Abstract
mykofenolsyre (MPA) er metabolisert produkt og aktivt element av mykofenolatmofetil (MMF) som har blitt mye brukt for forebygging av akutt transplantat avvisning. MPA er en potent hemmer inosinmonofosfatdehydrogenase (IMPDH) som er oppregulert i mange tumorer og MPA er kjent for å hemme kreftcellevekst, så vel som fibroblast og endotelial cellemigrering. I denne studien har vi demonstrert for første gang MPA antimigratory og anti-invasjons evner av MPA-sensitive AGS (mage kreft) celler. Genome-wide uttrykk analyser ved hjelp av Illumina hele genom mikromatriser identifisert 50 gener med ≥2 fold endringer og 15 gener med 4 gangers endringer og flere molekylære reaksjonsveier involvert i cellemigrering. Real-time RT-PCR analyser av utvalgte gener bekreftet også uttrykket forskjeller. Videre analyser målrettet proteomikk identifisert flere proteiner endret av MPA-behandling. Våre resultater indikerer at MPA modulerer magekreft cellevandring gjennom nedregulering av et stort antall gener (
PRKCA
,
DOCK1
,
INF2, HSPA5, LRP8
og
PDGFRA
) og proteiner (PRKCA, AKT, SRC, CD147 og MMP1) med promigratory funksjoner samt oppregulering av en rekke gener med antimigratory funksjoner (
ATF3
,
SMAD3
,
CITED2 Hotell og
CEAMCAM1
). Men noen gener som kan fremme migrasjon (
CYR61 Hotell og
NOS3
) ble oppregulert. Derfor MPA samlede antimigratory rolle på kreftceller er en avveining mellom promigratory og antimigratory signaler påvirket av MPA behandling
Citation. Dun B, Sharma A, Teng Y, Liu H, Purohit S, Xu H et al . (2013) mykofenolsyre hemmer migrasjon og invasjon av magekreft celler via flere molekylære stier. PLoS ONE 8 (11): e81702. doi: 10,1371 /journal.pone.0081702
Redaktør: Ying Xu, University of Georgia, USA
mottatt: 27 juli 2013; Godkjent: 15 oktober 2013; Publisert: 15.11.2013
Copyright: © 2013 Dun et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av midler fra Georgia Regents University. JXS støttes delvis av Georgia Alliansen som en eminent lærd. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de fleste solide tumorer er i stor grad kureres hvis de blir diagnostisert og behandlet før spredning utover den opprinnelige hovednettstedet. Men når svulster spre seg til andre steder, de vanligvis blir svært sykelig og sannsynlig foster. Derfor er det viktig å begrense den initielle utbredelse og forhindre sekundær spredning. Invasjon og metastasering er to store moduser av tumor spredning, hver drevet av ulike mekanismer og fører til ulike terapeutiske utfordringer [1]. Men begge former for formidling krever celle bevegelse fra de primære områder til sekundær plassering samt reetablering og overlevelse av tumorceller i videregående steder. Disse prosessene er gjennomført via en kaskade av molekylære endringer i kreftcellene. Selv om den molekylære mekanismen underliggende cellemigrasjon har blitt grundig studert, kan ny innsikt i de molekylære hendelser gi nye terapeutiske tilnærminger. Faktisk, inhibering av molekylene som fremmer cellemigrering og oppregulering av molekyler som hemmer cellemigrering gjennom farmakologisk intervensjon har blitt en viktig del av de weaponries for å bekjempe kreft. Utvikling eller gjenbruk av flere legemidler som hemmer migrasjon og invasjon er en stor pågående innsats for kreftbehandling.
mykofenolatmofetil (MMF) er godkjent for forebygging av akutte graftavvisning i nyre, hjerte og levertransplantasjon [ ,,,0],2,3]. MMF er morfolinoetylesteren prodrug av mykofenolsyre (MPA), som er en potent inhibitor av udyktig inosinmonofosfatdehydrogenase (IMPDH), det hastighetsbegrensende enzym for
de novo syntese av
guanosine nukleotider [4,5 ], som spiller viktige roller i celleproliferasjon og andre cellulære funksjoner inkludert DNA-replikasjon, RNA og proteinsyntese og cellulær signalisering [6]. Følgelig MPA blokker T- og B-lymfocytt proliferasjon og klonal ekspansjon, og forhindrer dannelsen av cytotoksiske T-celler og andre effektor-T-celler. Andre mekanismer kan også bidra til effektiviteten av MPA til å hindre allograft-avvisning. Gjennom uttømming av guanosine nukleotider, kan MPA undertrykke glykosylering og uttrykk for flere adhesjonsmolekyler, og dermed redusere rekruttering av lymfocytter og monocytter i områder av betennelse og pode avvisning [5].
Siden IMPDH ekspresjon er signifikant oppregulert i mange tumorceller [7,8], er det derfor en potensielt mål for cancerterapi i tillegg til immunsuppressive kjemoterapi. MPA /MMF har blitt rapportert å hemme kreftcellevekst og induserer apoptose i mange kreftceller [9-14]. MPA /MMF har også blitt rapportert å hemme migrering av fibroblastceller [15] og human umbilikalvene endotelceller (HUVECs) [16]. Det er imidlertid ikke kjent hvorvidt MPA kan endre migrering og invasjon kapasitet av kreftceller. Videre presise migrasjon signalveier og effektor molekyler underliggende MPA virksomhet forblir unnvikende.
I denne studien, vi først vist at MPA endrer betydelig migrasjon og invasjon evne AGS celler, og vi så brukt genekspresjon og proteomikk teknologi for å identifisere gener og proteiner som ligger til grunn for disse funksjonene.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP, reagenser og antistoffer
To magekreft cellelinjer (AGS og Hs746T) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Begge cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C med 5% CO2. MPA ble kjøpt fra VWR. Den CD147, inte beta5 antistoff ble kjøpt fra Abcam, GAPDH og ICAM-1antibodies fra Santa Cruz; Src, Akt, og p-Akt (Ser473) antistoffer fra Cell Signaling.
In vitro trans-brønn migrasjon og invasjon analyser
Cell migrasjon ble utført med Transwell (Costar) system, som gjør at cellene til å migrere gjennom 8-mikrometer porestørrelse polykarbonat membran. I korte trekk, ble serum-sultet AGS eller HS746T celler tilsatt til det øvre kammer (5 x 104 celler pr insert) og DMEM-medium med forskjellig konsentrasjon av MPA (1 ug /ml, 1.5μg /ml og 2 ug /ml) ble anvendt som en kjemotiltrekkende i det nedre kammer. Etter inkubering ved 37 ° C i 8 timer ble cellene i det nedre kammer fiksert i metanol og farget med 0,2% krystallfiolett. Tall for de trekkende celler i ni tilfeldig utvalgte felt fra tredoble kamre ble telt i hvert forsøk under et fasekontrastmikroskop. Den invasiv potensial av cellene ble analysert ved hjelp av en Matrigel-belagt modifisert Boyden kammer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) som tidligere beskrevet [17]. DMEM inneholdende MPA ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubering ved 37 ° C i 24 timer ble antall celler som invaderte til den nedre side av det øvre kammer telles.
Micorarray eksperimenter
Totalt RNA ble ekstrahert fra AGS-celler ved anvendelse av en magnatic perler RNA ekstraksjon kit (Jinfiniti biovitenskap, Augusta, Georgia). Genekspresjon profilering ble utført ved hjelp av menneskelig Illumina HumanHT-12 v4 BeadChip (Illumina, San Diego, California). En alikvot på 200 ng total-RNA ble omdannet til dobbeltkjedet cDNA (ds-cDNA) ved hjelp av Illumina TargetAmp-Nano merkingskit med en oligo-dT-primer som inneholder en T7 RNA polymerase promoter (Genset, St. Louis, MO).
In vitro
transkripsjon ble utført på de ovennevnte ds-cDNA ved hjelp av Enzo RNA transkripsjon merking kit. Biotin-merket cRNA ble renset ved hjelp av en RNeasy affinitets-kolonne (Qiagen), og fragmentert tilfeldig til størrelser fra 35-200 baser ved inkubering ved 94 ° C i 35 min. Hybridiserings-løsninger inneholdt 100 mM MES, 1 M Na
+, 20 mM EDTA og 0,01% Tween 20 Sluttkonsentrasjonen av fragmentert cRNA ble 0,05 ug /ul i hybridiseringsoppløsning. Målet for hybridisering ble fremstilt ved å kombinere 40 ul fragmentert transkripsjon med sonikert laksesperm DNA (0,1 mg /ml), BSA og 5nM kontroll-oligonukleotidet i en buffer inneholdende 1,0 M NaCl, 10 mM tris.HCl (pH 7,6), og 0,005 % Triton X-100. Målet ble hybridisert i 16 timer ved 45 ° C i en ovn Illumina hybridisering. Flisen ble deretter vasket ved 50 ° C med strenge oppløsning, deretter igjen ved 30 ° C med ikke-stringente vask. Arrays ble deretter farget med streptavidin-Cy3. Microarray data er MIAME kompatibel og har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE46671.
Real-time RT-PCR-analyse
En porsjon av total RNA ( 2 ug per prøve) ble oppstilt i 96-brønners plater, og deretter omdannet til cDNA ved bruk av en høykapasitets-cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) og et PTC-100 ™ programmerbare termiske kontroller (MJ Research, Inc). CDNA-produkter ble brukt for kvantitativ real-time PCR ved anvendelse av klar-til-bruk TaqMan genekspresjon analysene fra Applied Biosystems. Fem referanse gener med relativt konstant uttrykk (GAPDH, ESD, GUSB, IPO8 og MRPL19) ble brukt til å normalisere RNA konsentrasjon. Real-time PCR ble utført med 96×96 Fluidigm Expression chips. Standard termiske sykluser tilstand (10 minutter ved 95 ° C, 40 sykluser på 15 sek ved 95 ° C, 1 minutt ved 60 ° C) ble brukt for alle gener. Alle prøvene ble analysert på samme plate, og hver prøve ble analysert i duplikat.
Western blotting
Celler ble høstet og resuspendert i PBS. Etter sentrifugering ved 2000rpm i 5 minutter, ble pelleten lysert i iskald M-PER Mammalian Protein Ekstraksjonsreagens inneholdende 1% Halt Protease og fosfatase-hemmer Cocktail (Thermo Scientific) i 30 min. Supernatanten ble oppsamlet etter 10 min sentrifugering ved 12000rpm, utgjorde ved spektrofotometri, denaturert med prøveladningsbuffer i 10 min ved 95ᵒC og lagret ved 4 ° C for fremtidig bruk. Proteiner ble separert ved 10% SDS-polyakrylamidgeler og overført til PVDF-membran (Bio-Rad), og inkubert med primære antistoffer av interesse ved 4 ° C over natten. Den riktige pepperrot-konjugert sekundært antistoff i en fortynning på 1: 10000 i blokkeringsbuffer (3% BSA-TBST) ble tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Alle antistoffer ble fortynnet i 3% BSA-TBST. Immunoblotter ble utviklet ved hjelp av ECL chemiluminescence reagens (Thermo Scientific).
Flow cytometri
Celler ble trypsinert og vasket to ganger i PBS. Omtrent 1×10
6-celler ble inkubert med 1 ug av anti-CD147, anti-ICAM-1 og anti-integrin-beta 5 antistoffer i 30 min, vasket med PBST to ganger, og deretter inkubert med et sekundært antistoff konjugert med TRITC eller APC i 30 min og vasket to ganger med PBST. Flowcytometrisk analyser ble utført på en FACScaliburTM flowcytometer med CELLQuestTM programvare (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).
Luminex analysen
MMP proteiner i kulturmediet ble målt ved hjelp av Luminex kits fra Millipore Company (Rica, MA, USA) i henhold til produsentens anbefaling. Cellekulturmedium (1:10 fortynning) ble inkubert med de antistoff-koplet mikrokuler og deretter med biotinylert deteksjon-antistoff før tilsetning av streptavidin-phycoerythrin. De fangede perle-kompleksene ble målt med FLEXMAP 3D-systemet (Luminex, Austin, TX). Median fluorescens intensitet (MFI) ble samlet inn og brukt til å beregne proteinkonsentrasjoner.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av R språk og miljø for statistisk databehandling (www.r-prosjekt. org). Sammenligningene mellom konsern midler ble gjort av ANOVA (i ≥ 3 grupper) etterfulgt av parvise sammenligninger ved hjelp av Bonferroni post-hoc testing. Den statistiske signifikans av forskjeller ble satt til P 0,05.
lumi pakken ble brukt til å preprocess microarray data. Differensial uttrykk analyser ble utført ved hjelp av limma pakken fra Bioconductor prosjektet [18]. Vi brukte den falske funnraten (FDR) for å justere for flere testing [19]. En kombinasjon av justert p-verdi, og absoluttverdien av gangers endring (FC) ble benyttet for å velge de differensielt uttrykte gener. ble utført
Cluster analyse for å gruppere differensielt uttrykte gener utviser lignende uttrykk mønstre ved hjelp av HPCluster programmet [20]. De Bioconductor pakke «GOstats» ble brukt for å teste sammenslutning av Gene Ontologi termer (biologiske prosesser) til de differensielt uttrykte gener [21] En p-verdi basert på den hypergeometriske testen ble beregnet til å vurdere om antall gener assosiert med begrepet er større enn forventet. P-verdiene oppnådd ble justert for multippel testing med FDR. Genet Listen ble også analysert ved hjelp prebuild KEGG veier. Vi brukte «Spia» (signalveien konsekvensanalyse) pakke for å identifisere trasé påvirket av de observerte endringene i genuttrykk [22]. Nettverksanalyse ble utført for å konstruere molekylære interaksjons nettverk med STRING databasen [23]. Nettverkene ble importert i enkle samspill format til Cytoscape for visualisering [24].
Resultater
MPA hemmer AGS celle migrasjon og invasjon
Den vandrende evne to magekreft cellelinjer (AGS og Hs746T) med og uten MPA behandling ble vurdert ved 8 pm pore Transwell kamre uten matrigel. Som vist i figur 1A, prosentandelene av migrerende AGS-celler ble redusert i et MPA doseavhengig måte, å redusere til mindre enn 50% av kontroll AGS cellene ved konsentrasjoner på 1.5μg /ml. Men den vandrende evne Hs746T celler ble ikke påvirket av MPA i samme konsentrasjoner. Tilsvarende ble celle invasjon analysert ved hjelp av 8 pm pore BioCoat Matrigel 8-mikron invasjons kamre (figur 1B). MPA behandling også betydelig redusert de invaderende evne AGS celler, men ikke Hs746T celler
A:. Bilder av trekkende celler etter behandling med kjøretøy (DMSO) eller annen konsentrasjon av MPA i 24 timer. De gjennomsnittlige relative migrerende celler er vist nederst. B: Bilder av invaderende celler etter behandling med vehikkel (DMSO) eller forskjellig konsentrasjon av MPA i 24 timer. De gjennomsnittlige relative invaderende cellene vises nederst. * P 0,05 i forhold til DMSO kontroll.
MPA-indusert genekspresjon endringer knyttet til kreft celle migrasjon
For å identifisere genene endret av MPA behandling, gjennomførte vi en global transcriptomic profilering eksperiment med AGS celler behandles med MPA. Bruke hele genekspresjon datasettet, identifiserte vi KEGG trasé som er betydelig endret ved MPA. Åtte av de ti vesentlig endret trasé (p53 signal, cellesyklus, trasé i kreft, PPAR signal, blærekreft, protein behandling i akuttmottaket, småcellet lungekreft og MAPK signal) er godt kjent for å være kreftrelatert. De differensielt uttrykte gener ble også kartlagt i Gene Ontologi biologiske prosesser og en hypergeometrisk testen ble utført for å vurdere betydningen av berikelse for hver kategori. Vår analyse indikerte at betydelig beriket genene er involvert i cellesyklus (1,6 fold berikelse, p 10
-5), celledød (1,7 ganger berikelse, p 10
-7), celleproliferasjon (1,8 ganger berikelse, p 10
-7), og cellemigrasjon (1,5 ganger berikelse, p 0,005). De globale genuttrykk dataene er i overensstemmelse med MPA aktivitet ved inhibering av kreftcellevekst, induksjon av apoptose og inhibisjon av migrasjon.
Siden hovedfokus for denne studien er å belyse den molekylære mekanismen bak MPA innvirkning på kreftcellemigrasjon, vi analysert i detalj de 50 migrasjonsrelaterte gener med 2-4 ganger forskjellen og 15 migrasjonsrelaterte gener med 4-gangers forskjell mellom behandlede og ubehandlede AGS-celler (Figur 2). Fire forskjellige grupper av gener er anerkjent. De klynge 1 gener er raskt oppregulert ved 12h tidspunkt og nådde en topp på 24 tidspunkt, men litt nedregulert senere. Klyngen 2 genene er noe økt på 24 tidspunkt, men da blir mer oppregulert på 48h og 72H-enheten tidspunkter. De klynge 3 gener er raskt nedregulert på 12h og 24 timer tidspunkter men nedregulering blir mye mindre på senere tidspunkter, mens cluster 4 genene nedregulert på 24 og senere tidspunkter. De funksjonelle relasjoner mellom disse genene er vist i et gennettverk (figur 3). Deretter vi også vurdert gyldigheten av uttrykket data ved å analysere en undergruppe av kandidat gener ved hjelp av real-time RT-PCR (figur 4). Et annet sett av RNA prøver ble tatt ved forskjellige behandlings tidspunkter (0, 12, 24 og 48 timer etter behandling) fra MPA-sensitive AGS celler og MPA-ufølsomme Hs746T celler.
Heatmap for genene forskjellig uttrykt etter MPA behandling for 0h, 12h, 24h, 48h og 72h. Hver prøve er representert i en kolonne, og hvert gen er representert i en rad. Øket ekspresjon er angitt som rød og redusert ekspresjon er angitt som grønt. Representative genene er vist på høyre panel og gensamlingene er angitt til venstre.
Skap blotter er vist for hvert gen. Relative uttrykk nivåer er vist i loggen to skala. FC (endring) for hvert tidspunkt (12h, 24h og 48h) er sammenlignet med ubehandlede kontroller (0h) med respektive p-verdier.
MPA behandlings alvorlig nedregulert to celleoverflate reseptorgenene (
PDGFRA Hotell og
LRP8
), et protein kinase gen (
PRKCA
), og fem andre gener (
INF2
,
DOCK1
,
HSPA5
,
ARRB1
, og
IGFBP5
) (figur 2). Seks av disse genene ble valgt for RT-PCR bekreftelse og alle seks gener ble bekreftet å være signifikant nedregulert av MPA i AGS-celler som er følsomme overfor MPA (figur 4). Interessant nok har de fleste av disse genene var ikke signifikant nedregulert ved MPA behandling i Hs746T celler som er ufølsom for MPA behandling (figur 4).
Videre MPA behandling av AGS-celler signifikant oppregulert ekspresjon av et stort antall gener involvert i cellemigrering. Syv gener (
ATF3
,
SMAD3
,
CITED2
,
CEAMCAM1
,
CYR61
,
NOS3
og
CDH10
) har mer enn firedoblet forskjell og er uthevet i microarray heatmap (figur 2). Real-time RT-PCR bekreftet at
ATF3
økes med 10-20 folder i AGS celler etter MPA behandling, mens den bare økt med 2-3 folder i Hs746T celler (figur 4). Tilsvarende MPA behandling betydelig økt
CDH10
ekspresjon i AGS-celler, men ikke i Hs746T-celler (figur 4).
Vi har også utført sti berikelse analyse på 65 celle migrasjon genene forskjellig uttrykt etter MPA behandling. De fem KEGG veier som er betydelig endret ved MPA er presentert i tabell 1. fokal adhesjon, aktin cytoskjelett og axon føringsveier er sterkt relatert til cellemigrering og er betydelig hemmet av MPA behandling, i samsvar med den observerte reduksjonen i migrasjon evnen av MPA-behandlede AGS celler. Videre er reaksjonsveien i kreft også hemmet signifikant flere gener som spiller en viktig rolle i celleproliferasjon og apoptose. TGF-beta veien er betydelig aktiveres av MPA behandling, og dette funnet er i samsvar med undertrykkelse funksjon av TGF-beta og MPA aktivitet ved inhibering av cellemigrering og proliferasjon.
Pathway Navn
ID
pFDR
Status
Focal adhesion45101.46E-06InhibitedRegulation av aktin cytoskeleton48101.22E-05InhibitedPathways i cancer52002.21E-05InhibitedAxon guidance43600.00016InhibitedTGF-beta signale pathway43500.00021ActivatedTable en. Topp fem KEGG-trasé over 65 celle migrasjon gener betydelig endret ved MPA behandling.
CSV ned CSV
MPA-induserte signale endringer knyttet til migrasjon
AKT
er en nøkkel genet som kobles med et stort antall migrasjons gener uttrykt forskjellig i microarray data. Men uttrykket av
AKT
gener ble ikke endret ved MPA behandling. Videre skal den samlede AKT-proteinet viste bare liten endring på senere tidspunkter (figur 5A). Interessant, fosfor-Akt (Ser473) ble alvorlig redusert med MPA-behandling (figur 5A). Disse resultatene antyder at MPA kan også endre migrering evne AGS cellen via innflytelse på aktiveringsstatusen til nøkkelsignalproteiner så som AKT, i tillegg til å regulere ekspresjon av gener
A.: Western blot for utvalgte proteiner . B:. FACS analyse
Uttrykket av genene som koder Src tyrosin kinase er bare marginalt nedregulert i microarray data. Siden Src er funksjonelt relatert til et stort antall migrasjons gener forskjellig uttrykt i mikroarray data (figur 3), bestemt vi protein ekspresjonsnivået av Src og funnet at proteinet er drastisk nedregulert ved MPA behandling (figur 5A). Men den nøyaktige årsaken til de observerte gen- og protein expression avvik er uklart og er fortsatt å bli undersøkt videre.
MPA-indusert CD147 reduksjon
Src tyrosinkinase overfører også integrin avhengige signaler sentralt til celle bevegelse og spredning. Flere differensial uttrykte gener (
CEACAM1 Hotell og
CYR61
) er også innblandet i intesignalveien. Derfor, analyserte vi ekspresjonen av flere integriner på AGS og Hs746T celleoverflaten ved hjelp av FACS-analyse. Selv om uttrykk for
CD147
genet ble ikke endret ved MPA behandling (figur 4), CD147 overflateprotein uttrykk ble dramatisk ned regulert etter MPA behandling (figur 5B). Videre Western blot-analyse bekreftet også at den totale CD147-proteinet var signifikant nedregulert ved MPA behandling (figur 5A). Interessant, MPA behandling av Hs746T celler ikke vesentlig endre CD147 overflate uttrykk. Ekspresjonen av ICAM-1 og integrin beta 5 ble ikke forandret av MPA behandling (figur 5B).
MPA reduserer matriks-metalloproteinase-1 (MMP-1)
Tre MMP-proteinene ble målt i kulturmedium av AGS og Hs746T celler etter behandling ved hjelp av MPA Luminex analyser (figur 6). Protein nivåer av MMP2 og MMP9 var meget lav i AGS cellekulturmedium (data ikke vist). MMP1 ble signifikant redusert ved MPA behandling på en doseavhengig måte i AGS cellekulturmediet (figur 6A), mens ingen signifikant endring ble observert i Hs746T celler (Figur 6B).
A: AGS celler. B: Hs746T celler.
Diskusjoner
MPA er kjent for å spesifikt hemme IMPDH, det hastighetsbegrensende enzym for
de novo
syntese av guanosine nukleotider, som er avgjørende for DNA replikasjon så vel som RNA og proteinsyntese. MPA er også kjent for å hemme kreftcellevekst og induserer apoptose. I denne studien viste vi for første gang at MPA kan redusere migrasjons og invasjons evner av AGS celler. Siden metastase er et stort problem som vender mot kreftpasienter, MPA evne til å hemme kreftcellemigrering og invasjon, i tillegg til sin evne til å inhibere celleproliferasjon og indusere apoptose, gjengir MPA en utmerket anti-kreft medikamentkandidat.
I denne studien også brukt en rekke forskjellige molekylære teknikker for å belyse de molekylære mekanismer som ligger under MPA funksjon for å hemme kreftcellemigrering. Vi først brukt global transcriptomic analyser for å identifisere migrasjon kandidat gener endret av MPA-behandling. Disse studiene antydet 50 gener med 2-4 ganger forskjellen og 15 gener med 4 gangers forskjeller (figur 2). Disse genene inkluderer celleoverflatereseptorer, proteinkinaser, og andre gener som er involvert i reguleringen av migrasjon. Gyldigheten av microarray data har blitt bekreftet av real-time RT-PCR for utvalgte gener med 4 gangers forskjeller (figur 4). I tillegg til transcriptomic analyse, vi også benyttes flere proteomic og funksjonelle teknologier for å belyse de molekylære mekanismer som ligger til grunn for den anti-migreringsaktivitet av MPA. Transcriptomic profilering er en kraftig teknologi for å vurdere globale molekylære endringer. Den store fordelen med genekspresjon microarray er dens evne til å raskt og økonomisk behandle uttrykket mønster av nesten alle gener uttrykt i cellene av interesse. Til tross for kraften i denne klassen av teknologi, er det en rekke spørsmål som begrenser microarray først og fremst som en hypoteser genererende verktøy. Den mest alvorlige begrensningen er ufullkommen korrelasjon eller mangel på sammenheng mellom genuttrykk og protein uttrykk /funksjon. Denne mangel er godt illustrert i denne studien som store forskjeller i protein uttrykk for aktivering status ble endret av MPA mens genuttrykket nivået uendret. Derfor er det viktig å kombinere transcriptomic og proteomikk teknologi for global karakterisering av biologiske funksjoner.
Minst tre gener som er kjent for å fremme cellemigrasjon (
INF2
,
DOCK1
og
HSPA5
) er sterkt nedregulert ( 4 ganger) av MPA-behandling (figur 2).
INF2
koder invertert formin 2 protein, som fremmer dannelsen av detyrosinated mikrotubuli nødvendige for cent reorientering i migrerende celler [25]. Den dedicator av cytokinese 1 (DOCK1) protein samhandler med HER2 og fremmer HER2-indusert Rac aktivering og celle migrasjon [26]. HSPA5 er en stressrespons protein indusert av agenter eller tilstander som negativt påvirker endoplasmatiske retikulum funksjon. Den regulerer aktivt flere ondartede fenotyper inkludert cellevekst, migrasjon og invasjon. Nedregulering av disse gener ved MPA er forenlig med redusert vandrings kapasiteten til AGS-celler etter behandling MPA. I motsetning til overekspresjon av β-arrestin-1 (
ARRB1
) reduserte den vandrende tilbøyelighet av brystkreftcellelinjer, mens tie økt migrasjon [27]. I en nyere studie [28],
ARRB1
ble funnet å fremme den vandrende evne til lungekreft migrasjon. Derfor er det uklart på dette tidspunktet om
ARRB1
hemmer eller fremmer migrasjon i AGS celler. En annen drastisk nedregulert genet,
IGFBP5
induserer celle adhesjon og øker celle overlevelse i MCF-7 humane brystkreftceller [29]. IGFBP5 synes å hemme migrering av MCF7-celler [29], men fremmer migrering av perifere mononukleære blodceller [30]. Derfor forblir rolle IGFBP5 på AGS cellemigrering som skal bestemmes.
MPA behandling av AGS-celler også signifikant oppregulert ekspresjonen av et antall gener involvert i cellemigrering. Blant disse sju gener (
ATF3
,
SMAD3
,
CITED2
,
CEAMCAM1
,
CYR61
,
NOS3 Hotell og
CDH10
) er av stor interesse som de viser mer enn fire-fold forskjeller i microarray heatmap (figur 2). To av de sju gener (
ATF3 Hotell og
CDH10
) ble valgt ut og bekreftet ved real-time RT-PCR.
ATF3
uttrykk er økt med 11 ganger 12 timer etter MPA behandling og med 19 ganger på 48 timer.
CDH10
ekspresjon endres i AGS-celler, men ikke i Hs746T-celler (figur 4). ATF3 har nylig blitt vist å undertrykke metastase av blærekreft gjennom regulerings Gelson-mediert ombygging av aktin cytoskjelettet. Overekspresjon av
ATF3
i svært metastatiske blærekreftceller avtar migrasjon
in vitro Hotell og
in vivo product: [31]. TGF-β /Smad signalveien spiller en avgjørende rolle i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom vekst, migrasjon og metastasering. SiRNA-mediert stanse av SMAD3 øker TGF-β-indusert kreft cellemigrasjon [32]. I samsvar med den vandrende redusert evne til AGS-celler etter behandling MPA, er SMAD3 signifikant oppregulert ved MPA behandling (figur 2).
CITED2
koder Cbp /P300-samspill transaktivatorprotein 2 protein, som positivt regulerer TGF-β signaliserer gjennom sin tilknytning til Smad /P300 /CBP-mediert transcriptional coactivator kompleks og stimulerer flere andre transkripsjons aktiviteter. Det har vist seg at
Cited2
knockout mus har økt gonadal celle migrasjon [33]. Derfor oppregulert
CITED2
genuttrykk kan bidra til redusert vandrende evne AGS celler behandlet med MPA.
CEACAM1
koder for karsinoembryonisk antigen-relaterte celleadhesjonsmolekyl (CD66a), som påvirker integrin-avhengig signalisering og regulerer ekstracellulære matriks-protein-spesifikke morfologi og migrering av endoteliale celler [34]. Selv om de fleste studier har vist at CEACAM1 alene spiller en promigratory rolle, samspillet mellom CEACAM1 og filamin En drastisk redusert migrasjon og celle spredning [35]. Derfor kan rollen CEACAM1 i celle migrasjon avhenger av mobilnettet sammenheng.
Men to av genene sterkt oppregulert ved MPA (
CYR61 Hotell og
NOS3
) faktisk fremme migrasjon.
CYR61
koder for det cysteinrike proteiner 61, som fremmer cellemigrering via endring i den ved integrin [36]. Oppreguleringen av
CYR61
av MPA behandling kan redusere den anti vandrende rolle av MPA. Nitrogenoksid fremmer brysttumorcellemigrering gjennom sekvensiell aktivering av nitrogenoksidsyntase, guanylatsyklase og mitogen-aktivert protein kinase [37].
NOS3
koder nitrogenoksid syntase 3 og er svært oppregulert ved MPA behandling. Igjen, oppregulering av
NOS3
kan redusere antimigratory funksjon av MPA.
CDH10
genet koder for en av de cadherin proteiner som spiller viktige roller i celle-celle adhesjon. Det har blitt antydet at CDH10 kan spille en kritisk rolle i mesendodermal celle migrasjon, selv om dette antatte forhold ikke har blitt eksperimentelt undersøkt.
CDH10
er drastisk økt med MPA behandling av AGS celler, men ikke i Hs746T celler og dens rolle i migrasjon bør eksperimentelt testet.
PDGFRA
koder for et celleoverflate tyrosinkinasereseptor medlem av blodplate-avledet vekstfaktor-familie og er kjent for å være nært beslektet med cellevandring [38].
