Abstract
Podoplanin (PDPN), er en mucin-type trans glykoprotein spesifikke for lymfesystemet uttrykt i en rekke humane kreftformer, og regnes som en faktor som fremmer tumorprogresjon. Hensikten med denne studien var å belyse den molekylære rolle PDPN i biologi skjoldbruskkjertelen kreftceller. PDPN uttrykk ble evaluert i primær thyroid karsinomer og skjoldbruskkreft cellelinjer ved RT-qPCR, Western blotting, IF og IHC. For å undersøke hvilken rolle podoplanin i å bestemme en celle ondartet potensial (cellulær migrasjon, invasjon, spredning, adhesjon, bevegelighet, apoptose), ble en skjoldbruskkjertelkreft cellelinje med taushet PDPN uttrykk som brukes. Vi observerte at PDPN var utelukkende uttrykt i kreftcellene på 40% av papillær skjoldbruskkreft (PTC) vev. Videre
PDPN
mRNA og protein ble sterkt uttrykt i PTC-avledet TPC1 og BcPAP cellelinjer, men ble ikke oppdaget i follikulær skjoldbrusk kreft avledet cellelinjer.
PDPN
knock-down betydelig redusert cellulær invasjon, og beskjedent redusert cellevandring, mens spredning og adhesjon ikke ble påvirket. Våre resultater viser at PDPN formidler invasive egenskapene til celler avledet fra papillær skjoldbrusk karsinom, noe som tyder på at podoplanin kan fremme PTC progresjon
Citation. Rudzińska M, Gaweł D, Sikorska J, Karpińska KM, Kiedrowski M, Stepien T , et al. (2014) The Role of Podoplanin i Biology of Differensiert skjoldbrusk kreft. PLoS ONE 9 (5): e96541. doi: 10,1371 /journal.pone.0096541
Redaktør: Jean-Marc VANACKER, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Frankrike
mottatt: 24 januar 2014; Godkjent: 09.04.2014; Publisert: 05.05.2014
Copyright: © 2014 Rudzińska et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stipend 2012/07 /B /NZ5 /02444 fra The National Science Center, Polen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Differensiert thyroideakarsinom (DTC) er den vanligste menneskelige endocrine malignitet. Papillær (PTC) og follikulær (FTC) thyroid karsinomer er to store DTC varianter, med den tidligere representerer den vanligste typen (80% av alle DTC tilfeller) [1]. Den molekylære patogenesen av skjoldbrusk kreft involverer flere molekylære signalveier fortrinnsvis endret i PTC og FTC. PTCs bære onkogene punktmutasjoner i
B-RAF Hotell og
RAS
, og kromosomale rearrangements resulterer i
RET Hotell og
Trka
kimærgenene, som alle kan aktiverer mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) veien [2]. Aktivering
BRAF
V600E punktmutasjon vises i gjennomsnitt 45%, mens
RET /PTC
rearrangements og
RAS
mutasjoner i 10-20% PTC tilfeller [3] , [4,]. I FTCs, i tillegg til
RAS
mutasjon,
PAX8 /PPARy
omorganisering og deregulering av PI3K /ATK /PTEN (phosphatidylinositol-3-kinase /ATK /fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10) signalkaskade blir ofte oppdaget, som er assosiert med progresjon og dedifferentiation gjennom aktivering av PI3K og AKT og inaktivering eller tap av
PTEN
lyddemper genuttrykk [5], [6]. Selv om PTC er ansett for å være en lat lesjon med en gunstig prognose, påvirker utviklingen av lymfeknutemetastaser opp til 50% av PTC pasientene og den videre utvikling av fjernmetastaser i noen diagnostisert cancer reduserer overlevelsesrater [7], [8]. Felles for svulstvekst er formidling av primære kreftceller, noe som kan skje
via
en rekke ruter. Clinicopathological data har vist at papillær karsinom er tilbøyelige til å metastasere til regionale lymfeknuter, noe som tyder på at celler er spredt
via
lymfesystemet [9], [10]. De molekylære mekanismer og genetiske faktorer som er involvert i formidling av PTC-celler, som bestemmer metastatisk potensial av papillær tyreoideacancer, forblir stort sett ukjent.
metastase av kreftceller er en flertrinnsprosess og forskjellige cellulære faktorer uttrykkes svulster kan være involvert. Flere studier har understreket betydningen av lymphangiogenic faktorer i progresjonen av forskjellige tumorer og et antall av regulatoriske molekyler som deltar i lymphangiogenesis er blitt identifisert [11], [12], [13]. En av de viktigste lymphangiogenic molekylene er podoplanin (PDPN). Menneskelig PDPN, også kjent som T1α -2, PA2.26, gp38 eller aggrus, er et 38-kDa type I mucin-lignende transmembrane sialoglycoprotein består av en meget O-glykosylert ekstracellulært domene, et enkelt membran-dekkende region og en kort cytoplasmisk tail [14]. I normale humane vev, er podoplanin uttrykt i nyre podocytes, skjelettmuskel, hjerte, placenta, lunge, og andre steder, [15], [16], [17]. PDPN er uttrykt i det lymfatiske endotelceller (LEC), men ikke i blod endotelceller (BEC), og representerer således en spesifikk markør for lymfatisk endotel og lymphangiogenesis [11]. Til tross for spesifisiteten av dets ekspresjon i lymfatisk endotel, er PDPN også blitt påvist i forskjellige cancere [18], [19], [20]. Den biologiske funksjonen til PDPN er ikke fullstendig definert, men tilgjengelige data tyder sterkt på at det kan spille en viktig rolle som formidler av tumorcelle invasjon [21]. Den detaljerte underliggende mekanismen for spredning av differensierte thyroid tumorceller og kreft progresjon, og spesielt bidraget fra pro-lymphangiogenic molekyler til denne prosessen er dårlig forstått. Derfor er målet med denne studien var å karakterisere uttrykk og funksjon podoplanin i skjoldbruskkjertelen svulster biologi. PDPN uttrykk ble undersøkt i primærsvulster og i et panel av skjoldbrusk kreft cellelinjer avledet fra papillær (TPC1 og BcPAP) og follikulær (FTC133 og CGTH-W-1) thyroid karsinomer. Vi undersøkte også hvilken rolle PDPN i å regulere kjennetegnene ved ondartet cellefenotyp: spredning, vedheft, overlevelse, motilitet, migrasjon og invasjon. For å bestemme funksjonen til denne trans glykoprotein i metastatisk oppførselen til papillær kreft celler, vi utførte RT-qPCR, immunfluorescens og immunhistokjemi, samt Western-blot analyser, og undersøkt
PDPN
knock-down i dyrkede celler . De oppnådde data sterkt at PDPN kan betraktes som en pro-metastatisk faktor som påvirker spredningen av PTC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Studiet ble godkjent av etisk komité menneskerettighetsstudier ved Senter for Postgraduate Medical Education. Vevsprøver ble oppnådd med tillatelse fra de respektive etiske komiteer (ved Kreftsenteret og Institutt for Oncology, på Copernicus Memorial Hospital, og ved Senter for Postgraduate Medical Education). Skriftlig informert samtykke ble oppnådd fra alle pasienter som deltok i denne studien. Ingen industrien ga støtte for denne studien.
Thyroid vevsprøver og cellelinjer
For genuttrykk eksperimenter Dypfryst vev eksemplarer av papillær skjoldbruskkjertelen carcinoma (T) og tilstøtende normalt tyroideavev fra kontralaterale lobe (NT) var samlet på Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center og Institute of Oncology, ved Institutt for General og endokrinologisk kirurgi, Copernicus Memorial Hospital (Warszawa og Lodz, Polen). For immunhistokjemisk (IHC) analyse, arkivert formalinfikserte, parafininnstøpte vev (forskjellige fra de som brukes i RT-qPCR) fra pasienter som hadde gjennomgått total tyreoidektomi ble brukt
Rekken av 173 arkiv vev omfattet.: 112 papillær skjoldbrusk karsinom (94 klassisk PTC med papillær eller blandet papillær-follikulær vekst mønster og 18 follikulær papillær karsinom variants- FvPTC), 27 follicular skjoldbruskkjertelen karsinom (FTC), 24 follikulære adenomer (FA) og 10 normale skjoldbruskkjertelen vev (NT). Vevsprøver ble oppnådd med tillatelse fra de respektive etiske komiteer (ved Kreftsenteret og Institutt for Oncology, på Copernicus Memorial Hospital, og ved Senter for Postgraduate Medical Education).
For funksjonelle studier vi brukte skjoldbrusk carcinoma cellelinjer avledet fra papillær (TPC1 og BcPAP) og follikulær (FTC133 og CGTH-W-1) thyroid karsinomer og SV40-udødeliggjort human thyroid epitel linjen Nthy-ori 3-1 (heretter kalt oss som NTHY) til å representere normal thyroid celler. Cellelinjer ble oppnådd fra den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (BcPAP og CGTH-W-1), og fra European Collection of Cell Cultures (FTC 133 og Nthy-ori 3-1). Den TPC1 cellelinje [22] ble vennlig levert av Dr. M. Santoro (Universitetet i Napoli Federico II, Italia) [23]. Cellene ble dyrket i komplett RPMI-1640 medium supplementert med 10% (v /v) FBS (Roche, Sveits), med unntak av FTC133 celler, som ble dyrket i fullstendig DMEM /F-12 supplert med 10% FBS (Liv Technologies, Invitrogen, USA). Alle celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære.
RNA isolering og sanntids (RT) -qPCR
Total RNA ble isolert fra human thyroid prøver og skjoldbrusk kreft cellelinjer ved hjelp av et RNA Mini Kit (A A Bioteknologi, Polen) i henhold til det anbefalte protokollen, og RNA integritet ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. Total RNA (1 pg) ble anvendt for cDNA syntese med en høy kapasitet cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Applied Biosystems, USA). Ekspresjon av den humane
PDPN
og
18S rRNA-gener
ble kvantifisert ved RT-qPCR ved hjelp av cDNA som templat i reaksjoner inneholdende dobbelt-trådet DNA-spesifikk fargestoff SYBR grønn I og Maxima Fluorescein RT -qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Canada), og spesifikke oligonukleotidprimere (oppført nedenfor), som beskrevet tidligere [24].
PDPN plakater (NM_006474)
Forward : 5′-CGAAGATGATGTGGTGACTC-3 «
Omvendt: 5′-CGATGCGAATGCCTGTTAC-3′
18S rRNA plakater (NM_02255)
Forward: 5 « -CCAGTAAGTGCGGGGTCATAAG-3 «
Omvendt: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′.
Amplification, datainnsamling og dataanalyse ble utført ved hjelp av iQ5 real-Time PCR Detection System og programvare (Bio- Rad, USA).
PDPN stanse med små interfererende RNA (siRNA)
TPC1 celler ble transfektert med siRNA (sluttkonsentrasjon 30 nM) rettet mot menneskelig
PDPN
, (siPDPN , 5′-CGAAGACCGCUAUAAGUCUTT-3 «, Life Technologies, Ambion, USA) og en universell negativ kontroll siRNA (Sigma-Aldrich, USA) under anvendelse av Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Invitrogen, USA) i Opti-MEM (Roche, Sveits) medium , i henhold til de anbefalte protokoller. Effektiviteten av
PDPN
genet inhibering ble evaluert 48 timer etter transfeksjon ved hjelp av RT-qPCR, Western blotting og immunfluorescens. Eksperimentet ble gjentatt fire ganger.
Western blotting
Høstede celler ble vasket to ganger med is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS) og resuspendert i 1% NP-40 lyseringsbuffer (150 mM natriumklorid, 1,0% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) supplementert med 1% protease inhibitor og 1% fosfatase-inhibitor cocktail (Roche, Sveits). Proteiner i cellelysatene ble kvantifisert og prøver av 30 ug ble løst på 8% SDS-PAGE-geler og deretter elektro-overført på nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, USA). Membranene ble blokkert ved inkubering med 5% ikke-fettmelk i TBS (0,1% Tween-20) i 1 time ved romtemperatur og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med primært anti-podoplanin mus monoklonalt antistoff (D2-40, fortynnet 1:1000, ABD Serotec, USA). Etter intensiv vasking ble membranene inkubert med HRP-konjugert affinitets-renset geit-anti-muse-sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch Laboratories, USA). Signaler fra reaktive bånd ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens deteksjon (SuperSignal
® West Dura, Pierce Chemical, USA) som tidligere beskrevet [25]. Som et lastekontroll, ble membranene inkubert med monoklonalt anti-β-aktin-antistoff (fortynnet 1:5000; Sigma-Aldrich, USA) på en identisk måte
Immunofluorescent farging
Celler dyrket. på dekkglass ble fiksert med iskald metanol, blokkert med 2% geiteserum /2% BSA, og deretter inkubert med primære anti-podoplanin D2-40 mus monoklonalt antistoff (1:50; ABD Serotec, USA). Etter flere vaskinger ble cellene inkubert med DyLight
TM549-konjugert anti-mus-IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories, USA). Cellene ble kontra med atom fargestoff DAPI og visualisert med en fluorescens mikroskop (AxioObserver D1, Zeiss, Tyskland) med en 100x olje nedsenking linse.
Immunohistochemistry (IHC)
Immunhistokjemisk farging analyse ble utført på fire-mikrometer tykke deler av arkivformalinfiksert, parafininnstøpte skjoldbrusk vev: PTC (112 tilfeller), FTC (27 tilfeller), FA (24 tilfeller), og NT (10 tilfeller). Snittene ble deparaffinised og varme-indusert antigen henting ble utført i mål henting løsning (TRS, pH 9,0, DAKO, Danmark), oppvarming i 20 min i en trykkoker. Platene ble deretter inkubert med anti-podoplanin D2-40-antistoff i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking ble Envision + antistoff-reagens anvendt (DAKO, Danmark). Reaksjonene ble utviklet ved hjelp av diaminobenzidin (DAB) som kromogen substrat. Seksjonene ble kontra med haematoxylin, montert og undersøkt under et lysmikroskop. Negative kontroller ble fremstilt ved å følge samme prosedyre men ved å utelate inkubasjon med primært antistoff. IHC farging ble evaluert av to uavhengige observatører (MK og BC) og scoret som «negative» eller «positiv», ifølge den relative intensiteten av PDPN farging. De immunhistokjemiske data ble utsatt for statistisk analyse.
Cell migrasjon og invasjon analyser
Cell migrasjon og invasjon aktivitet ble bestemt ved hjelp av en Boyden sette kammer (8-mikrometer porestørrelse, BD Falcon ™ Cell Culture Setter inn, USA) og BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber 8-mikrometer (BD Bioscience, USA), henholdsvis. Celler ble høstet og resuspendert i serumfritt medium, og deretter tellet med en EVA automatisk celleteller (Nano ENTEK, Korea). Totalt 2 x 105-celler ble resuspendert i RPMI 1640 medium (for både overførings- og invasjons analyser) ble tilsatt til kamrene og inkubert i 24 timer ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2 atmosfære. RPMI-medium supplert med 10% FBS ble anvendt som kjemotiltrekkende. Celler som hadde migrert eller invadert gjennom membranen ble fiksert og farget ved hjelp av en Diff-Quik Kit (Medion Diagnostics, Sveits), fotografert ved 40x forstørrelse med et Olympus BX41 mikroskop, og telles. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer og gjentatt tre ganger.
In vitro
sårheling motilitet analyse
Riper av sammenlignbare dimensjoner ble gjort på konfluent cellemono (dyrket i 6- brønners plater) ved hjelp av en steril 200 mL pipettespissen. Monolagene ble deretter vasket med PBS for å fjerne frigjorte celler og celleavfall, og deretter etterfylt med vekstmedium og inkubert ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Platene ble observert og fotografert under et lysmikroskop (10x, AxioObserver D1, Zeiss, og 20x Nikon Diaphot 300) hver i 3 timer for å bestemme hastigheten for sårheling. Bredden av sårene på hvert tidspunkt ble målt i 5 uavhengige felter ved hjelp av ImageJ programvare (www.rsbweb.nih.gov). Den cellemigrering avstand ble bestemt ved å måle bredden av såret dividert med to, og ved å subtrahere denne verdi fra den første halv-bredde sår [26]. Avstand ble kvantifisert som følger: med 10x objektiv, en piksel = 1,026 mikrometer; med 20x objektiv, 1pixel = 0,43 um.
Celleviabilitet assay
å evaluere celleproliferasjon, antallet levedyktige celler ved 24 og 48 timer etter transfeksjon med siRNA ble bestemt ved bruk av en 2, 3-bis- (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) tetrazolium celleproliferasjon kit (EZ4U, Biomedica GmBH, Østerrike). Kort beskrevet ble brønner på 96-brønners plater podet med 8 x 10
3-celler (5 replikater). Deretter ble 25 ul av XTT blanding reagens tilsatt til hver brønn og absorbans ved testen bølgelengde (450 nm for å måle formazan produksjon) og referansebølgelengden (620 nm) ble målt ved forskjellige tidspunkter ved anvendelse av en Labsystems Multiscan RC mikroplateleser (Thermo Fisher Scientific, USA).
apoptose analysen
Apoptose ble evaluert ved hjelp av en Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (Abcam, UK) etter den anbefalte protokollen. I korthet, ble høstede cellene vasket med PBS, inkubert med FITC-Annexin V og propidiumjodid i 5 min ved romtemperatur og ble deretter undersøkt ved hjelp av strømningscytometri (FACSCantoII, BD Biosciences, USA). Eksperimentet ble gjennomført tre ganger.
Dataanalyse
Alle forsøkene ble utført minst tre ganger. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av parametriske Mann-Whitney U-test og paret t-test (GraphPad, Prizm, USA). En
P
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Multivariat logistisk regresjonsmodell ble brukt til å undersøke sammenhengen mellom uavhengige kovariater og podoplanin tumorous uttrykk.
Resultater
PDPN protein uttrykk og cellulær lokalisering
uttrykk for podoplanin ble først evaluert i arkiv thyroid tumor vevsprøver. Immunhistokjemisk analyse ble utført på en serie av 173 parafininnstøpte vev (112 PTC, 27 FTC, 24 FA og 10 NT) ved bruk av anti-podoplanin monoklonalt antistoff D2-40. I normal tyroideavev PDPN farging var fraværende i follikulære celler og anti-PDPN antistoff merket utelukkende og sterkeste å bare lymfatiske endotelceller i de mange lymfekar, som fungerte som en god intern kontroll (figur 1A, a). Alle analyserte FTC og FA prøvene var negative for PDPN immunoreaktivitet (figur 1A, b., C). Flertallet av de undersøkte PTCs var også negativ for PDPN merking (figur 1A;. D). Imidlertid, 40% (45 av 112) av PTCs viste positiv farging for podoplanin (figur 1A;. E-l). Forskjellige intensiteten av PDPN merking (fra moderat til sterk) ble observert i cytoplasma av tumorceller og i de fleste tilfeller ble flekker som er jevnt fordelt på tvers av kreft. I motsetning peritumoral vev celler (anses som «normal tyroideavev») var helt PDPN negativ (se figur 1A, e., J, k, l). I disse kreftfrie normale tyroideavev marginer, D2-40 antistoff merket eksklusivt og sterkt lymfekar i forskjellige størrelser og former. Foreningen av PDPN uttrykk i tumor vevsprøver med clinicopathological data ble vurdert ved multivariate logistisk regresjonsmodell og oppsummert i tabell 1. Cytoplasmatiske PDPN uttrykk var ikke statistisk signifikant forskjellig mellom pasienter med større eller mindre tumorstørrelse (PT) eller histologisk (FvPTC
vs
klassisk PTC) subtype. Selv om det var et høyeste antall tilfeller (9 positive tumorer hos 17 testet) med indusert podoplanin cytoplasmisk ekspresjon i pT3 gruppe og intensiteten av fargingen var sterk i alle positive tumorer, antallet tilfeller i gruppen var for liten til å bli statistisk analysert. Imidlertid podoplanin protein-ekspresjon ble signifikant korrelert med pasientens alder. Eldre PTC pasienter (≥45) viste oftere (69%
vs
31%) PDPN neoexpression da de yngre ( 45), (justert odds ratio 4, 95% konfidensintervall 1,76 til 9,2,
P
. 0,001)
A. Immunhistokjemi påvisning av podoplanin ble gjennomført på parafininnstøpte vevssnitt. Representative immunofarging resultater erholdt med anti-PDPN monoklonalt antistoff D2-40. (A) eksklusiv og sterk farging av lymfekar i normal skjoldbruskkjertelen vev; (B) follikulær adenom (FA) vev negativ for podoplanin; (C) follikulær skjoldbruskkjertelen carcinoma (FTC) vev negativ for podoplanin; (D) papillær thyroideakarsinom (PTC) tilfelle negativ for podoplanin; (E-l) intens cytoplasmisk farging av PDPN i PTC-celler. I e, j og jeg intens farging av PDPN i tumorceller, med peritumoral margin negativt for podoplanin og sterk farging av lymfekar som en intern positiv kontroll. Original forstørrelse: a-100x, a-innfelt -100x; b-200X, b-innfelt -100x; c-200x; d-200X, e-100x, f-100x, g-200x; h-200X, i-100x, j-200X, k-200X, l-400x. Av 112 PTC tilfeller, 45 (40%) som vises utenfor livmoren podoplanin uttrykk i kreftcellene. B. Relativ PDPN mRNA-ekspresjon i 21 PTCs (T) og parede normale vev (NT) analysert ved RT-qPCR. PDPN og 18S rRNA transkripsjonsnivåer ble kvantifisert og podoplanin uttrykk normalisert mot den av husholdningsgenet (18S rRNA). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM, **
P
. 0,001
Vår analyse ble utvidet med en undersøkelse av
PDPN
genet uttrykk i serie med kirurgisk fjernet PTC /NT sammenkoblet vev ved hjelp av RT-qPCR. I 14 av de 21 analyserte PTC /NT tilfeller, en betydelig høyere (
P
0,001) nivå
PDPN
avskrift ble påvist i PTC prøvene sammenlignet med tilsvarende normale skjoldbrusk vev (Fig . 1B). I de resterende 7 PTC /NT parene, nivået av
PDPN
mRNA i PTC vev var lik eller enda lavere enn i de sammenkoblede normalt vev.
Expression og cellulær lokalisering av PDPN i skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer
for å undersøke den funksjonelle rollen podoplanin i skjoldbruskcellebiologi vi undersøkt en normal skjoldbruskcellelinje (NTHY), og et panel av papillær (TPC1 og BcPAP) og follikulær (FTC133 og CGTH- W-1) thyroid kreft-cellelinjer utvunnet. Nivået av
PDPN
mRNA var svært lav i de immortaliserte NTHY celler (Fig. 2A). I skjoldbrusk carcinoma celler, store forskjeller i hvilke forhold ble observert
PDPN
karakternivået mellom celler som stammer fra PTC og FTC. TPC1 og BcPAP celler viste det høyeste nivået av
PDPN
mRNA uttrykk blant alle de testede skjoldbruskkjertelen carcinoma cellelinjer. I kontrast til
PDPN
avskrift ble ikke påvist i FTC133 og CGTH-W-1 follikulære kreft cellelinjer utvunnet (Fig. 2A). I gjennomsnitt, nivået av
PDPN
mRNA i PTC cellelinjene var mer enn tre ganger høyere enn i de NTHY kontrollcellene.
A. PDPN mRNA uttrykk i menneskelig skjoldbrusk kreft cellelinjer. RT-qPCR ble anvendt for å evaluere nivået av transkript som koder for podoplanin i total RNA fremstilt fra NTHY kontrollcellene, PTC-avledet TPC1 og BcPAP cellelinjer, og FTC-avledede FTC133 og CGTH-W-1-cellelinjer. Data fra fire uavhengige eksperimenter utført in triplo er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM, **
P
0,001. B. Podoplanin protein nivåer i menneskelig skjoldbrusk kreft cellelinjer. Proteinekstrakter (30 ug) ble underkastet Western blot-analyse med anti-PDPN monoklonalt antistoff D2-40 og β-actin-antistoff som en lasting kontroll. C. Immunofluorescensanalyse av podoplanin uttrykk i TPC1, BcPAP, FTC133 og CGTH-W-en skjoldbrusk kreft cellelinjer. PDPN ble visualisert ved farging ved anvendelse av anti-PDPN monoklonalt antistoff D2-40, etterfulgt av DyLight549-konjugert sekundært antistoff (rød), og kjerner ble motfarget med DAPI (blå). Forstørrelse 1000x.
Podoplanin protein uttrykk og cellulær lokalisering i skjoldbruskkjertelen kreftcellelinjer
For å underbygge RT-qPCR resultater, gjennomførte vi Western blotting og immunfluorescence analyser for å evaluere PDPN protein uttrykk og bestemme dens cellulær lokalisering i skjoldbrusk kreft cellelinjer. De podoplanin protein nivåer anslått av immunoblotting var i full overensstemmelse med RT-qPCR resultater. PDPN protein ble sterkt indusert i TPC1 og BcPAP cellelinjer, men det ble ikke påvist i FTC-opprinnelsesceller (Fig. 2B). Immunofluorescensanalyse bekreftet den høye nivåer av PDPN i TPC1 og BcPAP celler. Proteinet ble lokalisert hovedsakelig på cellemembraner og i det cytoplasmatiske rommet på PTC-opprinnelsescellelinjer (Fig. 2C). De FTC133 og CGTH-W-1 linjer var negative for PDPN farging, igjen validere RT-qPCR data.
Effekt av PDPN på ondartet cellefenotyp
I lys av sin pro-invasive egenskaper som er rapportert i andre typer humane tumorer og de høye nivåene påvist i PTC prøver vi neste undersøkt om PDPN er involvert i migrasjon og invasjon av skjoldbruskkjertelen kreftceller. TPC1 celler ble transfektert med siRNA målretting
PDPN plakater (TPC1 /siPDPN) og med en universal negativ siRNA (TPC1 /siNEG). Enhver påfølgende nedregulering av podoplanin ble evaluert ved å bruke RT-qPCR, Western blotting og immunfluorescens metoder. Bare ~15% av den opprinnelige
PDPN
karakternivå ble påvist i TPC1 /siPDPN cellene 48 timer etter transfeksjon, noe som bekrefter at den spesifikke siRNA produsert effektiv lyddemping av
PDPN plakater (fig. 3A). Western blotting og immunfluorescence analyser demonstrerte knock-down av podoplanin genuttrykk i disse cellene. Som vist på fig. 3B og 3C, det PDPN protein ble påvist bare i TPC1 celler transfektert med den negative kontroll siRNA. Celleproliferasjon, heft og overlevelse ble så vurdert for TPC1 celler transfektert med
PDPN
-spesifikke og kontroll sirnas. Ingen økning i spredning rate av celler med taushet
PDPN
ble funnet i forhold til (Fig. 3D, venstre panel) kontrollcellene. Vi også observere eventuelle forskjeller i de vedheft egenskaper
PDPN
-silenced og kontrollceller (Fig.3E). Videre var det ingen forskjeller i antall levedyktige ( 90%), apoptotiske og nekrotiske celler mellom spesifikke og uspesifikke siRNA-behandlede TPC1 celler (Fig. 3D, panel til høyre), noe som tyder på at uttrykket av PDPN ikke øke mottakelighet av disse cellene til apoptose.
A. RT-qPCR analyse av PDPN mRNA nivåer i TPC1 skjoldbruskkjertelen kreftceller 48 timer etter transfeksjon med 30 nM siRNA spesifikk for PDPN (siPDPN) eller en negativ kontroll siRNA (siNEG). Resultatene ble normalisert til 18S-rRNA-nivå og stolpene representerer gjennomsnittet ganger endring i PDPN transkripsjon overflod i celler transfektert med siPDPN sammenlignet med celler transfektert med siNEG. Resultatene er representative for fire uavhengige eksperimenter. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM, **
P
0,001. B. Western blot analyse av podoplanin og p-aktin-proteiner i celler TPC1 før (0-t) og 48 timer etter transfeksjon med siPDPN og kontrollere siNEG. C. Immunofluorescensanalyse farging av podoplanin protein i TPC1 celler transfektert med siPDPN og kontrollere siNEG. Celler ble farget med anti-PDPN monoklonalt antistoff D2-40, etterfulgt av DyLight549-konjugert sekundært antistoff (rød), og motfarget med DAPI (blå). Forstørrelse 1000x. D. Effekt av PDPN på celle levedyktighet. D, venstre panel. Spredning ble målt til 24 og 48 timer etter transfeksjon av TPC1 celler med siPDPN eller kontrollere siNEG. -Celler utsådd i 96-brønners plater ble behandlet med XTT blanding reagens og formazan-dannelse ble målt ved 450 nm for å bestemme antall levedyktige celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter utført i quintuplicate. D, panel rett. Apoptose ble målt til 48 timer etter transfeksjon av TPC1 celler med siPDPN eller kontrollere siNEG. Celler ble samlet opp og farget med FITC Annexin V og propidium jodid, etterfulgt av strømningscytometri. Representative målinger av andelen av Annexin V + celler er presentert. Hver søyle representerer middelverdi ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter utført i fire paralleller. Funksjon podoplanin i celle adhesjon E.. TPC1-celler transfektert med siPDPN skjerm adhesjon kapasitet sammenlignes med de av siNEG-transfekterte celler. I korthet ble 8000-transfekterte celler sådd ut i brønnene av 96-brønners plater. Etter inkubering i 24 eller 48 timer ble cellemonolagene vasket, fiksert med 4% formaldehyd i 15 minutter og farget med krystallfiolett (Merck, USA). De fargede cellene ble lysert ved behandling med 2% SDS, da intensiteten av flekken frigjort ble kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri ved 550 nm ved bruk av en Multiscan Labsystems RC mikroplateleser (Thermo Fisher Scientific, Canada). Data representerer tre separate forsøk.
Migrasjon og invasjon
For å analysere hvordan redusert PDPN uttrykk påvirker migrative potensialet TPC1 celler, utførte vi en
in vitro
scratch sårheling analysen med celler transfektert med siPDPN eller med kontroll siNEG. En ripe ble gjort i monolag av seeded celler og eventuelle forskjeller i sårheling ble overvåket. I tre uavhengige forsøk, ble helbredelse ved økt cellemotilitet funnet å være raskere for kontrollceller enn for
PDPN
-silenced celler (fig. 4A). Motiliteten av transfekterte celler ble deretter vurdert ved anvendelse av et kammer migrasjonsanalyse. Som forventet, migrasjon av celler med redusert
PDPN
var tydelig forandret (Fig. 4B, venstre panel), som i gjennomsnitt to ganger lavere enn for kontrollceller. Deretter undersøkte vi effekten av
PDPN
knock-down på invasiv potensial av cellene ved hjelp av Matrigel invasjon analysen. Stanse av
PDPN
genet dypt svekket invasiv kapasitet TPC1 celler (Fig. 4B, panel til høyre). I hvert utført eksperimentell replikere, observerte vi en konsekvent og sterk reduksjon i invasivitet av
PDPN
-silenced celler sammenlignet med kontrollene eller foreldre TPC1 celler (data ikke vist).
EN. Scratch sårtilheling analysen. Representative lys mikroskop bilder som viser tilheling av sår i monolag av TPC1 celler transfektert med siPDPN eller kontrollere siNEG, ved 0 ° C og 24% FBS som en kjemoattraktant og etter 24 timer ble celler som hadde migrert inn i 8-um porestørrelse membranen ble farget og fotografert ved 40x forstørrelse. Andelen av trekkende celler er presentert i grafisk form. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra minst tre separate forsøk, **
P
0,001. B, panel rett. Den invasivitet av TPC1 celler transfektert med siPDPN eller kontroll siNEG ble analysert ved å legge til celler til en BD BioCoat Matrigel invasjonen Chamber, 8-mikrometer. Den nedre reservoar ble fylt med 10% FBS som en kjemoattraktant og etter 24 timer ble cellene som hadde beveget seg gjennom Matrigel til den nedre overflaten av membranen fiksert, farget og fotografert ved 40x forstørrelse. Andelen av invaderende celler er presentert i grafisk form. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av minst tre separate forsøk ***
P
. 0,0001
Samlet utgjør disse dataene viser at podoplanin fungerer som en proinvasive
