer og deretter trypsinert eller utsettes for kollagenase ekstraksjon. Cellene ble deretter utsådd på plast eller tre-dimensjonale kollagen geler, og evnen av cellene til å danne kolonier ble undersøkt ved 5 dager. Omtrent 5% av CD18-celler på plast ble behandlet med gemcitabin skjema flercellede kolonier i forhold til ubehandlede celler (fig. 5A). I motsetning til dette, som er større enn 50% av CD18-celler i tredimensjonale kollagen geler som ble behandlet med gemcitabin danne kolonier (fig. 5A).
A
. CD18-celler dyrket på plast eller tre-dimensjonale kollagen geler ble etterlatt ubehandlet eller behandlet med gemcitabin i 24 timer. Cellene ble så trypsinert og ekstrahert ut av kollagen ved kollagenase behandling. Cellene ble utsådd på vevskultur plast eller tre-dimensjonale kollagen geler ved lav tetthet (
venstre
). Cellene ble fotografert 5 dager senere og telles (
midt
). **, P 0,001. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
B, C
. CD18 celler ble transfektert med kontroll siRNA, HMGA2 siRNA (
B
) eller kombinasjon av siRNAs mot PCAF, GCN5 og p300 (
C
), lov til å komme seg over natten og deretter belagt i kollagen gels for 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med gemcitabin i 24 timer, ekstrahert ut av kollagen ved kollagenase behandling og deretter utsådd i tredimensjonale kollagen geler ved lav tetthet. Cellene ble fotografert 5 dager senere og telles. *, P 0,05. Resultatene er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter.
HMGA2 og hatter megle beskyttelse mot gemcitabin i tredimensjonale kollagen gels
Som vi tidligere hadde vist at HMGA2 siRNA redusert spredning av PDAC celler i tredimensjonale kollagen gels følgende gemcitabin behandling [6], undersøkte vi effekten av HMGA2 siRNA på PDAC celler i kollagen følgende gemcitabin behandling. CD18-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller HMGA2 siRNA, og behandlet med gemcitabin i 24 timer under veksten i tredimensjonale kollagen geler. Cellene ble deretter ekstrahert ut av kollagen og utsådd i kollagen ved en lav tetthet i ytterligere 5 dager. CD18-celler transfektert med HMGA2 siRNA viser redusert antall kolonier sammenlignet med CD18-celler transfektert med (fig. 5B) kontroll siRNA. Tilsvarende undersøkte vi effekten av siRNAs mot p300, PCAF og GCN5 hatter på PDAC celler i tredimensjonale kollagen gels følgende gemcitabin behandling. Som vist på fig. 5C, CD18 celler transfektert med p300, PCAF og GCN5 HAT sirnas viser også redusert antall kolonier i forhold til CD18-celler transfektert med kontroll siRNA.
Diskusjoner
kollagenrike svulsten mikromiljøet spiller en avgjørende rolle i PDAC progresjon av begge fremmer både tumorinvasjon og metastase og beskytte cancerceller mot kjemoterapi [4], [29]. Den begrenser ikke bare levering av kjemoterapi til kreftceller [7], men den aktiverer også signalveier som begrenser effekten av kjemoterapi [6], [7], [8], [9]. Tidligere hadde vi publiserte at induksjon av HMGA2 uttrykk i tredimensjonale kollagen lov PDAC celler til å overvinne virkningen av cellegift og fortsetter å spre [6]. Interessant, hmga proteiner ble nylig vist å øke ekspresjonen av ataxia-telangiectasia mutated (ATM), den viktigste cellulære sensor av genotoksiske stress, for derved å øke motstanden mot DNA-skadende midler [30]. I denne rapporten viser vi at HMGA2 kan også regulere uttrykket av P300, PCAF og GCN5 hatter i tredimensjonale kollagen gels å begrense effekten av gemcitabin.
Selv om vi ikke undersøke om HMGA2 bindes direkte til HAT promotorer for å regulere ekspresjonen, HMGA2, ved å virke som en global kromatin bryter, har vist seg å regulere 1,000 gener [31]. Noen av disse genene reguleres av HMGA2 ved direkte binding til promotorsekvenser. For eksempel regulerer HMGA2 hTERT ekspresjon ved binding til hTERT-promoteren og forårsaker redusert belegg av HDAC2 på hTERT-promotoren [32]. Dette fører til en lokal økning i histon H3K9 acetylering og transkripsjon modulering av hTERT [32]. Imidlertid har andre studier vist at HMGA2 indirekte kan påvirke genekspresjon gjennom aktivering av signalveier, for eksempel induksjon av PI3K /Akt /mTOR /p70S6K signalkaskade følgende overekspresjon av HMGA2 i stromale celler [33]. Vi har tidligere vist at HMGA2 fremmer ERK1 /2-signalisering i kreft i bukspyttkjertelen celler i 3D kollagen [6]. Videre har vi funnet at ERK1 /2 signalisering kan også formidle kollagen-indusert HAT uttrykk (Dangi-Garimella S. og Munshi H.G., upublisert observasjon). Dermed er det mulig at HMGA2 regulering av hatter i tredimensjonale kollagen er formidlet gjennom ERK1 /2 signalisering.
Vi viser at de økte P300, GCN5 og PCAF HAT uttrykk i 3D kollagen fremmer histon H3K9 og H3K27 acetylering . Viktigere er histon H3K9 og H3K27 acetylering stort sett plassert på transkripsjonsstartsider og er beriket på arrangører av aktivt transkriberte gener [16], [18], og dermed endringer i histon H3K9 og histon H3K27 kan ha brede og dyptgripende virkninger på genekspresjon og cellular atferd. Det er mulig at kollagen mikromiljøet, kan også modulere acetylering av andre lysinrester. Imidlertid har det vist seg at GCN5 og PCAF er overflødig og er spesielt nødvendig for histon H3K9 acetylering i fibroblaster [25]. PCAF-null fibroblaster har bevaring av histon H3K9 acetylering og demonstrere reduksjon i histone H3K9 acetylering bare når GCN5 er slått ned i disse fibroblaster [25]. Interessant, forfatterne overbevisende måte viser at GCN5 kan acetylere histon H3K14 i en in vitro analyse, men ingen forandring i histon H3K14 acetylering ble påvist når PCAF og GCN5 ble slått ned in vivo [25]. Videre gjorde downregulating p300 ikke påvirke histon H3K14 acetylering in vivo, men hovedsakelig redusert histone K3K27 acetylering [25]. Det er også mulig at endringene i histon H3K9 og H3K27 acetylering kan skyldes undertrykkelse av histone deacetylases (HDACs) i tredimensjonale kollagen. HDAC1 og HDAC7 er økt i menneskelige pankreastumorer forhold til normalt vev [34], [35]. Videre uttrykk for medlemmer av klasse I HDACs i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer er økt sammenlignet med normale HPDE celler [36]. I fremtidige studier vil vi undersøke om kollagen mikromiljøet modulerer uttrykk for HDACs i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer.
Betydelig, viser vi at hatter bidra til cellegift-motstand i tre-dimensjonal kollagen. P300 HAT har vist seg å være involvert i DNA-skade reaksjon ved modulering av ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ) reparere [27]. Redusere aktiviteten eller uttrykk for p300 HAT undertrykker NHEJ, svekker dobbel tråd pause (DSB) reparasjon og sensitizes lungekreftceller for stråling og kjemoterapi [27]. P300 HAT er nødvendig for acetylering av histoner på DSB sin til rette kromatin avslapping og eventuell DNA-reparasjon [27]. I tillegg stimulerer GCN5 atom excision reparasjon ved å fremme H3K9 acetylering og kromatin avslapning på nettstedene til skade [28]. Viktigere er det å bli stadig mer anerkjent som den kromatin staten kan påvirke cellulær respons på kjemoterapi. Selv om mer kompakt heterochromatin kan begrense omfanget av den opprinnelige DNA-skade [37], kan det også begrense tilgangen til DNA reparasjons proteiner. DNA-reparasjon etter eksponering for kreftfremkallende er mindre effektiv i heterochromatic regioner i forhold til de mindre kompakte euchromatic regioner [38]. I samsvar med den modell der heterochromatin begrenser tilgangen til proteiner involvert i DNA-reparasjon, behandling med HDAC hemmer trichostatin fremmet eukromatin dannelse og økt DNA skade respons i brystkreftceller [39].
Selv om vi har ikke undersøkt effekten av målretting hatter in vivo, våre funn sterkt at målretting hatter vil tillate oss å øke effekten av kjemoterapi i musemodeller av kreft i bukspyttkjertelen og hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Dette støttes også av funnene at en mer åpen kromatin staten i PDAC vevsprøver kan være assosiert med dårligere prognose [14], [15]. Selv om flere HDAC-inhibitorer er blitt beskrevet og omfattende studert i progresjon av kreft [40], [41], [42], bare et begrenset antall av HAT-inhibitorer har blitt utviklet [22]. Dessuten er det viktig å merke seg at PDAC pasienter behandlet med HDAC hemmer CI-994 og gemcitabin viste ikke økt responsrate sammenlignet med gemcitabin alene [43]. De første syntetiske HAT-hemmere vist seg å være effektiv i å blokkere HAT-aktivitet in vitro; Men deres anvendelse er begrenset ved lav metabolsk stabilitet og dårlig cellulær permeabilitet. Bruken av naturlig forekommende HAT-inhibitor anacardic syre ble også begrenset av dårlig cellulær permeabilitet [44]. Selv om naturlig forekommende forbindelser curcumin og garcinol har vist seg å være effektive HAT-inhibitorer in vitro og in vivo [22], de viser også betydelige ikke-spesifikk aktivitet. Nylig ble forbindelsen C646 designet av virtuelle ligand screening og ble vist å være en potent, meget selektiv, permeabel celle lite molekyl p300 HAT-inhibitor [45]. Den C646 inhibitoren hemmer intracellulær histon acetylering og forsinker veksten av kreftceller in vitro [45], [46]; Imidlertid har effektiviteten av C646 i animalske og humane studier ikke vært rapportert.
Samlet viser vi at kollagen mikromiljøet in vitro begrenser effektiviteten av gemcitabin gjennom HMGA2-avhengige HAT-ekspresjon (Fig. 6). Vi viser også at HMGA2 uttrykk er forbundet med histone acetylering i humane PDAC svulster, spesielt i områder med fibrose, noe som tyder på at det uttales fibrotisk reaksjon kan bidra til kjemoterapi motstand gjennom økt HMGA2-HAT signalering. Gitt at svært lite fremgang har blitt gjort i behandling av kreft i bukspyttkjertelen, målretting hatter kunne være en ny tilnærming til bevisst pankreastumorer til kjemoterapi.
Tidligere har vi hadde publisert at kollagen mikro indusert HMGA2 uttrykk [Dangi- Garimella S et al, [6]]. Vi viser nå at PDAC celler i kollagen mikro indusere HMGA2 avhengig HAT uttrykk og histon H3 acetylering, noe som tyder på at kollagen mikromiljøet fremmer eukromatin formasjon. Denne signalveien gjør PDAC celler til å motstå virkningene av gemcitabin i kollagen mikromiljøet.
Materialer og metoder
Kjemi /reagenser
GCN5 (sc-20698) , PCAF (sc-13124), og α-tubulin (sc-8035) antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA); P300 (05-257), histon H3K9 acetylering (04-1003), og histon H3K27 acetylering (05-1334) antistoffer ble oppnådd fra Millipore (Billerica, MA); og HMGA2 antistoff var fra Biocheck Inc. (Foster City, CA). Sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Type I kollagen ble oppnådd fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Gemcitabin ble hentet fra Eli Lilly (Indianapolis, IN). Nucleofector electroporation kit ble kjøpt fra Lonza (Walkers, MD). HMGA2 # 1 (279 254), HMGA2 # 2 (279 255), GCN5 (s5659), PCAF (s16894), og p300 (s4696) sirnas ble kjøpt fra Life Technologies (Carlsbad, CA).
Immunohistochemistry (IHC )
pankreasvevet mikromatriser (TMA) ble oppnådd fra US Biomaks (Rockville, MD) og besto av 24 bukspyttkjertelen kjerner som måler 1,5 mm i diameter og 5 um i tykkelse. Glassene ble Trichrome farget eller flekket for H3K9 acetylering, H3K27 acetylering, og HMGA2 i henhold til standardprosedyrer IHC [5], [6], [47]. Farget prøver ble gradert på en skala fra 0-3 med følgende poengsystem: 0-0% av cellene farget; 1- 25%; 2-26-50%, eller 3 . 50%
Cell kultur
Panc1 og CD18 /HPAF-II ble oppnådd fra ATCC (Manassas, Virginia). Celler ble opprettholdt i DMEM inneholdende 10% FBS og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) [6]. Cellene ble testet ved STR profilering ved Johns Hopkins genetiske ressurser Kjerne Facility og viste en tilsvarende profil som på ATCC nettstedet.
Inkludering celler i tredimensjonal type I kollagen gels
Kollagen blandingen (2 mg /ml) ble fremstilt ved tilsetning av de riktige mengder sterilt vann, 10X DMEM og NaOH og holdt på is inntil det er behov [6], [48], [49]. PDAC Cellene ble suspendert i kollagen løsning og tillates å gelere i 15 minutter ved 37 ° C. Regelmessig media ble deretter lagt på toppen av gelen og inkubert i 24 timer.
Transfeksjon
Celler ble transfektert med siRNA mot HMGA2, GCN5, PCAF, p300 eller kontrollere siRNA (50 nmol) ved hjelp Nucleofector Kit R (Lonza), fikk komme seg over natten og deretter belagt i tre-dimensjonale kollagen-geler (2 mg /ml).
Immunoblotting
Immunoblotting ble utført som beskrevet tidligere [5], [50]. For celler dyrket i kollagen ble matrisen først oppløst i kollagenase (Worthington Biologicals, Lakewood, NJ), og deretter lysert som tidligere beskrevet [6], [51].
kolonidannende analyse
CD18-celler i vevskultur plastmateriale eller av tre-dimensjonale kollagen geler ble behandlet med gemcitabin. Tjuefire timer senere ble cellene trypsinisert og ekstrahert ut av kollagen, og deretter på ny sådd ut på vevskultur plast eller tre-dimensjonale kollagen geler ved en lav tetthet. Cellene ble fotografert 5 dager senere og telles.
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført med GraphPad INSTAT (LaJolla, CA), ved hjelp av t-test analyse eller Fishers eksakte test.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Effekt av 2D kollagen på histon H3K9 og histon H3K27 acetylering.
A, B
. Panc1 og CD18-celler ble dyrket i vevskultur plast eller på kollagen-belagte vevskulturplater (BD BioCoat Collagen I) i 24 timer. Cellene ble lysert og immunoblottet for histon H3K9Ac og H3K27Ac bruker α-tubulin som lasting kontroll. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0064566.s001 plakater (TIF)
