Abstract
aktiverende mutasjoner i
BRAF
genet fører til konstitutiv aktivering av MAPK veien. Selv om mange menneske kreft bære muterte
BRAF
genet, denne mutasjonen har ennå ikke blitt karakterisert ved hjørnetann kreft. Som menneskelige og hjørnetann kreft dele molekylære forandringer, hypotese vi at
BRAF
genmutasjoner også eksisterer i hjørnetann kreft. For å teste denne hypotesen, sekvensert vi ekson 15 av
BRAF
, mutasjon hot spot av genet, i 667 canine primære svulster og 38 kontroll vev. Sekvense analyse viste at en enkelt nukleotid T til A transversjon ved nukleotid 1349 forekom hos 64 primære tumorer (9,6%), med spesielt høy frekvens i prostatakarsinom (20/25, 80%) og urothelial karsinom (30/45, 67%) . Denne mutasjonen fører til aminosyre substitusjon av glutaminsyre for valin i kodon 450 (V450E) av canine
BRAF
, som svarer til den mest vanlige
BRAF
mutasjon i human kreft, V600E. Den evolutional bevaring av
BRAF
V600E mutasjon fremhever betydningen av MAPK veien aktivering i neoplasi og kan gi mulighet for molekylær diagnostikk og målrettet terapi for hunder som bærer
BRAF
-mutated kreft.
Citation: Mochizuki H, Kennedy K, Shapiro SG, Breen M (2015) BRAF mutasjoner i Canine kreft. PLoS ONE 10 (6): e0129534. doi: 10,1371 /journal.pone.0129534
Academic Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 6 april 2015; Godkjent: 11 mai 2015; Publisert: 08.06.2015
Copyright: © 2015 Mochizuki et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av North Carolina State University (NCSU) Cancer Genomics Fund (MB)
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
RAF proteiner er evolusjonære konservert serin /treonin kinaser som regulerer grunnleggende cellulære prosesser, inkludert vekst, differensiering og overlevelse. RAF-familien består av tre medlemmer: Araf, BRAF og CRAF. Alle RAF proteiner blir aktivert av RAS og deretter aktiverer MEK, initiere signaltransduksjon kaskade av MAPK-reaksjonsveien. Konstitutiv aktivering av MAPK veien forårsaket av onkogene mutasjoner av
RAF
gener resulterer i unormal spredning og differensiering. Blant de tre former for
RAF
gener,
BRAF
genet er hyppigst mutert i menneskelig kreft [1-3]
Den vanligste. ( 90%) somatisk mutasjon av det humane
BRAF genet
er en T-til-A transversjon i exon 15 ved nukleotid 1799 (c.1799T A), som resulterer i aminosyresubstitusjoner fra valin til glutaminsyre i kodon 600 ( V600E) [2]. Den V600E mutasjon skjer innen aktivering segment av genet og etterligner fosforylering, drastisk heve kinaseaktivitet og aktivering av nedstrømssignalet [3,4]. Det aktiverende mutasjon er blitt rapportert i melanom (~ 60%) [4,5], skjoldbruskkjertelkreft (20-40%) [6-9], hårete-celle leukemi (~ 100%) [10], og mange andre kreftformer med variabel frekvens. Sammen med hyppige mutasjoner av
RAS
gener, tilstedeværelse av
BRAF
mutasjoner i et bredt spekter av kreft hos mennesker understreker viktigheten av MAPK veien aktivering som en felles onkogen molekylær vei.
Hunder utvikler spontane kreft med mange likhetstrekk med menneskelige kreftformer, inkludert anatomisk plassering, histologisk utseende og terapeutisk respons. Kreft hos hunder deler ikke bare biologiske atferd med mennesker, men også molekylære forandringer [11,12]. Siden aktivering
BRAF mutasjoner
er til stede i et bredt utvalg av human cancer, en hypotese om at vi
BRAF
genmutasjoner er på lignende måte involvert i canine kreft, fører til hyperactivation av MAPK-reaksjonsveien og celletransformasjon. For å teste denne hypotesen, vi screenet for tilstedeværelse av
BRAF
exon 15 mutasjoner i en kohort av 667 patologisk bekreftet canine vevsprøver, som består av en serie av hematopoetiske tumorer (n = 245), sarkomer (n = 160) , karsinom (n = 115), melanocyttisk tumor (n = 72), så vel som andre, mindre vanlige kreft (n = 75).
Materialer og metoder
Frisk og formalinfikserte vevsprøver av ulike canine solide svulster og EDTA blodprøver fra hjørnetann leukemi tilfeller, ble sendt fra klienteide kjæledyr hunder (med informert eieren samtykke) av private veterinærpraksis i hele USA som en del av rutinemessige diagnostiske prosedyrer (ingen IACUC nødvendig). Andre vevsprøver ble rekruttert via North Carolina State University (NCSU) Kliniske studier Core, hver med informert eieren samtykke og etter en NCSU IACUC godkjent protokoll (godkjenningsnummer 13-022-O), som dekket prosedyren brukes til å få prøvene og deres påfølgende bruk for forskning søknad. Hematoxylin og eosin-farget lysbilder av formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) prøver ble anmeldt av en bord-sertifisert veterinær patolog og bekreftet neoplastiske i alt, men leukemi prøver. Leukemi diagnoser var basert på evaluering av cytologisk og immunophenotypical undersøkelse av leukemiske celler ved et bord-sertifisert klinisk patolog.
Genomisk DNA ble isolert fra friske vev /blodprøver eller FFPE- vev. Totalt 667 tumorprøver ble inkludert i denne studien. Detaljer angående prøve populasjonen er vist i tabellene 1 og 2. DNA ble isolert ved anvendelse av en QIAamp FFPE DNA-ekstraksjon kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) eller en DNeasy blod og vev Kit (Qiagen). Spektrofotometri (Nanodrop, Thermo Scientific, Wilmington, DE) og agarosegel-elektroforese ble anvendt for å bestemme DNA-mengde og integritet. For ikke-neoplastiske kontroller (n = 38), ble DNA isolert fra hund blære epitel av 30 hunder og prostata kjertler 8 hunder, oppnådd ved obduksjon uten tegn til neoplastiske endringer ved histopatologiske evaluering.
Exon 15 av menneske
BRAF
genet evolutionally konservert mellom hunder og mennesker (fig 1). Dermed ble PCR forsterkning utført for å forsterke et 391 bp DNA fragment som spenner over genomisk canine
BRAF
sekvens som tilsvarer menneskelig
BRAF
genet ekson 15 (CanFam3.1, canine kromosom (CFA) 16 : 8,296,227-8,296,345). Følgende primerpar er designet ved hjelp Primer-BLAST programvare (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/): fremover, AAGCAGGTCACATATGCCAAA (CFA 16: 8,296,007-8,296,027); revers, ATTTTTGGACCCTGAGGTGC (CFA 16: 8,296,378-8,296,397). Hver PCR-reaksjon inneholdt 10-20 ng genomisk DNA, 250 nM av forover og bakover primer og 1 x Taq RED Master Mix Kit (Genesee Scientific, San Diego, CA, USA). PCR-sykluser som består av opprinnelig denaturering av 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s med en avsluttende forlengelsestrinn ved 95 ° C i fem min. PCR-produkter ble visualisert ved hjelp av agarosegel-elektroforese og utsatt for målrettet Sanger-sekvensering analyse med forover- og /eller revers primere. Sekvensanalyse ble utført ved North Carolina State University Genome Research Laboratory (https://research.ncsu.edu/gsl/). De sekvense data ble analysert ved hjelp 4peaks programvare (https://nucleobytes.com/index.php/4peaks) og sammenlignet med referansesekvensen (XM_005629550.1) med CLC Sequence Viewer versjon 7 (CLC bio, Aarthus, Danmark).
sekvensene er høyt konservert mellom menneske og hund, inkludert valin i kodon 600 i menneskelig BRAF (understreket) og ved kodon 450 i canine BRAF.
Fishers eksakte test ble utført for å undersøke forskjell på
BRAF
mutasjonsfrekvenser mellom grupper stratifisert etter kjønn, kastrering status, alder eller raser. Alle statistiske analyser ble utført med JMP Pro versjon 11 (SAS Institute, Cary, NC). Verdier for P 0,05 ble betraktet som signifikant.
Diskusjon
Resultater og
For å undersøke tilstedeværelsen av
BRAF
mutasjoner, vi sekvensert
BRAF
genet ekson 15 i 667 primærtumor prøver og prøver 38 kontroll vev. Sekvensanalyse avslørte en T til A transversjon ved nukleotid 1349 (c.1349T A, referanse: XM_005629550.1) som har oppstått i 64 primære svulster, noe som resulterer i aminosyresubstitusjoner fra valin til glutaminsyre i kodon 450 (V450E) (Fig 2). Dette aminosyreforandring tilsvarer den humane V600E mutasjon (figur 1). Betydelig variasjon eksisterer i frekvensen til det V450E mutasjon på tvers av canine cancere: 0% i hematopoetiske tumorer og sarkomer til 67% og 80% av urothelial karsinom (UC) og prostatisk karsinom (PC), henholdsvis (tabell 3). I alle V600E mutanter, electropherograms indikerte tilstedeværelse av både muterte og villtype-sekvenser, noe som tyder mutasjon heterozygositet. Det var ingen statistisk signifikant forskjell i mutasjonsfrekvens mellom ulike grupper av kastrering status, alder eller raser i UC og PC-prøver og mellom mutasjonsstatus og kjønn i UC prøver. Detaljer om signalments av hunder med UC og PC er vist i S1 tabell.
(A) Wild-type sekvens hentet fra en kontroll prostatakjertel DNA. (B) Mutert sekvens blandes med villtype sekvens erholdt fra en prostatakarsinom. Pilen angir T-til-A nukleotidsubstitusjon resulterer i endring av valin i kodon 450 til glutaminsyre.
I tillegg til den V450E mutasjon, en T-til-C overgang ved nukleotid 1305 (c.1305T C, stille mutasjon) ble observert i en muntlig plateepitelkarsinom prøven. En intronic sletting av T (c.1292-189delT) ble observert i en hver av bløtvevssarkom og melanom prøver. Alle andre svulst og kontrollprøver opprettholdt villtype genomisk sekvens for
BRAF
exon 15.
konstitutiv aktivering av MAPK signal ved å aktivere mutasjoner av
BRAF plakater (~ 60%) eller
NRAS plakater (~ 15%) gener spiller en viktig rolle i patogenesen av menneskelig melanom [4,5,11,12]. Tilsvarende er konstitutiv aktivering av MAPK veien innblandet i canine melanom [13,14], selv om
RAS
gener ble sjelden mutert [14-16]. I denne studien, men bare 6% av melanomer (to slimhinnene og en kutan melanom) og 17% av melanocytomas næret
BRAF
V450E mutasjon. Denne mutasjonen ble ikke identifisert i tidligere studier av canine melanom [13,17], sannsynligvis på grunn av den lave frekvensen av
BRAF
mutasjon i canine melanom. I human melanom, nærværet av
BRAF
mutasjon er assosiert med hud eksponering for UV-lys, og melanomer på slimhinne områder eller ikke-UV-eksponert hud sjelden har mutasjonen [18,19]. Som hund melanom forekommer hovedsakelig på munnslimhinnen og sjelden på spiker senger og ikke-UV-eksponerte pels hud, det faktum at
er BRAF
mutert sjelden i canine melanom er i tråd med funn i menneskelige motstykker.
Interessant, canine UC viste mye høyere frekvens av
BRAF
mutasjon enn det som er rapportert til i menneskelige UC svulster [20]. Mutasjoner i gener oppstrøms av MAPK vei, inkludert
HRAS
,
KRAS Hotell og
FGFR3
gener (som alle er oppstrøms molekyler av BRAF i MAPK-veien), ble funnet i 82% av menneskelig papillær UC, tyder på at aktivering av veien er en viktig drivende faktor for underklassen av menneskelig UC [21,22]. Selv om de muterte molekyler i reaksjonsveien kan være forskjellig mellom human hjørnetann og UC, den høye frekvensen av
BRAF
mutasjon i hjørnetann UC antyder at dysregulering av MAPK-reaksjonsveien kan spille en viktig rolle i patogenesen av sykdommen.
Canine PC er preget av høy metastatisk potensial og lokal invasivitet, men faktorer som bidrar til aggressiv biologisk atferd er fortsatt i stor grad ukjent [23]. Selv
BRAF
V600E mutasjoner er sjeldne hos mennesker [24-26], samler bevis tyder på at MAPK pathway spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av menneskelig PC, spesielt i metastatiske svulster [27]. Somatiske mutasjoner av
RAS
gener og kopiere antall gevinster på
BRAF Hotell og
CRAF
genene er observert i menneskelige PC på frekvenser av ~ 10, 30% og 15%, henholdsvis [24-27]. Disse genomiske forandringer fører til aktivering og /eller økt uttrykk for RAF-proteiner, noe som resulterer i aktivering av nedstrøms signalisering og øker metastatiske egenskaper [26-28]. I tillegg tilbakevendende translokasjon involverer
RAS Hotell og
RAF
gener, noe som resulterer i onkogene fusjonsgener, ble nylig oppdaget i en undergruppe (~ 5%) av menneskelige PC tilfeller [29,30] .
En unik funksjon i hjørnetann PC er at flertallet av svulstene oppstår i androgen-uavhengig måte, med økt risiko hos kastrerte hunder [23]. På den annen side er hormon-deprivasjonsterapi en bærebjelke for behandling av humant PC, som androgen spiller en avgjørende rolle i patogenesen. De fleste av menneskelig PC imidlertid utvikle seg til en mer aggressiv, hormon-ildfast (kastrering-resistente) kreft i løpet av det kliniske kurset. Aktivering av BRAF /MAPK signal får menneskelig PC tumorceller mindre avhengig av androgen for spredning
in vivo Hotell og
in vitro
, bidrar til hormon-ildfast fenotype [31]. Den høye forekomsten av
BRAF
mutasjon og aggressive natur canine PC kan gjenspeile det faktum at de fleste hunde PC utvikle uavhengig av androgen stimulering. Disse kliniske og molekylære likheter kan gjøre hunden PC fungere som en spontant forekommende dyre kreft modell relevant for hormon-ildfast human PC.
Nyere avansement i molekylær teknologi gjort oss i stand til å oppdage sirkulerende tumorceller i væskeprøver som perifert blod. Påvisning av
BRAF mutasjoner
kan brukes som et middel for å diagnostisere og overvåke tumorbelastning i væskeprøver, slik som blod eller urin, uten å nødvendiggjøre biopsi av tumorer (kalt flytende biopsi, gjennomgått i [32,33] ). Selv histopatologisk undersøkelse av en svulst biopsi er gullstandarden for diagnostisering av canine UC og PC, anatomiske plasseringen av disse svulstene ofte gjør det vanskelig å få tilstrekkelig mengde av vev til å diagnostisere. I tillegg kan klinikere og eiere motet fra å velge denne diagnostiske workup grunn av kostnadene og invasive prosedyrer i forbindelse med biopsi. Derfor tilgang til en ikke-invasiv måte å diagnostisere disse kreftformene er et udekket behov. Den høye
BRAF
mutasjonsraten i disse svulstene gjør BRAF V450E mutasjon en diagnostisk markør for berørte kreft.
Identifiseringen av
BRAF
mutasjon i hjørnetann kreft øker mulighetene at behandling rettet mot konstitutivt-aktivert MAPK veien kan gi en klinisk nytte for de som bærer den
BRAF
V450E mutasjon, spesielt UC og PC-pasienter. Nylig, vemurafenib og dabrafenib, selektive BRAF-hemmere, bedre kliniske resultater i pasienter med melanom sammenlignet med konvensjonell kjemoterapi [34,35]. Disse BRAF-hemmere har også vist terapeutiske potensialer i andre svulster husing
BRAF
mutasjoner [36-38]. Foreløpig behandlingstilbud for hunder med UC og PC har begrenset effekt. Gitt effektiviteten av BRAF /MAPK-rettet behandling i kreft hos mennesker, kan BRAF og MAPK trasé være lovende terapeutiske mål for disse canine kreft. Evalueringer av
in vitro Hotell og
in vivo
effekter av BRAF-hemmere hos hunder er garantert i den kliniske anvendelsen av BRAF-hemmer for hunder som bærer kreft med mutert
BRAF
.
i konklusjonen, identifiserte vi
BRAF
V450E mutasjon i hjørnetann kreft med ulike frekvenser. Hyppig
BRAF
mutasjon i canine UC og PC streker en potensiell rolle MAPK signalveien i patogenesen av disse svulstene og kan tilby diagnostiske og terapeutiske anvendelser for hunder som bærer
BRAF
mutasjoner.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Signalments av hunder diagnostisert med urothelial og prostatakarsinom i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129534.s001 plakater (XLSX)
