Abstract
Bakgrunn
Nyere bevis tyder på at avvikende aktivering av pinnsvin (Hh) signalisering av Gli transkripsjonsfaktorer er karakteristisk for en rekke av aggressive humane karsinomer inkludert kreft i eggstokkene. Derfor har kjemoterapeutiske midler som hemmer aktiveringen av Gli transkripsjonsfaktorer dukket opp som lovende nye terapeutiske legemidler for eggstokkreft.
Resultater
I denne studien, viser vi at aktivering av Hh signale fremmet cellulær migrasjon og invasjon, mens blokade av Hh signale med GANT61 trykt cellulær migrasjon og invasjon i eggstokkreft celler. Etter behandling med GANT61 analyser cDNA mikromatriser viste forandringer i mange gener som Inte β4 subenhet (ITGB4), fokal adhesjonskinase (FAK), etc. Videre ITGB4 ekspresjon ble oppregulert ved Sonic pinnsvin (Shh) ligand og nedregulert av Hh signale inhibitor. Den Hysj-mediert eggstokkreft celle migrasjon og invasjon ble blokkert av nøytraliserende antistoffer til ITGB4. I tillegg ble phosphorylations av FAK økt med Shh og redusert med Hh signale inhibitor. Hemming av Gli1 uttrykk ved hjelp siRNA etterlignet effekten av GANT61 behandling, støtte spesifisitet GANT61. Videre undersøkelser viste at aktivering av FAK var nødvendig for Shh-mediert celle migrering og invasjon. Til slutt fant vi at nedregulering av Gli redusert uttrykk for ITGB4 og fosforylert FAK, noe som resulterer i hemming av tumorvekst
in vivo
.
Konklusjoner
Hh signalveien induserer cellemigrasjon og invasjon gjennom ITGB4-mediert aktivering av FAK i eggstokkreft. Våre funn tyder på at diminishment av crosstalk mellom fosforylert FAK og ITGB4 grunn av nedregulering av Gli familie transkripsjonsfaktorer kan spille en sentral rolle for å hemme kreft i eggstokkene progresjon
Citation. Chen Q, Xu R, Zeng C, Lu Q, Huang D, Shi C, et al. (2014) nedregulering av Gli transkripsjonsfaktor fører til hemming av migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler via Inte β4-mediert FAK signale. PLoS ONE 9 (2): e88386. doi: 10,1371 /journal.pone.0088386
Redaktør: Frédéric André, Aix-Marseille Universitet, Frankrike
mottatt: 16 oktober 2013; Godkjent: 06.01.2014; Publisert: 12 februar 2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra China National Basic Research Program (2010CB535001), Natural Science Foundation National of China (81060095, 31171359), Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning (2010360111007) og NIH (P30 CA054174 ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser
Innledning
Eggstokkreft er en av de mest dødelige gynekologiske kreftformer over hele verden. På grunn av uspesifikke symptomer, er de fleste av eggstokkreft tilfeller stede med avansert stadium sykdom og forbundet med høy dødelighet [1]. I fremskreden kreft i eggstokkene, tumorceller er svært invasiv og påfølgende kreftmetastaser fører til død [2]. Deregulert celle migrasjon og invasjon bidra til oppnåelse av metastatisk evne til kreftceller og den molekylære mekanismen som regulerer metastase fortsatt i stor grad ukjent. Derfor er det viktig å identifisere molekylære mediatorene som tydet på metastatisk potensiale til å eggstokkreft celler, og til slutt for å bruke disse molekyler som biomarkører for å forutsi risiko for progresjon av kreft i eggstokkene [3].
pinnsvin (Hh) signalisering innledes ved binding av ligand nemlig Sonic Hedgehog (Shh), indisk Hedgehog (Ihh) eller Desert Hedgehog (DHH) til sin reseptor, Lappet (ptch) som dermed reduserer den hemmende effekten av ptch på glattet (Smo) [4]. Smo deretter lokalisert i den primære cilium, en organelle som spiller en avgjørende rolle i Hh signaliserer [5] som bevis fra Smo mediert aktivering av en intracellulær kaskade i cilium som resulterer i kjernefysisk translokasjon av Gli2, en Gli familie transkripsjonsfaktor [6]. I sin tur, translocated Gli2 induserer transkripsjon av Hh målgener som Gli1, en viktig del av Hh signale [6], [7]. Evnen til disse Gli transkripsjonsfaktorer for å slå på gener i cellekjernen kan faktisk fremme cellulær proliferasjon, cellulær overlevelse, stemness, og celle skjebne bestemmelse i en rekke organer [8], [9]. Enda viktigere, oppstår Hh-drevne kreftformer fra en rekke mutasjoner som påvirker forskjellige komponenter, inklusive nøkkeltranskripsjons Effektor Gli-proteiner [10] – [12]. Konstitutivt, er Hh-Gli signalehyperaktiv i basalcellekreft, Medulloblastomas og kreft i spiserøret på grunn av mutasjon i Lappet eller glattes [13]. Dessuten ble tilstedeværelse av deregulert Hh-Gli signale aksen observert i melanomer og prostata karsinom [14], [15]. Videre er det flere rapporter tyder på at Hh signalering er involvert i metastaser på ovarial [16], prostata [17], gastrisk [18], øsofageal [19] og bukspyttkjertel [20], [21] karsinomer. Sammen utgjør disse observasjonene antyder at feilregulert Hh signale korrelerer med alvorlighetsgraden av den tilhørende tumor og bidrar til å opprettholde metastatiske adferd. Likevel er rollen til Hh signalering i invasjon og metastasering av eggstokkreft dårlig definert. I tillegg er mekanismer som Hh signale fremmer tumorinvasjon og metastase må belyses ytterligere.
Det er mange indikasjoner på at Hh signalveien er viktig for vekst av kreftceller. Av denne grunn, har inhibering av Hh-signalering av nye terapeutiske midler blitt forsøkt i mange humane cancere [22] – [24]. Blokade av Hh signale av GDC-0449 [24], [25], cyclopamine [24], IPI-926 [23], eller Smo shRNA [26] hemmet celledeling og overlevelse, og undertrykte tumordannelse. Men en rekke svulster har vist seg å være refraktære for den direkte effekten av farmakologisk Hh hemming med SMO antagonister skyldes naturlige eller ervervede mutasjoner i Smo [27], [28] eller forsterkning av nedstrøms effektor Gli2 [29]. Disse observasjonene aktualiserer behovet for å identifisere bedre terapeutiske mål som effektivt blokkerer Hh signalveien. GANT61 (Gli-antagonist 61) ble identifisert fra et celle-basert skjerm for inhibitorer av Gli-mediert transkripsjon [29]. Nylig GANT61 er blitt identifisert som en potent Hh signalveien inhibitor for behandling av forskjellige kreftformer [22], [24].
I denne studien anvendte vi GANT61, et lite molekyl inhibitor av både Gli1 og Gli2 [29 ], for å identifisere unike nedstrøms mål av
GLI
gener som fungerer spesielt i cellulær migrasjon og invasjon i eggstokkreft. Våre resultater fra menneskelige eggstokkreft cellelinjer SKOV3 celler, som viser høy invasiv oppførsel [30], støtte Hh signale fremmer kreft celle invasjon gjennom inte β4 (ITGB4) -mediert aktivering av brennvidde heft kinase (FAK) i eggstokkreft. Faktisk økende bevis tyder på at ITGB4 spiller en sentral rolle i funksjoner knyttet til carcinoma progresjon [31] – [33]. Interessant, FAK har vært knyttet til integrin-signalveier via interaksjon med integrin-assosierte proteiner som paxillin og talin [34] – [37] med resulterende virkning på cellemigrering [37], [38]. Videre, i mus xenograft modeller av menneskelig eggstokkreft, hemming av Hh signalveien kan fremme omfattende celledød og redusere tumorvekst
in vivo
. Våre funn tyder på at diminishment av crosstalk mellom fosforylert FAK og ITGB4 grunn av nedregulering av Gli familie transkripsjonsfaktorer kan spille en sentral rolle for å hemme kreft progresjon eggstokkreft.
Resultater
nedregulering av ekspresjon Gli svekker eggstokkreft cellemigrering og invasjon
Tidligere studier har antydet at avvikende aktivering av Hh-signalering er implisert i en rekke av aggressive humane karsinomer [10], [12], [16]. I denne studien vi først undersøkte effekten av GANT61, en spesifikk inhibitor av Gli1 og Gli2 [29], [39], på den Hh signalveien ved å måle ekspresjonen av Hh-reseptorer (ptch og SMO) og effektorer (Gli1 og Gli2 ). GANT61 hemmet uttrykk for transkripsjonsfaktoren Gli1 og Gli2 (figur 1A og B). Tilsvarende GANT61 hemmet uttrykk for ptch, en nedstrøms mål av Gli [40]. Også benyttet vi immunfluorescens teknikk for å undersøke effekten av GANT61 på uttrykk for Gli. Immunfluorescens bilde viste GANT61 hemmet uttrykk for Gli2 (Tall 1C og D). Disse data tyder på at GANT61 kan hemme Hh signalveien
(A) Eksponering for GANT61. (30 mikrometer, 48 timer) reduserer uttrykk for både Gli1 og Gli2 protein, bestemmes av Western blot. GAPDH ble brukt som kontroll lasting. (B) Uttrykk for både Gli1 og Gli2 mRNA er redusert etter behandling med GANT61 (30 mikrometer, 48 timer), bestemmes av real-time PCR. (C, D) GANT61 hemmer uttrykk for Gli2 i eggstokkreft celler. ES2 og SKOV3-celler ble behandlet med kontroll bærer (DMSO) eller GANT61 (20 uM) i 48 timer. Deretter ble cellene farget med Gli2 og visualisert under en konfokal mikroskop. Scale bar, 10 mikrometer. (E, F) Blokade av Hh-signalering hemmer eggstokkreft cellemigrering. Konfluent ES2 cellemonolag ble såret med en pipettespiss og deretter behandlet med N-Shh betinget medium pluss kontroll bærer (0,2% DMSO) eller GANT61. Celle migrasjon til sårområdet ble overvåket ved mikroskopi. Prosentandelen av det totale området som dekkes av cellene ble deretter vurdert ved hjelp av NIH Image programmet. (G, H) Blokade av Hh-signalering hemmer eggstokkreft celle invasjon. SKOV3-celler (1 x 10
5-celler /brønn) ble sådd ut i det øvre kammer. Vekstmedium inneholdende N-Shh (0,5 pg /ml) alene eller sammen med GANT61 (20 uM), kontroll bærer (0,2% DMSO) ble tilsatt til det nedre kammer. Etter 24 timers inkubering ble cellene som invaderte den nedre overflate av innsatsen farget med krystallfiolett og tellet ved mikroskopi. De representative bilder fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Scale bar, 200 mikrometer. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD for eksperimenter utføres tre ganger. **,
P .
0,01, sammenlignet med kontrollgrupper
Neste, vi testet effekten av Hh signale på motilitet av menneskelige eggstokkreft celler ved hjelp av en
i vitro
sårhelende analysen. To humane ovarie cancer cellelinjer ES2 og SKOV3 ble behandlet med den betinget medium inneholdende N-Shh (0,5 ug /ml) og kontrollmediet. Vi fant ut at N-Shh betydelig forbedret ES2 og SKOV3 celle migrasjon (data ikke vist). For å bekrefte at bidraget fra Hh signalering til motiliteten av eggstokkreft celler, ble cellene behandlet med en inhibitor av Hh signalveien. Den ytterligere inkubering av N-Shh-behandlede celler med økende konsentrasjoner av GANT61 reversert den stimulerende effekt av N-Shh på cellemigrering i ES2-celler, sammenlignet med celler behandlet med N-Shh pluss kontroll kjøretøy (fig 1E og F), noe som tyder på at GANT61 hemmet ES2 celle migrasjon. Videre ble effekten av Hh signalering på den invasive evnen til eggstokkreft celler målt ved anvendelse av en Matrigel invasjon assay. Muligheten av eggstokkreft celler til å invadere Matrigel ble markert forbedret ved behandling med Shh (Tall 1G og H). Omvendt ble det Shh-indusert invasivitet av SKOV3-celler redusert med nesten 64% i celler som ble også behandlet med GANT61 (figurene 1 G og H), noe som tyder på at Hh signalisering har en viktig rolle i motiliteten av eggstokkreft celler.
hemming av Hh signale endrer genuttrykk profiler av eggstokkreft celler
for å undersøke hvilken rolle den Hh signalveien i initiering og progresjon av kreft i eggstokkene, vi målte genuttrykk nivåer i respons til hemming av Hh signalering i eggstokkreft celler ved hjelp av et cDNA microarray teknikk. SKOV3-celler ble behandlet med enten 20 uM GANT61 eller DMSO som vehikkelkontroll i 60 timer. Deretter sammenlignet vi genuttrykk profiler av GANT61-behandlede SKOV3 celler og DMSO-behandlede celler med Illumina® Sentrix® BeadChip arrays. Ekspresjonen av 18,401 humane gener ble profilert i kontrollceller behandlet med vehikkel og i celler behandlet med GANT61. Gener med en
DiffScore
mindre enn -20 eller mer enn 20 (dvs.
P
-verdi 0,01) ble betraktet som differensielt uttrykte gener (degs) indusert ved GANT61 relativt til bærerkontroll. Av de 412 degs unike for SKOV3 (20 mikrometer GANT61 for 60 timer), 208 gener (50,5%) ble oppregulert og 204 gener (49,5%) ble nedregulert (figur 2A). Og nesten alle av
degs product: (392/412) viste en betydelig uttrykk endring etter GANT61-behandling (endring 2,0). Gener med vesentlige endringer i uttrykk følgende GANT61 behandling ble klassifisert i ulike kategorier basert på veldokumentert og etablert biologisk eller patologisk funksjon (figur 2B). Disse degs i respons på behandling med GANT61 hovedsakelig tilhører følgende kategorier: focal vedheft, MAPK signal, cellesyklus, p53 signal, ekstracellulære matrix (ECM) reseptor interaksjon, Wnt signal, ErbB signal, Toll-like receptor signal, NOD- like receptor signalering og cytokin reseptor interaksjon. Degs opererer i fokal adhesjon i GANT61-behandlede celler er presentert i et varmekart (figur 2C). Gjennom dette kartet, fant vi at 19 gener ble vesentlig forskjellig uttrykt, inkludert syv oppregulert gener og 12 nedregulert gener, sammenlignet med kontroll SKOV3 celler. Interessant, noen degs observert i det sentrale vedheft som LAMC2, ITGA5, LAMA3, ITGB4, COL1A1, THBS1 og COL5A1 ble også funnet blant degs i ECM-reseptor interaksjon. Disse funnene antyder at brenn adhesjon og ECM-reseptor interaksjon krysstale i SKOV3-celler etter behandling med GANT61, og uttrykket endring av «fokal adhesjon» -relaterte gener spiller en viktig rolle i respons til GANT61-behandling.
(A) Identifisering av forskjellig uttrykt gener (degs) i GANT61-behandlede SKOV3 celler. Celler ble behandlet med GANT61 (20 uM) eller DMSO i 60 timer, og total RNA ble ekstrahert som beskrevet i Metoder. Endringer i genekspresjon ble bestemt av cDNA microarray genet profilering hjelp av Illumina Menneskelig HT uttrykk BeadChip V4 (Illumina Inc., San Diego, California). Differensial uttrykk for degs vises. (B) Den øverste 11 kanoniske signalveier påvirket av hemming av Gli1 /Gli2 funksjon i SKOV3 celler. De øverste 11 kanoniske signalveier, bestemmes av IPA, som var signifikant oppregulert eller nedregulert ved GANT61 behandling i SKOV3 celler, vises. De 412 degs ble kartlagt til IPA definerte nettverk. De betydelige
P
-verdier som bestemmer sannsynligheten for at sammenhengen mellom gener i datasettet og den kanoniske veien er ved en tilfeldighet alene ble beregnet ved Fishers eksakte test, og er uttrykt som -log (
P
-verdi). (C) Heat kartet degs i det sentrale vedheft signalveien i GANT61-behandlede SKOV3 celler. Varmen Kartet viser at 17 gener ble vesentlig forskjellig uttrykt, inkludert syv oppregulert gener og 12 nedregulert gener, i GANT61 behandlet i forhold til å kontrollere SKOV3 celler. (D) Utvalgte degs fra cDNA rekke genuttrykk profilering analysert ved real-time PCR. SKOV3-celler ble behandlet med DMSO eller GANT61 i de angitte tidsrom, total-RNA ble ekstrahert for real-time PCR som beskrevet i Fremgangsmåter ved bruk av primersettene i tabell 1. Dataene representerer gjennomsnittet ± SD for tre bestemmelser, og GAPDH ble brukt til å normalisere de relative mRNA nivåer.
for å finne ut hvor robust cDNA microarray gene expression profilering etter behandling av SKOV3 celler med GANT61, ble real-time PCR benyttes for å bestemme endringer i uttrykket av den valgte gruppe på seks degs identifisert fra cDNA mikromatriser. De involverte gener og syntetiserte primerene er vist i tabell 1. Sanntids-PCR ble utført på cDNA som ble generert ved hjelp av total-RNA uavhengig isolert fra GANT61-behandlede SKOV3-celler for 0 timer, 36 timer og 60 timer. GAPDH ble brukt til å normalisere alle real-time PCR data (figur 2D). Endringene fastsatt av real-time PCR ble funnet å være i tråd med microarray analyse, og dermed validere sin betydning. Samlet er disse dataene indikerer at Hh signalveien kan spille en sentral rolle i motilitet og invasivitet av eggstokkreft celler.
ITGB4 formidler Hysj-indusert migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler
Tallrike studier har vist at ITGB4-FAK signale kan modulere metastatisk potensial for eggstokkreft celler ved å bryte ned basalmembran barrierer og fremme cellemotilitet [41] – [43]. For å finne ut om Hysj-stimulert cellemigrasjon og invasjon resultat av forhøyede nivåer av ITGB4 protein, undersøkte vi uttrykket nivået av ITGB4 bruker Western blot analyser og real-time PCR. Den ITGB4 ekspresjon ble øket etter N-Shh stimulering, med nivåer 3 ganger større enn ubehandlede celler blir observert etter 24 timer (figurene 3A, B og C). I motsetning til dette ble ITGB4 ekspresjon betydelig redusert i nærvær av GANT61 (figurene 3D og E). For å avgjøre om oppheving av ITGB4 signale kunne blokkere Hysj-stimulert cellular motilitet og invasjon, blokkerte vi ITGB4 signale ved hjelp av en anti-ITGB4 blokkering antistoff. Som vist på figur 3F, ble de stimulerende virkninger av N-Shh på cellemigrering og invasjon fullstendig opphevet ved hjelp av anti-ITGB4 blokkerende antistoff, men ikke med normalt IgG.
(A, B) Stimulering av N-Shh opp-regulerer ITGB4 uttrykk. SKOV3-celler ble inkubert i nærvær eller fravær av N-Shh (0,5 ug /ml) i 24 timer. Western blot ble deretter utført for de angitte antistoffer. Protein uttrykket ble kvantifisert av Image J og normalisert til GAPDH. (C, D) Inhibering av Gli1 nedregulerer ITGB4 uttrykk. SKOV3-celler ble behandlet med GANT61 eller DMSO i 48 timer. Western blot ble deretter utført med de angitte antistoffer. Protein uttrykket ble kvantifisert av Image J og normalisert til GAPDH. (E, F) Blokade av ITGB4 inhiberer celle invasjon i SKOV3-celler. SKOV3-celler dyrket i lav serum (2% FBS) vekstmedium ble podet inn i de øvre kamrene. Den lave serum-dyrkningsmedium inneholdende N-Shh (0,5 ug /ml) sammen med anti-ITGB4 antistoff (0,2 pg /ml) eller kontroll-IgG ble tilsatt til det nedre kammer. Etter 24 timers inkubering ble cellene som invaderte den nedre overflate av innsatsen farget med krystallfiolett og tellet ved mikroskopi. (G) Gli1 miRNAi inhiberer ekspresjonen av ITGB4 i SKOV3-celler. SKOV3 celler ble transient transfektert med kjøretøy (Lipofectamine alene), kontrollere miRNAi og Gli1 miRNAis (MIR-Gli1-720 og MIR-Gli1-1863), henholdsvis. Western blot viste at Gli1 miRNAi hemmet uttrykket av ITGB4 gener. (H) lyddemping Gli1 uttrykk svekker Hysj-indusert eggstokkreft celle invasjon. SKOV3-celler ble transfektert med Gli1 miRNAi eller tak miRNAi i 24 timer, etterfulgt av stimulering med N-Shh (0,5 ug /ml) eller kontrollmedium i ytterligere 24 timer. Celle invasjon ble målt som beskrevet i Metoder. (I, J) Dempe ITGB4 uttrykk svekker Hysj-indusert eggstokkreft celle invasjon. SKOV3-celler ble transfektert med ITGB4 miRNAi-konstruksjonene (MIR-ITGB4-2255 og MIR-ITGB4-4027) eller tak miRNAi i 24 timer, etterfulgt av stimulering med N-Shh (0,5 ug /ml) eller kontrollmedium i ytterligere 24 timer. Western blot viste at ITGB4 miRNAis hemmet ekspresjon av ITGB4 genet (I). Celle invasjon ble målt som beskrevet i metode (J). Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD for eksperimenter utføres tre ganger. **,
P .
0,01, sammenlignet med kontrollgrupper
For å bekrefte rollen som transkripsjonsfaktor Gli i formidling ITGB4 uttrykk, vi transfektert SKOV3 celler med miRNAi konstruerer rettet mot Gli1 . Immunoblot analyse i Figur 3G viste MIR-Gli1-720 og MIR-Gli1-1863, som reduserte uttrykk for Gli1 av 5- og 4 ganger, henholdsvis betydelig redusert ITGB4 subenhet uttrykk. Neste, vi evaluert effekten av direkte stanse av Gli1 uttrykk på celle atferd. Som vist i figur 3 H, ble en signifikant reduksjon i celle invasjon observert i Gli1 miRNAi-behandlede celler som vurdert av celle invasjon analysen. Til slutt, søkte vi å finne ut om ITGB4 bidrar til invasiv fenotype mediert av Hh signalering. For disse eksperimentene benyttet vi sterkt invasive eggstokkkreftceller SKOV3 [30]. ITGB4 uttrykk ble undertrykket ved hjelp av bestemte miRNAi konstruksjoner, og Shh stimulert cellular invasjon av behandlede celler til ikke-targeting (MIR-kontroll) eller ubehandlede celler ble sammenlignet. Tapet av ITGB4 uttrykk (figur 3I) reduserte Hysj-stimulert celle invasjon av SKOV3 celler ved -60% sammenlignet med ubehandlet eller ikke-targeting (MIR-kontroll) miRNAi-transfekterte celler (figur 3J), noe som tyder på at ITGB4 er viktig for tumorcelle invasjon.
Shh fremmer bevegelighet og invasivitet av eggstokkreft celler gjennom ITGB4-mediert aktivering av FAK signale
for å belyse de molekylære mekanismene bak Hysj-stimulert ITGB4 respons i mobilnettet motilitet og invasjon av eggstokkreft celler, evaluert vi FAK protein uttrykk og aktivering av ITGB4 å finne ut om de var påvirket av Hh signalering. Som vist i figur 4A, ble fosforylering av FAK (Tyr397) funnet å være betydelig forbedret som et resultat av N-Shh stimulering. Imidlertid, til tross for nærvær av N-Shh, behandle SKOV3-celler med anti-ITGB4 blokkerende antistoff betydelig redusert fosforylering av FAK (Tyr397) (figurene 4A og B). I tillegg stimulerende SKOV3-celler med økende konsentrasjoner av N-Shh avslørte at ekspresjonen av ITGB4 og fosforylering av FAK (Tyr397) økte på en doseavhengig måte (data ikke vist). Videre ble fosforyleringen av FAK (Tyr397) reduseres i celler som ble cotreated med GANT61 sammenlignet med celler behandlet med N-Shh pluss kontroll kjøretøy (figurene 4C, D og F). Reprobing med et antistoff rettet mot total FAK har ikke vist noen vesentlig forandring i protein og mRNA-nivåer (Figurer 4C, D og E), noe som tyder på at den observerte økning i ekspresjon ikke forekomme som et resultat av en økning i mengden av total FAK protein, som er i overensstemmelse med resultatene som blokaden av Hh signale redusert ekspresjon av ITGB4 (figurene 3D og G). Interessant, da den Hh signalveien ble blokkert ved hjelp av GANT61, en redusert ekspresjon av paxillin, som er nedstrøms av FAK [44], ble observert (figur 4C og D). Tilsvarende hemming av Hh signale resulterte i avbrudd av cytoskeletal organisasjon i eggstokkreft celler (Figur 4G). Disse funnene tyder på at Hh signale spiller en avgjørende rolle i induksjon av FAKfosforylering og cytoskeletal organisasjonen.
(A, B) Hh signale aktiverer FAK gjennom ITGB4. SKOV3-celler ble behandlet med ITGB4-antistoff eller kontroll-IgG i nærvær eller fravær av N-Shh (0,5 ug /ml) i 24 timer. Uttrykk og fosforylering av FAK (Tyr397) ble verifisert av Western blot. (C-E) Blokkering av Gli nedregulerer fosforylering nivåer av FAK (Tyr397), men ikke FAK-protein ekspresjon. SKOV3-celler ble behandlet med GANT61 eller DMSO i 24 timer. Deretter Western blot ble utført ved anvendelse av de angitte antistoffer. N.S, ingen betydning. (F, G) undertrykkelse Gli uttrykk reduserer fosforylering av FAK (Tyr397) og cytoskeletal organisasjon. SKOV3-celler ble behandlet med GANT61 i 48 timer. Deretter ble cellene farvet med antistoff mot fosforylering av FAK (Tyr397) og visualisert ved anvendelse konfokalt mikroskop (F). For F-aktin-farging, ble celler inkubert med Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, A12379) i 20 minutter, og visualisert ved hjelp av konfokal mikroskop (G). (H) Tap av Gli-FAK signale svekker Hysj-indusert eggstokkreft celle invasjon. SKOV3-celler ble transfektert med kontroll-miRNAi eller Gli1 miRNAi (MIR-Gli1-720) i 24 timer, etterfulgt av stimulering med N-Shh (0,5 ug /ml) sammen med PF573228 (5 pM), en spesifikk inhibitor av FAK, eller kontroll kjøretøy (DMSO) i ytterligere 24 timer. Celle invasjon ble målt ved invasjon assay, som beskrevet i Metoder. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD for eksperimenter utføres tre ganger. **,
P
0,01, sammenlignet med kontrollgrupper. Scale bar, 20 mikrometer.
For å vurdere rollen til ITGB4-FAK signalering i ytterligere Hysj-stimulert cellemigrasjon og invasjon, vi også hemmet og slått ned FAK i SKOV3 celler og analysert for cellular motilitet og invasjon. Viktigere, ytterligere behandling med PF573228, en spesifikk inhibitor av FAK [45], fullstendig reversert motile og invasive virkninger av Hh signalering på SKOV3-celler (figur 4 H). Videre er forbigående ekspresjon av FAK miRNAi redusert evne til N-Shh for å stimulere migrering og invasjon av disse cellene sammenlignet med celler behandlet med styre miRNAi (data ikke vist). Av notatet, ble reduksjon av FAK uttrykk med en bestemt miRNAi konstruere brukt her vist tidligere [46]. Samlet utgjør disse funnene viser at Hh signale modulerer migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler gjennom ITGB4-mediert aktivering av FAK signalering.
blokkaden av Hh signale hemmer eggstokkreft vekst
in vivo
for å estimere de potensielle veksthemmende effekter av GANT61
in vivo
, vi deretter implantert SKOV3 celler sc i mus. Behandling med GANT61 (25 mg /kg, tre ganger per uke) en signifikant reduksjon i vekst av tumorer sammenlignet med løsningsmiddelkontrollen (figur 5A). Dette ble også gjenspeiles i slutt tumor vekter på dag 15, som var signifikant lavere i GANT61 behandlede gruppen (figur 5B). Vi undersøkte også om Gli kan være nedregulert av denne behandlingen. Western blot analyser av tumorvev viste at behandling med GANT61 faktisk nedregulert Gli1 og Gli2 i vev (figur 5C og D). I tillegg, ble intensiteten av både ITGB4 og fosforylering av FAK (Tyr397) signifikant redusert i tumor deler av GANT61 gruppen sammenlignet med oppløsningsmidlet kontrollgruppen (figur 5E og F). Dette resultatet tyder på at nedregulering av Gli reduserer ekspresjon av ITGB4 og den fosforylerte FAK, noe som resulterer i hemming av tumorvekst
in vivo
.
SKOV3-celler (2 x 10
7) ble implantert sc inn mot flanken av BALB /c nu /nu mus. Deretter ble musene mottok enten GANT61 (25 mg /kg s.c., tre ganger per uke) eller oppløsningsmiddel (maisolje: etanol 04:01). Behandlingen ble igangsatt i alle grupper (n = 8 hver gruppe) når gjennomsnittlig tumorvolum hadde nådd 100 mm
3. (A) Behandling med GANT61 ført til en betydelig vekst hemming av xenopodet menneskelige eggstokkreft svulster. n = 8; **
P
0,01. (B) Forsøket ble avsluttet på dag 15, og tumorene ble skåret ut. Endelige tumorvektene i GANT61 behandlingsgruppen (n = 8) var signifikant lavere sammenlignet med utskårende svulster i oppløsningsmidlet kontrollgruppen (n = 8). **
P
0,01. Kolonner, mener; barer, SD. (C, D) Western blot analyser for Gli1 og Gli2 i tumorvev. Behandling med GANT61 redusert uttrykk for Gli1 og Gli2. (E, F) Immunhistokjemisk bilde av svulstvev delen. Behandling med GANT61 redusert ekspresjon av ITGB4 (E). En betydelig reduksjon i fosforylering av FAK (Tyr397) ble også effektivt oppnådd ved GANT61 behandling (F). Scale bar, 20 mikrometer
Diskusjoner
Selv om den kritiske rollen Hh signalisering i tumorigenesis har vært fremhevet [47] -. [50], de molekylære mekanismer som Hh signale pathway formidler metastase er ikke godt forstått. Her rapporterer vi at Hh signalveien fremmer eggstokkreft celle migrasjon og invasjon
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre fant vi at aktiveringen av Hh signalveien indusert ITGB4 uttrykk og aktivering av FAK. Til slutt viste vi at avbrudd i ITGB4-FAK signalering førte til undertrykkelse av Hh-mediert celle migrasjon og invasjon. Basert på disse funnene foreslår vi at den Hh signalveien induserer metastatiske funksjoner av eggstokkreft gjennom ITGB4-mediert aktivering av FAK.
Tidligere studier har antydet at Hh signalering spiller en rolle i kontrollen av motiliteten av multiple celletyper [51] – [53]. Forstyrrelse av Hh signalering av cyclopamine har vist seg å hemme EMT og redusere metastaser i kreft i bukspyttkjertelen celler [20]. Gli overekspresjon indusert lymfatisk metastase, mens hemming av Hh signale redusert cellevekst og motilitet [19]. I denne studien viste vi at migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler ble indusert av N-Shh stimulering og blokkert av abrogere Hh signalering med GANT61 (figur 1). Interessant, også fant vi ut at aktivering av Hh signalveien i eggstokkreft celler indusert ITGB4 gentranskripsjon (figur 3). Videre blokade av ITGB4 signale av en ITGB4-blokkerende antistoff gjør eggstokkreft celler som ikke reagerer på Shh stimulert migrasjon og invasjon, noe som tyder på at ITGB4 modulerer Hh signalisering i eggstokkreft migrasjon og invasjon (figur 3). Til sammen indikerer disse data at abnormal aktivering av denne signale kan bidra til metastase i en rekke krefttyper, inkludert kreft i eggstokkene, og at inhibering av Hh signalveien kan være nyttig for å forebygge metastase. Det er interessant å merke seg at forbedring av ITGB4 genekspresjon ble indusert av N-Shh stimulering (figur 3). Derfor må Hh signalering for å bli ytterligere evalueres for å bestemme om det påvirker aktiviteten av promoteren ITGB4 gjennom en fysisk interaksjon mellom den Gli protein og en spesifikk region av ITGB4 promoteren.
Samle bevis tyder på at integriner kan endre cellular oppførsel gjennom rekruttering og aktivering av signaliseringsproteiner, slik som ikke-reseptor-tyrosin-kinaser, inkludert FAK og c-Src som danner en dobbel kinase kompleks [54]. Den FAK-Src-komplekset binder seg til og kan fosforylere forskjellige adapter proteiner slik som p130C og paxillin [55]. Aktivering av FAK av både integrin og vekstfaktorer spiller en avgjørende rolle i en rekke biologiske prosesser, inkludert celleoverlevelse, proliferasjon, vedlegg, migrering og invasjon [56] – [58]. Overekspresjon av FAK protein har blitt rapportert ved metastaserende menneskelige kolorektal, bryst, prostata og eggstokkreft celler [59] – [62]. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health.
