Abstract
Selv om mange kjemoterapeutiske strategier mot kreft har blitt utviklet, kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest aggressive og vanskelige typer kreftformer. Derfor er nye strategier og anti-kreftmidler er nødvendig for å behandle sykdommen. Metformin er et mye brukt legemiddel for type-2 diabetes, og er også kjent som en lovende kandidat anti-kreft agent fra nyere studier
in vitro Hotell og
in vivo
. Imidlertid er mekanismene for metformin anti-kreft effekt ikke blitt klarlagt. Vi demonstrerte at metformin undertrykket ekspresjon av MIR-221, en av de mest kjente onkogene microRNAs, i human pancreatic cancer PANC-1-celler. Videre viste vi at nedregulering av MIR-221 ved metformin forårsaket G1-fase rest via opp-regulering av p27, en av de direkte mål av MIR-221. Tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) er også et lovende middel for behandling av kreft. Mens nyere studier viser at behandling med bare TRAIL var ikke effektiv mot kreft i bukspyttkjertelen celler, dagens data viste at metformin sensibilisert p53-mutert kreft i bukspyttkjertelen celler til stien. Metformin indusert uttrykk for død reseptor 5 (DR5), en reseptor for TRAIL, og Bim med en pro-apoptotisk funksjon i nedstrøms TRAIL-DR5 veien. Vi foreslår at oppregulering av disse proteinene kan bidra til sensibilisering av TRAIL-fremkalt apoptose. Kombinasjonsbehandling med metformin og TRAIL kan derfor være effektiv i behandling av kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Tanaka R, Tomosugi M, Horinaka M, Sowa Y, Sakai T (2015) Metformin Årsaker G1-fase Arrest via nedregulering av MiR-221 og Forbedrer TRAIL følsomhet gjennom DR5 oppregulering i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 10 (5): e0125779. doi: 10,1371 /journal.pone.0125779
Academic Redaktør: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: 08.12.2014; Godkjent: 25 mars 2015; Publisert: 8. mai 2015
Copyright: © 2015 Tanaka et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) Grant Number 24689031. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en ildfast kreft og den fjerde største årsaken til kreftdød i USA [1]. Den eneste kurative behandling for denne ondartet svulst er kirurgi og fem års relativ overlevelse for pasienter med bukspyttkjertelkreft var 2-6% i USA fra 1975 til 2009. gemcitabin ble etablert som førstelinje kjemoterapi i 1990 [2] . FOLFIRINOX (oksaliplatin, irinotekan, leukovorin, og fluoruracil) eller kombinasjonsbehandling av gemcitabin og erlotinib, en selektiv inhibitor av EGFR-tyrosinkinase-, delvis forbedret total overlevelse, men ikke nok [2-4]. Derfor blir mer effektive legemidler eller kombinasjonsbehandlinger for bukspyttkjertel kreft nødvendig.
Metformin har vært mye brukt som et legemiddel for type 2-diabetes i lang tid [5]. I dag er metformin regnes som den første valget for oral behandling for type 2 diabetes, fordi det er ingen store kontraindikasjoner og kostnaden av stoffet er lav [6]. I mellomtiden har nylige rapporter vist at metformin er anvendelig i kreft forebyggelse og behandling [7]. Flere kliniske studier av metformin hos pasienter med kreft er pågå [8, 9]. Metformin reduserer glukoseproduksjonen i leveren, aktiverer leveren kinase B1 (LKB1) /AMP kinase (AMPK) akse og hemmer pattedyr-målet av rapamycin kompleks 1 (mTORC1). Det hemmer også insulinvekstfaktor-1 (IGF-1) [10-13]. Videre regulerer metformin flere mikroRNA uttrykk [14] og er rettet mot kreftstamceller [12, 15]. En behandling med metformin hemmet veksten av kreftceller ved å indusere G1 faserest via opp-regulering av p27 [16]. Men nøyaktig hvilke mekanismer som metformin opp-regulerer p27 fortsatt uklare.
Tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL /Apo2L) induserer apoptose ikke i normale celler, men selektivt i ondartede kreftceller [17 -19]. Rekombinant humant TRAIL og agonistiske antistoffer for TRAIL reseptorene er attraktive anti-kreft agenter og flere TRAIL baserte kliniske studier er i gang [20]. TRAIL induserer apoptose i forskjellige kreftceller via død reseptor 5 (DR5; også kalt TRAIL-R2), en av de fem TRAIL-reseptorer [21-23]. Det er imidlertid et viktig problem at noen kreft i bukspyttkjertelen celler er ufølsomme for TRAIL-mediert apoptose [24, 25]. Nylig har spesifikke microRNAs blitt rapportert å være relatert til motstanden av TRAIL i kreftceller [26]. MicroRNAs er en klasse av små ikke-kodende RNA som regulerer målet genekspresjon av translasjonsforskning undertrykkelse og mRNA cleavage. MicroRNAs er blitt demonstrert å spille en viktig rolle i prosessen med karsinogenese [27]. Rollen microRNAs har blitt studert i mange typer svulster, inkludert bukspyttkjertel kreft. Blant dem er MIR-221 involvert i kreftutvikling ved å regulere celledeling, og det bidrar til TRAIL motstand [28-31]. Uttrykket av MIR-221 er økt i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler [32]. Interessant, en fersk studie viste at MIR-221 ble forhøyet i de interne mammary arterier personer med type 2 diabetes, og det var en signifikant invers korrelasjon mellom peroral dose av metformin og nivået på MIR-221 [33].
en fersk studie viste at metformin oppregulert DR5 og forbedret TRAIL følsomhet i p53 villtype kreftceller [34], noe som indikerer at det er en lovende kandidat for å overvinne TRAIL motstand i kreftceller. Men mer enn halvparten av ondartede svulster besitter inaktivere mutasjoner i p53-genet [35, 36], og derfor trenger vi å undersøke om metformin øker følsomheten til TRAIL i p53-mutant kreftceller.
I denne studien fant vi at metformin redusert Mir-221 uttrykk og dermed forårsaker G1-fasen arrest gjennom oppregulering av p27, et direkte mål på MIR-221. Videre viste vi at metformin forbedret TRAIL følsomhet via oppregulering av DR5 i p53-mutant kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Reagenser
Metformin ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). Løselig rekombinant humant TRAIL /Apo2L ble kjøpt fra Peprotech (London, UK). Den menneskelige rekombinant DR5 (TRAIL-R2) /Fc Chimera og pan-caspase-hemmer, zVAD-FMK, ble kjøpt fra R . D Systems (Minneapolis, MN, USA)
Cell kultur
Humant pankreatisk kreft PANC-1 og ASPC-1-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Menneskebukspyttkjertelkreft MIAPaCa-2-celler ble kjøpt fra menneskelige Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). PANC-1 og MIAPaCa-2-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum, 4 mM glutamin, 50 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. ASPC-1-celler ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 50 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Alle celler ble inkubert ved
oC 37 i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO
2.
Cell vekstanalyse
Antall levedyktige celler ble bestemt ved bruk av Cell Counting Kit -8 analysen i henhold til produsentens instruksjoner (Dojindo Molecular Technology, Kumamoto, Japan). Etter inkubering av cellene i 72 timer med de angitte konsentrasjoner av metformin eller TRAIL, kit reagens WST-8 ble tilsatt til mediet, og det ble inkubert i ytterligere 4 timer. Absorbansen av prøvene (450 nm) ble bestemt ved hjelp av en skanner flere brønner spektrofotometer.
Trypan blått fargestoff utelukkelse analysen
Celler ble sådd ut i 12-brønners plater (1 x 10
4 /godt). På neste dag ble cellene behandlet med metformin ved indikerte konsentrasjoner i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved trypan blå eksklusjon fargestoff assay.
Analyse av cellesyklusprogresjon og påvisning av apoptose
Celler ble inkubert med eller uten metformin eller TRAIL, i konsentrasjoner som er angitt og høstet. Etter vasking med PBS ble cellene suspendert i PBS inneholdende 0,1% Triton X-100, ble behandlet med RNase A (Sigma), og kjernene ble farget med propidiumjodid (Sigma). Den DNA-innhold ble målt ved bruk av FACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). For hvert forsøk ble 10,000 celler analysert. Cell quest software (Becton Dickinson) og ModFit LT V2.0 programvarepakke (Verity Software House, Topsham, ME, USA) ble brukt til å analysere dataene.
Western blot analyse
Celler ble lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 1% SDS, 2 ug /ml leupeptin, 2 ug /ml aprotinin, 0,5 mM PMSF og 1 mM DTT). Lysatet ble ultralydbehandlet og sentrifugert ved 15.000 g i 20 min ved 4 ° C, og supernatanten ble oppsamlet. Den proteinekstrakt ble applisert på en 7,5, 10 eller 12,5% SDS-polyakrylamidgel for elektroforese og blottet på polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Kanin polyklonale anti-DR4, anti-DR5 (Prosci, Poway, California, USA), og anti-CDK4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), og kanin monoklonalt anti-Bim (Epitomics, San Diego, CA, USA), og muse-monoklonalt anti-cyklin D1 (MBL, Nagoya, Japan) og anti-β-aktin (Sigma) antistoffer ble anvendt som de primære antistoffer. Blottene ble inkubert med det passende HRP-konjugert sekundært antistoff (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), og signalene ble detektert ved anvendelse av en Chemilumi-en kjemiluminescens kit (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan).
Bestemmelse av TRAIL-reseptor ekspresjon
Cellene ble høstet ved trypsinering, vasket en gang med iskald PBS og resuspendert i 100 ul PBS med 1% BSA. Deretter ble PE-merket mus anti-human DR4 eller DR5 mAb (eBioscience, San Diego, CA, USA) tilsatt. For å vurdere ikke-spesifikk farging, ble PE-merket kontroll IgG isotyper (eBioscience) brukt. Etter en 30 min inkubasjon på is, ble 20.000 celler analysert ved FACSCalibur.
RNA analyse
Total RNA fra cellene ble utvunnet ved hjelp av en Mirvana miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster, CA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. For kvantitativ real-time RT-PCR, ble total RNA (2 mikrogram) revers-transkribert til cDNA i en 20 mL reaksjon volumet med en High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. TaqMan prober for DR5 og β2-mikroglobulin (β2MG) ble kjøpt fra Applied Biosystems. Uttrykket nivåer av mRNA ble kvantifisert ved bruk av Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR system i henhold til produsentens instruksjoner. Ekspresjonsnivået av DR5 mRNA ble normalisert mot nivået av β2MG mRNA i samme prøve.
mikroRNA ekspresjon analyse ble utført ved hjelp av TaqMan miRNA assays (Applied Biosystems) for å evaluere MIR-221. Total RNA (10 ng) ble revers-transkribert til cDNA i en 15 mL reaksjon volumet med hver spesifikke primere og TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Uttrykket nivåer av microRNAs ble kvantifisert ved hjelp av 7300 Real-Time PCR system (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. Resultatene var normalisert forhold til RNA genet RNU48
mikroRNA ligner transfeksjon
Celler ble transfektert med 5 nM miRIDIAN mikroRNA Ligner (MIR-221 eller negativ kontroll # 1;. Dharmacon, Lafayette, CO , USA) ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 24 timers transfeksjon, ble cellene behandlet med eller uten 40 mM metformin. Cellene ble høstet 24 timer etter behandling for FACS-analyse og Western blotting.
Statistical Analysis
Dataene er gjennomsnitt ± S.D. av tre bestemmelser. Data ble analysert ved hjelp av Student
t-
test og forskjeller ble betraktet som signifikant ved P . 0,05
Resultater
Metformin undertrykker cellevekst av kreft i bukspyttkjertelen celler
for å undersøke effekten av metformin på menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler, undersøkte vi om metformin trykt cellevekst ved hjelp trypan blått fargestoff eksklusjon analysen. PANC-1, ble MIA PACA-2, og ASPC-1-celler behandlet med den angitte konsentrasjon av metformin i 72 timer, og levedyktige celler ble telt ved trypanblått-eksklusjon fargestoff assay. Som vist i figur 1, reduserte metformin veksten av disse kreftceller på en doseavhengig måte.
(A) PANC-1, (B) MIA PACA-2, og (C) ASPC-1 celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av metformin. Etter inkubasjon i 72 timer ble cellene tellet ved trypan blå eksklusjon fargestoff assay. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 bestemmelser. * P 0,05, ** P. 0,01
Metformin induserer G1-fasen arrest i kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom nedregulering av MIR-221
neste utført analyse cellesyklus ved hjelp av flow cytometri etter behandling med de angitte konsentrasjoner av metformin i 48 timer i humane kreft i bukspyttkjertelen celler. Som vist i figur 2A, og S1, S2 og S4 Fig, metformin forårsaket G1-fase rest på en doseavhengig måte. Videre undersøkte vi effekten av metformin på ekspresjonen av G1 faserelaterte proteiner. Som et resultat av metformin ved 40 mM økt ekspresjon av p27-proteinet (figur 2B). Lee
et al
. tidligere identifisert en rekke microRNAs med økt uttrykk, herunder MIR-21, -221, -301, -376a, -155, samt andre i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler [32]. Dessuten ble p27 protein nedregulert ved MIR-221 i humane kreft i bukspyttkjertelen celler [37]. Derfor undersøkte vi effekten av metformin på uttrykk for MIR-221. Som vist i figur 2C, metformin redusert ekspresjon av MIR-221 på en doseavhengig måte.
(A) PANC-1-cellene ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av metformin i 48 timer. Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble bestemt ved flow-cytometri. (B), (C) PANC-1-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av metformin i 48 timer. (B) Western blotting for p27. β-aktin er en lasting kontroll. (C) Real-time RT-PCR kvantifisering av Mir-221 uttrykk. Internkontrollen var RNU48. Verdier er ganger endring i uttrykket av MIR-221 /RNU48 sammenlignet med ubehandlet kontroll. (D), (E) PANC-1-celler ble transfektert med 5 nM MIR-221 etterligne eller 5 nM negativ kontroll. Etter 24 timer ble cellene inkubert med eller uten 40 mM metformin i 48 timer. (D) Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble bestemt ved flow-cytometri. (E) Western blotting for p27. β-aktin er en lasting kontroll. Arrow, en uspesifikk band. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 bestemmelser. ** P. 0,01
For å undersøke om endring i uttrykket av MIR-221 er forbundet med p27 induksjon og G1-fasen arrestasjonen av metformin behandling, vi transfekterte Panc-1 celler med en MIR -221 ligne før metformin behandling og utført flowcytometri og Western blot analyse. Transfeksjon av MIR-221 ligne redusert cellepopulasjonen i G1 fasen og uttrykk for p27 protein indusert av metformin, selv om G1 fase befolkningen i metformin-ubehandlet celler ble også redusert (figur 2D og 2E, S3 fig). Til sammen tyder disse resultater på at G1 faserest som induseres av metformin ved 40 mM kan være forårsaket av induksjon av p27 delvis gjennom nedregulering av MIR-221.
Metformin forbedrer TRAIL-fremkalt apoptose in TRAIL -resistente kreft i bukspyttkjertelen celler
Nylig ble det rapportert at opp-regulering av død reseptor 5 (DR5) av metformin forbedret TRAIL-fremkalt apoptose av p53 villtype maligne tumorceller [34]. Derfor undersøkte vi effekten av metformin på TRAIL sensibilisering i p53-mutant og TRAIL-motstandsdyktig kreft i bukspyttkjertelen celler. Tre cellelinjer, Panc-1, ASPC-1, og MIA PACA-2, ble testet for deres mottagelighet for TRAIL og /eller metformin. Til å begynne med, behandlet vi cellene med eksogen rekombinant humant TRAIL ved de angitte konsentrasjoner i 72 timer, og levedyktige celler ble tellet med en WST-8-analyse. Vekst av cellelinjene ble ikke merkbart inhibert med TRAIL (figur 3A; S4A fig). Vi neste undersøkte effekten av TRAIL eller metformin på apoptose-induksjon ved måling av sub-populasjonen G1. Metformin eller TRAIL alene litt indusert apoptose i disse tre bukspyttkjertelkreft cellelinjer (figur 3B og 3C, S4B og S4C figurene). Men kombinert behandling med metformin og TRAIL markert økt apoptose i alle testede cellelinjer (figur 3D, S4B og S4C Fiken).
(A) PANC-1 celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av TRAIL. Etter inkubasjon i 72 timer ble levedyktige celler bedømt ved bruk av en celletelling leder-8. (B), (C) PANC-1-cellene ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av TRAIL (B) eller metformin (C) i 48 timer. Sub-populasjoner G1 ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. (D) Kombinerte effekter av 40 mM metformin og /eller 10 ng /ml TRAIL i 48 timer. Sub-populasjoner G1 ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 bestemmelser. * P 0,05, ** P. 0,01
Metformin opp-regulerer uttrykket av DR5 i kreft i bukspyttkjertelen celler
For å undersøke mekanismer som metformin forbedrer TRAIL-indusert apoptose , undersøkte vi de apoptose-relaterte proteiner som ble regulert av metformin hjelp av Western blot-analyse. PANC-1 celler ble behandlet med metformin i 48 timer, og vi undersøkte uttrykk for TRAIL reseptorer, DR4 og DR5 og flere proteiner som sensitize kreft celler til å TRAIL. Som vist i figur 4A, metformin signifikant oppregulert ekspresjonen av DR4, DR5 og Bim proteiner. Vi undersøkte celleoverflate uttrykk for DR4 og DR5 i PANC-1-celler ved flow cytometri. Metformin øket ekspresjonen av celleoverflate DR5 bare (figur 4B og 4C). Videre undersøkte vi det DR5 mRNA nivå ved kvantitativ sanntids RT-PCR etter behandling med metformin ved de angitte konsentrasjoner i 48 timer. Som vist i figur 4D, metformin økte signifikant DR5 mRNA-ekspresjon.
(A) PANC-1-cellene ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av metformin i 48 timer. Western blotting for DR4, DR5 og Bim ble utført. β-aktin er en lasting kontroll. Arrow, uspesifikke band. (B), (C) Celleoverflate uttrykk for DR4 og DR5 i PANC-1-celler behandlet med eller uten 40 mM metformin i 48 timer. Celler ble farget med isotype kontroll IgG og monoklonale antistoffer mot DR4 og DR5. Data ble analysert ved flowcytometri. (B) Gray histogram, ingen behandling; hvit histogram, metformin behandling. (C) Y-aksen representerer de geometriske middelverdier for de cellepopulasjoner i histogrammene. Gray bar, ingen behandling; hvit bar, metformin behandling. (D) Kvantitativ sanntids RT-PCR av DR5 mRNA i PANC-1-celler som ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av metformin i 48 timer. Internkontrollen var β2MG. Verdier er ganger endring i uttrykket av DR5 mRNA /β2MG mRNA sammenlignet med ubehandlet kontroll. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 bestemmelser. ** P. 0,01
Den forbedring av TRAIL-indusert apoptose av metformin avhenger caspases og DR5, men ikke MIR-221
For å analysere involvering av caspases og DR5 på stien-indusert apoptose forsterkes av metformin i PANC-1 celler, undersøkte vi effekten av pan-caspase inhibitor zVAD-FMK eller DR5 /Fc chimera protein med dominant negativ funksjon mot DR5. Den apoptose indusert ved en kombinasjon av metformin og TRAIL ble markert redusert ved tilsetning av DR5 /Fc-kimæren eller zVAD-FMK (figur 5A). Disse resultatene indikerer at TRAIL-fremkalt apoptose forsterket av metformin ble utløst i det minste delvis i et caspase-avhengig måte og samvirke mellom TRAIL og DR5. Deretter testet vi om nedregulering av MIR-221 med metformin bidratt til TRAIL-indusert apoptose. Vi transfektert PANC-1 celler med en MIR-221 ligne før samtidig behandling med metformin og TRAIL. Som vist i figur 5B, kan transfeksjon av MIR-221 reduserer ikke apoptose populasjonen ved ko-behandling. Disse resultatene indikerer at MIR-221 er ikke ansvarlig for forbedring av TRAIL-indusert apoptose av metformin.
(A) Panc-1 celler ble behandlet med 40 mM metformin og /eller 10 ng /ml TRAIL for 48 timer med eller uten 1 ng /ml DR5 /Fc-kimæren, eller 20 uM zVAD-FMK pan-kaspaseinhibitor. Sub-populasjoner G1 ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. (B) PANC-1 celler ble transfektert med 5 nM Mir-221 etterligne eller 5 nM negativ kontroll. Etter 24 timer ble cellene inkubert med eller uten 40 mM metformin og /eller 10 ng /ml TRAIL i 48 timer. Sub-populasjoner G1 ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 bestemmelser. ** P. 0,01
Diskusjoner
Metformin, den «klassiske» narkotika for type 2-diabetes, har nylig fått oppmerksomhet som et antitumormiddel [5-7]. I tillegg viser våre data viser nye funksjoner av metformin mot kreft i bukspyttkjertelen celler.
Det har blitt rapportert at metformin indusert G1-fase rest med induksjon av p27 ekspresjon som en av mekanismene i humane kreftceller [16]. Tilsvarende, i våre resultater, metformin indusert G1-fase rest (figur 2A), og opp-regulert p27-proteinet uttrykket (figur 2B) i human pancreatic cancer PANC-1-celler. Det ble rapportert at nedregulering av MIR-221 hemmet veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler gjennom oppregulering av PTEN, p27, p57, og PUMA [38]. Blant disse målmolekylene av MIR-221, er p27 en CDK inhibitor som induserer G1-fasen arrest i kreftceller [39]. Derfor hypotese vi at metformin kan ned-regulere MIR-221 ekspresjon, noe som resulterer i induksjon av p27 med G1-fase arrest i kreft i bukspyttkjertelen celler. I denne studien fant vi at metformin nedregulert ekspresjon av MIR-221 i kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 2C). Videre ble både G1 faserest og induksjon av p27 ved metformin trykkes av en MIR-221 etterligne in kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 2D og 2E). Fra resultatene, viser vi for første gang at metformin-indusert G1 faserest er i det minste delvis er forårsaket av p27 induksjon gjennom nedregulering av MIR-221. I mellomtiden ble redusert metformin uttrykk for cyclin D1 og CDK4 proteiner på 10 mm eller mer (S5 figur), i samsvar med tidligere rapporter [16, 40]. Derfor kan det hende at nedregulering av cyclin D1 CDK4 og protein uttrykk bidra til G1-fase rest av metformin ved lavere doser. Det ble rapportert at MIR-221, en av de mest kjente OncomiRs, ble oppregulert i flere ondartede sykdommer, inkludert kreft i bukspyttkjertel [32]. Derfor er MIR-221 ansett for å være et attraktivt mål for selektiv behandling mot kreft [27-29]. Interessant, tidligere studie viste at MIR-221 ble forhøyet i de interne mammary arterier personer med type 2 diabetes, og det var en signifikant invers korrelasjon mellom peroral dose av metformin og nivået på MIR-221 [33], øke muligheten at våre resultater kan være fysiologiske.
på den annen side, tidligere studier har rapportert at MIR-221 har også bidratt til TRAIL motstand i humane kreftceller [28-31]. Vi har derfor en hypotese om at metformin kan være i stand til å forbedre følsomheten TRAIL via nedregulering av MIR-221 i kreft i bukspyttkjertelen celler. For å bekrefte denne hypotesen, må vi først undersøkte effekten av metformin på TRAIL følsomhet i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler. I menneskelige kreft i bukspyttkjertelen PANC-1 celler (figur 3D), ASPC-1 celler (S4B fig) og MIA PACA-2 celler (S4C Fig), metformin forbedret sensitivitet på TRAIL. Vi neste undersøkt om MIR-221 var involvert i forbedring av TRAIL følsomhet av metformin. I denne studien ble det av MIR-221 etterligne ikke undertrykke apoptose indusert av kombinasjonen av metformin og TRAIL menneskelige kreft i bukspyttkjertelen PANC-1 celler (figur 5B). Som det mulig grunn av forskjellen fra tidligere studier [28-31], spekulere vi at anti-apoptotiske reaksjonsvei fra MIR-221 ikke kan eksistere i humane kreft i bukspyttkjertelen celler testet. Derfor er det foreslått at nedregulering av MIR-221 av metformin er involvert i G1-fase arrest, men ikke apoptose er nevnt ovenfor.
Vi analyserte de molekylære mekanismer som forbedrer TRAIL-følsomhet, og fant at metformin indusert uttrykk for DR5, en av stien reseptorer (figur 4; S6 figur), og uttrykk for Bim (fig 4A). Det er ingen rapporter om at metformin oppregulert uttrykk for Bim protein i humane kreftceller. Bim har en pro-apoptotisk funksjon i nedstrøms TRAIL-DR5 veien. Den oppregulering av Bim ble også rapportert å være ansvarlig for forbedring av TRAIL følsomhet [41]. Våre data derfor foreslå at DR5 og Bim oppregulering av metformin kan bidra til sensibilisering av TRAIL-indusert apoptose.
Truong
et al
., Viste at metformin oppregulert DR5 via en p53 -avhengig vei [34]. I kontrast, har vår nåværende data klart vist at metformin oppregulert DR5 i p53-mutant bukspyttkjertelkreft PANC-1 (figur 4), ASPC-en og MIA PACA-2 celler (S6 figur), noe som indikerer at metformin opp-regulerer DR5 uttrykk i en p53-uavhengig måte. I tillegg ble apoptose indusert ved en kombinasjon av metformin og TRAIL merkbart redusert ved DR5 /Fc-kimær (figur 5A), som indikerer at den forbedrede TRAIL følsomhet på grunn av metformin var i det minste delvis avhengig av DR5. Interessant, Ozawa
et al
. viste at uttrykket nivåer av DR5-protein med kreft i bukspyttkjertel prøvene var 5,1 ganger høyere (P 0,01). enn det normale pankreatisk vev [24]
Det har blitt rapportert at metformin har forskjellige funksjoner [6, 7 , 10-16]. Nylig, kliniske studier av kombinasjoner med metformin og ulike kreftlegemidler er pågående fra synspunktet til stoffet reposisjonering [8, 9]. I forrige undersøkelse, Gritti
et al
. viste at 40 mM metformin ikke påvirker levedyktigheten av menneskelige navlestreng-avledet mesenchymale stamceller, og beskrives som metformin utløser spesifikt antitumoreffekter uten å forstyrre normal celle levedyktighet [42]. Vi viser her at kombinasjonen av metformin og TRAIL er svært effektiv mot menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler, øke muligheten for en kombinasjon strategi i behandling av kreft i bukspyttkjertelen.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Metformin induserer G1-fasen ble arrestert i PANC-1 celler. Product: (A), (B) De representative histogrammer av figur 2A. (A) ingen behandling. (B) 40 mM metformin
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125779.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Metformin induserer G1-fase arrest i MIA PACA-2-celler.
MIA PACA-2-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av metformin i 24 timer. Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble bestemt ved flow-cytometri. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 bestemmelser. * P 0,05, ** P 0,01
doi: 10,1371 /journal.pone.0125779.s002 plakater (TIF)
S3 Fig.. Metformin induserer G1-fasen ble arrestert i PANC-1 celler gjennom nedregulering av MIR-221.
Den representative histogrammer av figur 2D. (A) Mock. (B) 40 mM metformin. (C) etterligne negativ kontroll. (D) etterligne negativ kontroll og 40 mM metformin. (E) MIR-221 etterligne. (F) MIR-221 etterligne og 40 mM metformin
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125779.s003 plakater (TIF)
S4 Fig. Metformin sensitizes ASPC-en og MIA PACA-2 kreft i bukspyttkjertelen celler til TRAIL.
(A) ASPC-1 celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av TRAIL. Etter inkubasjon i 72 timer ble levedyktige celler bedømt ved bruk av en celletelling leder-8. (B) ASPC-1-celler ble behandlet med 10 ng /ml TRAIL og /eller 40 mM metformin i 48 timer. (C) MIA PACA-2-celler ble behandlet med 4 ng /ml TRAIL og /eller 40 mM metformin i 24 timer. Sub-populasjoner G1 ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 bestemmelser. * P 0,05, ** P 0,01
doi: 10,1371 /journal.pone.0125779.s004 plakater (TIF)
S5 Fig.. Metformin ned-regulerer uttrykket av cyklin D1 CDK4 og.
PANC-1-cellene ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av metformin i 48 timer. Western blotting for cyklin D1 CDK4 og ble utført. β-aktin er en lasting kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125779.s005 plakater (TIF)
S6 Fig. Metformin opp-regulerer DR5 protein i p53-mutante kreft i bukspyttkjertelen celler. Product: (A) ASPC-1-cellene ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av metformin i 48 timer. (B) MIA PACA-2-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av metformin i 24 timer. Western blotting for DR5 ble utført. β-aktin er en lasting kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0125779.s006 plakater (TIF)
