Abstract
Mutasjoner i
TP53
genet er de mest vanlige forandringer i humane tumorer.
TP53
mutasjonsmønstre har noen ganger blitt knyttet til karsinogen eksponering. I leverkreft, en bestemt G er T transversjon på kodon 249 klassisk beskrevet som et fingeravtrykk av aflatoksin B
1 eksponering. Likeledes G T transversions i kodon 157 og 158 har vært knyttet til tobakk eksponering i humane lungekrefttilfellene. Men kontroversene fortsatt om tolkningen av
TP53
mutasjonsmønsteret i svulster som fingeravtrykk av genotoxin eksponering. Ved å bruke en funksjonell analyse, Functional Analysis of Separert Alleler i gjær (FASAY), denne studien viser mutasjonsmønster
TP53
i normale humane fibroblaster etter
in vitro
eksponering for godt kjente karsinogener: benzo
[a]
pyren, aflatoksin B
1 og acetaldehyd. Disse
in vitro
mønstre av mutasjoner ble deretter sammenlignet med de som finnes i humane svulster ved hjelp av IARC database med
TP53
mutasjoner. Resultatene viser at
TP53
mutasjonsmønstre som finnes i humane svulster kan bare delvis tilskrives genotoxin eksponering. En kompleks samspill mellom det funksjonelle effekten av mutasjonene på p53 fenotype og kreften naturhistorie kan påvirke disse mønstrene. Men våre resultater sterkt støtte at genotoxins eksponering spiller en viktig rolle i forbindelse med utvikling av de vurderte kreft
Citation. Paget V, Lechevrel M, André V, Le Goff J, Pottier D, Billet S, et al . (2012) Benzo
[a]
pyren, Aflatoxine B
1 og Acetaldehyd mutasjonsmønstre i
TP53
Gene Ved hjelp av en funksjonsanalyse: Relevans Human Cancer Etiologi. PLoS ONE 7 (2): e30921. doi: 10,1371 /journal.pone.0030921
Redaktør: Andy T. Y. Lau, Shantou University Medical College, Kina
mottatt: 26 august 2011; Godkjent: 26 desember 2011; Publisert: 03.02.2012
Copyright: © 2012 Paget et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Agence Française de Sécurité Sanitaire de l’Environnement et du Travail (AFSSET; Convention n ° EST-2007-48), den Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche (Convention n ° 16848-2005), den Région Nord-Pas-de-Calais (Convention n ° 08070005) og Ligue Nationale Contre le Cancer, Comité de l’Orne. Unite de Chimie Environnementale ET Interaksjoner sur le Vivant (UCEIV-EA 4492) arbeider i samarbeid med Institut de Recherches en Environnement Industriel (Ireni), som er finansiert av Région Nord-Pas-de-Calais, den Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche, og europeiske fond (Feder). V.P. mottatt en post-PhD fellesskap fra Région Nord-Pas-de-Calais. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Somatiske mutasjoner er en viktig hendelse i kreftutvikling, og det er nå velkjent at kreft innebærer arvelige genetiske faktorer samt epigenetiske forandringer. Vendepunktet under initiering kreft er oppkjøpet av målrettede somatiske mutasjoner som gir til celler en selektiv fordel for klonal spredning. Blant de mange ulike gener som er involvert i denne prosessen,
TP53
fortsatt den hyppigst mutert i kreft hos mennesker, sto for over 70% av alle mutasjonene som er beskrevet så langt i kreft hos mennesker [1]. The International Agency for Research on Cancer (IARC)
TP53
mutasjon database inneholder 27 580 somatiske
TP53
mutasjoner (https://www-p53.iarc.fr/, R15 release) [2] . I motsetning til andre tumorsuppressorgener, det store flertallet av
TP53
mutasjoner er missense snarere enn ikke fornuft eller rammeskifte mutasjoner, som fører til ulike mønstre i ulike kreftformer. Interessant nok har disse mønstrene er noen ganger forbundet med eksponeringen av etiologiske faktorer som for eksempel UV-lys i hudkarsinom [3], tobakk i lungekreft [4], aflatoksin B
1 i hepatokarsinom [5] eller aristolochic syre i nyrekarsinom [ ,,,0],6], [7]. Men tolkningen av
TP53
mutasjonsmønsteret i svulster som et fingeravtrykk av genotoxin eksponering forblir kontroversiell [8]. Faktisk mutasjoner som følge av eksponering for genotoxins og andre cellulære hendelser som oppstår i løpet av kreft påvirke den endelige mutasjonsprofil funnet i humane tumorer, f.eks klonal utvalg av spesielle mutanter, genetisk ustabilitet i kreftceller eller epigenetiske påvirkninger (f.eks metylering status) [9] – [11]
Som mange
TP53
mutasjoner funnet i tumorer sterkt påvirke p53. funksjonelle egenskaper [12], en funksjonell analyse, vises Functional Analysis of Separert Alleler i gjær (FASAY) som en nyttig teknikk for å skille mellom tause mutasjoner i
TP53 Hotell og de som gjør proteinet inaktivt [13], [14]. DNA fra en rekke kilder kan screenes ved FASAY for nærværet av en
TP53
allelet som koder for et protein dysfunksjonell. Vi har tidligere beskrevet mutasjonsmønstre i normale humane fibroblaster etter
in vitro
eksponering for acetaldehyd og aflatoksin B
1 (AFB
1) ved hjelp FASAY [15], [16]. Her har vi fullført disse dataene med de som oppnås med et velkjent genotoxin: benzo
[a]
pyren (B
[a]
P). Eksponering for B
[a]
P og AFB
1 resulterer i dannelsen av voluminøse addukter hovedsakelig rettet mot guanin. Vi vil diskutere hvordan disse kan føre til funksjonelt forskjellige mutasjonsmønstre i ulike svulster.
Videre eksperimentelt generert
TP53
mutasjonsmønstre var sammenlignet med dem i beslektede svulster registrert i IARC database [ ,,,0],2]. Den mutasjonsmønster B
[a]
P ble sammenlignet med de av lungekreft og diskutert grundig i dagens papir. Dermed kunne vi diskutere kausalitet av genotoxins eksponering mot de menneskelige kreftmutasjonsmønstre.
Materialer og metoder
Cell linje og cellekultur
fibroblaster AG1521 (Coriell Institute , Camden, NJ) ble valgt for dette studiet. Fravær av pre-eksisterende mutasjoner i
TP53
locus i disse cellene ble bekreftet ved sekvensering av genomisk DNA med en Beckman Automated Sequencer (CEQ 8000). Celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og 95% luft, i Eagles Minimal Essential Medium (MEM) supplert med 10% inaktivert føtalt bovint serum (FBS). Før eksponering for genotoxin ble mediet gjennomført med 200 ul (4%) av S9 levermikrosomal brøkdel av phenobarbital- og naphtoflavone-behandlede rotter (Biopredic, Rennes, Frankrike), NADPH (4 mm) og G6P (5 mm). Den nødvendige mengde av B
[a]
P (Sigma, CAS nummer: 50-32-8, opp til 200 uM) ble fortynnet i mediet ovenfor og brukt til å behandle celler i 2 timer ved 37 ° C . Post-eksponering, dyrknings Platene ble vasket tre ganger med PBS og inkubert i friskt medium. Som doblingstiden av disse cellene er rundt 3 dager, inkubasjonstid på en uke ble valgt for å tillate to cellesykluser og sikre fiksering av mutasjoner.
Cytotoksisitet studie
AG1521 fibroblaster ble utsatt for B
[a]
P ved konsentrasjoner fra 1 til 200 uM i nærvær av S9, i 2 timer ved 37 ° C i 96-brønners mikroplater. Platene ble vasket tre ganger med PBS og inkubert i 3 dager ved 37 ° C. Cytotoksisitet ble evaluert med en XTT-analyse (Sigma) i henhold til protokollen Scudiero [17].
Post-merking
Post-merking metoden ble tilpasset fra Reddy og Randerath [18]. Genomisk DNA ble ekstrahert ved bruk av den klassiske fenol /kloroform fremgangsmåten etter behandling med RNase A og T1, etterfulgt av proteinase K (Sigma-Aldrich) og etter merking assay ble deretter utført som tidligere beskrevet [19]. Fra autoradiogrammene oppnådd på denne måten, ble flekker svarende til adduktene skåret ut for måling av radioaktivitet. Resultatene er uttrykt som relative addukt Levels (RAL) beregnet som følger: RAL = (cpm
addukter /kpm
BPDE) × 110,7 × 10
-8, hvor cpm
addukter og kpm
BPDE tilsvarer tellinger per minutt fra skåret flekker og fra den positive kontrollen utstedt fra kalv thymus utsatt for B
[a]
P-7,8-Dihydrodiol-9,10-Epoksydtitrering (BPDE), og bærer 110,7 addukter i 10
-8 normale nukleotider som målt ellers [20]. Positiv kontroll ble vennlig levert av F. Beland, Jefferson, USA.
FASAY
RNA ekstraksjon og revers transkripsjon (RT) -PCR ble utført som tidligere beskrevet [15]. For å amplifisere cDNA-primerne inneholdende en fosfortioat binding ved 3′-enden ble utformet: P3 [5′-ATT-TGA-TGC-TGT-CCC-CGG-ACG-ATA-TTG-AA (e) C-3 «] og P4 [5»-ACC-CTT-TTT-GGA-CTT-CAG-GTG-GCT-GGA-GT (e) G-3 «]. FASAY ble gjort i henhold til Flaman
et al.
[14], med noen endringer som tidligere beskrevet [15]. Plasmid pSS16 og gjærstamme YIG397 ble sjenerøst donert av JM Flaman (INSERM U614, Rouen, Frankrike) og J. Cachot (LEMA EA3222, Le Havre, Frankrike), henholdsvis
TP53
. – uttrykker plasmider ble reddet fra isolerte røde kolonier som ble returnert til kultur og lysert med
Zymolyase plakater (MP-Biomedicals). Purelink Hurtig Plasmid Miniprep Kit® (Invitrogen) ble brukt til å redde plasmider. Før sekvensering,
TP53
cDNA ble gjen forsterket med primere P5 [5′-TCT-GTC-ACT-TGC-ACG-TAC-TCC-3 «] og P6 [5»-AGA-GGA-GCT -GGT-GTT-GTT-GG-3 «], designet for å dekke ekson 4-9 i henhold til sekvensen beskrevet i GenBank (NM_000546). To sett med primere ble valgt til å sekvensere de rekombinasjonsseter på hver side av
TP53
cDNA: 5 «region primere PA [5»-CAG-TCA-GAT-CCT-AGC-GTC-GAG-3 «] og PB [5′-CTC-CGT-CAT-GTG-CTG-TGA-CT-3»]; 3 «region primere PC [5′-AAG-GAA-ATT-TGC-GTG-TGG-AG-3′] og PD [5»-CAG-GCC-CTT-CTG-TCT-TGAAC-3 «].
Sequence analyseverktøy
Thierry Soussi database (https://p53.free.fr/) ble brukt en referanse for
TP53
villtypesekvensen og IARC database R14 frigjøring (https://www-p53.iarc.fr/) ble brukt for å sammenligne forskjellige
TP53
mutasjonsmønstre [2]. BLAST verktøy fra NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ble benyttet for analyse av sekvens likheter.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av SAS programvare frigjøre 9,2. En chi square test med en frihetsgrad ble anvendt for å evaluere korrespondansen mellom de observerte og teoretiske frekvenser av mutasjoner ut av basesubstitusjoner i exonene 4 til 9. Sammenligninger mellom de substitusjoner mønstre som knytter seg til genotoxins ble gjort ved hjelp av en Fisher eksakte test . Alle testene var tosidig med et signifikansnivå på 0,05.
Resultater
Cytotoksisitetsdata studier på AG1521 fibroblaster
Cellevekst etter 2 timer eksponering av AG1521 humane fibroblaster til B
[a]
P ved forskjellige konsentrasjoner viste en moderat cytotoksisitet av B
[a]
P i disse betingelser, ble IC50 beregnet til å være over 200 pM (figur 1). Vi valgte deretter eksponerings konsentrasjoner i området fra 1 uM tilsvarende den høyere konsentrasjon uten noen vekst-inhibering til 50 uM svarende til en veksthem 25%. Dermed ble mobilnettet skader minimeres og gjenopptakelse av kultur var lettere etter eksponering. Utvalget av konsentrasjoner av acetaldehyd og AFB
en brukt tidligere beskrevet og diskutert [15], [16]. Acetaldehyd ble brukt på 0,1 til 7,5 mm og AFB
1 på 16-800 nM.
Cytotoksisitet av B
[a]
P menneskelige fibroblastsAG1521 etter to timers eksponering og 3 dager utvinning (4 brønner per konsentrasjon, middel og standardavvik).
Post merking av B
[a]
p indusert DNA addukter
Figur 2A viser mønsteret av DNA voluminøse addukter etter 2 timers eksponering i B
[a]
P 1, 10 og 50 uM i nærvær av eksogen metabolisering fraksjon (S9mix). Positiv kontroll ble oppnådd fra nakent kalvethymus-DNA utsatt for 35 nM BPDE, den aktive metabolitten (figur 2B). En stor flekk migrerer på lignende måte på de tynnsjiktskromatografi platene var synlig i de fire prøvene. Etter B
[a]
P eksponering, ble en andre, men veldig svak flekk også observert for de 2 høyeste konsentrasjonene. Den RAL i DNA fra B
[en] Hotell P-eksponerte celler etter eksogene metabolization var betydelig over kvantifiseringsgrensen på 1,75 × 10
-8. Denne verdien ble bestemt etter en intern prosess med validerings (upubliserte data). Dette demonstrerer effektiviteten til metabolizing prosedyre. Imidlertid er et platå effekt oppnås ved 10 uM.
(A) AG1521 celler etter 2 timers eksponering i B
[a]
P. (B) kalvethymus-DNA etter eksponering for 35 nM B (a) P-7,8-Dihydrodiol-9,10-epoksyd (BPDE kontroll). RAL verdier er gjennomsnittet av to uavhengige analyser.
mutasjon priser i FASAY
Tabell 1 viser de samlede resultatene for B
[a]
P. Hver konsentrasjon ble testet i triplikat. Som reproduserbarhet blant triplicates var svært høy, er det totale antall kolonier for hver konsentrasjon vist.
Blant de røde kolonier som følge av ubehandlede kontrollceller, bare noen få bjørn mutasjoner i den sentrale delen av
TP53
, dvs. eksoner 4 til 9. de andre røde kolonier ble betraktet som gjenstander som de bar ufordøyd pSS16 plasmid eller mutasjoner som ligger i de rekombinasjonsseter. Blant de 3 røde kolonier fra kontrollceller som bærer en mutasjon i den sentrale delen av
TP53
, 2 viste en AGT innsetting i exon 7/8 som er egnet til en skjøte defekt i stedet for en sann mutasjons hendelse, slik som beskrevet tidligere [15]. Det er bemerkelsesverdig at frekvensen av denne spleising feilen var sammenlignbar i forsøkene på de tre genotoxins diskutert her. Bare en sann mutasjon ble funnet i kontrollcellene, slik at beregningen av en spontan mutasjon sats på 0,05%. Denne prisen var rundt 9 til 18 ganger lavere enn de mutasjon priser kalkulert i utsatte celler. Denne singelen spontan mutasjon, var en G En overgang innenfor et CpG sekvens i kodon 267 (CGG TGG). Denne typen mutasjon er klassisk tilskrives spontan deaminering av 5-metylcytosin, selv om vi ikke kan utelukke muligheten for en feil som følge av DNA polymerase under RT-PCR trinnet.
mutasjon priser på utsatte cellene ble omfattet mellom 0,45 til 0,92%. Som observert med post-merking data, er et platå nås på 10 mikrometer.
Identifikasjon av
TP53
mutasjoner i B
[a]
P utsatt AG1521 humane fibroblaster
Tabell 2 viser de 37 sanne mutasjoner funnet i B
[en] Hotell p-eksponerte celler. Fem mutasjoner var en- eller mer-base innsett /slettinger, som fører til en rammeskifte. De resterende mutasjoner var single nucleotide erstatninger inkludert en tull og 25 missense mutasjoner. Det mutasjonsmønster er vist i figur 3C: G t transversions var den mest utbredte (8/37, 21,6%). De blir fulgt av G A, G A på CpG og A G overganger (7/37, 18,9% for hver og en av dem), slettinger (4/37, 10,8%), G C transversions (2/37 , 5,4%), A T transversions (1/37, 2,7%) og en base innsetting (1/37, 2,7%). Denne mutasjonsmønster deretter diskuteres sammenlignet med den tidligere oppnådd etter AG1521 fibroblaster eksponering til acetaldehyd (figur 3A) og aflatoksin B
1 (AFB
1, figur 3B) [15], [16].
(A)
In vitro
Acetaldehyd eksponerte humane fibroblaster AG1521 (FASAY) (n = 35 mutasjoner, data fra [15]), (B)
In vitro
AFB
1-eksponerte humane fibroblaster AG1521 (FASAY) (n = 37 mutasjoner, data fra [16]), (C)
In vitro fra B
[en] Hotell P-eksponert humane fibroblaster AG1521 (FASAY) (n = 37 mutasjoner).
lokalisering av mutasjoner blant
TP53
eksoner 4 til 9
Figur 4 viser lokalisering av mutasjoner fra B
[a]
P (denne undersøkelsen), AFB
1 og acetaldehyd [15], [16]. B
[a]
P mønsteret viser to hot-spots, kodon 248 og 127, mens AFB
en hot-spots er kodon 179 og 220 og acetaldehyd seg kodon 248, 245 og 283.
mutasjonsmønster sett i AG1521 fibroblaster etter B
[a]
P (oransje søyler, n = 32 mutasjoner); AFB
1 (rosa barer, n = 29 mutasjoner); og acetaldehyd (blå søyler, n = 32 mutasjoner) eksponering. Kodoner skrevet i kursiv er store hot-spots i humane svulster i henhold til IARC database.
For å kunne vurdere om mønsteret av B
[en] Hotell P mutasjoner kan være et spørsmål av sjanse, analyserte vi dataene som beskrevet av Shen
et al.
[21]. For denne analyse av hot-spots, bare basesubstitusjoner som forekommer i eksoner 5 til 9 ble tatt hensyn til. Hot-spots ble definert som de 24 mutasjoner som står for 50% av mutasjonene som er rapportert i lungekreft i R14 IARC database. Etter synkende frekvens, disse er kodoner: 273, 248, 249, 245, 158, 157, 175, 179, 282, 220, 242, 163, 176, 154, 280, 266, 298, 237, 193, 281, 159, 135, 234 og 244. Dersom disse 24 hot-spots ble antatt å være tilfeldig muterte, da de ville forutsies å bli truffet 24/205 (totalt antall kodoner i exon 5 til 9), det vil si ved en frekvens på 11,7 %. Ut fra de 30 basesubstitusjoner i exon 5 til 9 i vår undersøkelse, 11 (36,7%) tilsvarer en av de ovennevnte hotspots identifisert for lungekreft, en hastighet som er vesentlig høyere enn forutsagt for tilfeldige hendelser (11,7%, p = 2,10
-5). Den samme analysen ble utført ved hjelp av enten bare hot-spots som finnes i lungekreft fra røykere, eller en annen definisjon av hot-spots, dvs. mutasjonsfrekvens bedre enn 2% av alle mutasjoner som foreslått av Olivier
et al.
[ ,,,0],22]. Disse analysene var meget signifikant hva parameterne anvendt (data ikke vist).
Disse observasjonene sammen med sammenligning av mutasjons områder med lungekreft hot-spots, som vist ovenfor, sterkt taler mot en tilfeldig fordeling av mutasjoner i vår analyse
Diskusjoner
Vi vil ta to viktige saker:. først, er eksperimentelt generert mutasjon profiler representative for de som forekommer naturlig i en gitt genotoxin? For det andre, basert på en samling av eksperimentelle og epidemiologiske data om mutasjoner assosiert med humane tumorer, kan kjemisk-indusert mutasjoner av
TP53
på bestemte steder (kodon) bli identifisert som en viktig hendelse i kreftutvikling?
Forholdet mellom B
[a]
P arvestoffskadelige og
TP53
mutasjoner
Mange gentoksiske metabolitter produsert fra B
[a]
P. Den viktigste måten, som innebærer CYP1A, CYP1B, CYP3A og epoksyd hydrolaser, fører til den ultimate gentoksisk metabolitt (±) -Anti-BPDE som binder seg til DNA og skjemaer overveiende DNA-addukter på
N2
stilling guanin og i mindre grad på
N6
stillingen av adenin [23] – [25]. En annen vei innebærer dihydrodiol dehydrogenases AKR1A1 og 1C1-4 som oksidere B
[en] Hotell P dihydrodiols å katekoler [26]. Katekoler kan deretter gjennomgå mono-elektronisk oxidizations fører til
o
-quinones som danner DNA-addukter, som for eksempel B
[a]
P-7,8-dione-
N
2
-dG og B
[a]
P-7,8-dione-
N
6
-Da [27], [28]. I denne studien under eksponeringen av AG1521 fibroblaster i B
[a]
P, enzymer ble tilført eksogent, i henhold til standard praksis i tester ved testing. Den post-merking analyse avdekket en stor flekk som co-migrerte med det man ser i kontroll DNA utsatt for BPDE. Dette tyder på det sterkeste at B
[a]
P eksponering resulterer hovedsakelig i BPDE-DNA-addukter.
Etter avtale med dataene i litteraturen, fant vi at de fleste av base erstatninger indusert av B
[a]
P ble plassert på G: C basepar hvorav bare seks innenfor CpG regioner. Guanines i denaturert CpG sekvenser er typiske mål for DNA-addukter [10], [23]. Det er sannsynlig at DNA-metylering er dårlig i en cellulær modell slik som den anvendes her, men Shen
et al.
, Ved å bruke den samme reporteren gjærstamme transformert med kjemisk modifiserte plasmider, observert at DNA-metylering ikke påvirker generering av BPDE addukter [21].
Ved hjelp av UvrABC endonuklease i kombinasjon med ligerings-mediert PCR (LMPCR), fordelingen av BPDE addukter på eksoner 5, 7 og 8 av
TP53
i HeLa-cellene er blitt kartlagt [29], [30]. Sterk adduktdannelse skjedde på guanines i kodon 154, 156, 157, 158, 159, 245, 248 og 273, de fleste som er beskrevet som hot-spots i lungekrefttilfellene (157, 158, 245, 248 og 273; IARC database, versjon R14). Faktisk kodon 248 ble hyppigst angrepet av B
[a]
P i vår analyse. For det andre, ved hjelp av metylert og BPDE utsatte DNA-fragmenter som inneholder ekson 5 av
TP53
, addukter ble funnet på tre andre kodon: 152, 175, 181, som alle ble avdekket i denne studien også [10] .
B
[a]
p indusert mutasjonsmønstre har blitt grundig studert i mange gener i ulike biologiske systemer. Analyser utført i gnagerceller
in vitro
eller
in vivo
på reporter gener som
HPRT
eller
Laci
har konsekvent rapportert overvekt av G T transversions og i noe mindre grad, av G A overganger og slettinger [31] – [34]. Satsen for G T transversions synes å være konsentrasjonsavhengig [31]. Interessant, ved anvendelse av en gjær-analyse med forskjellige stammer som mangler nukleotid-excision reparasjon, ble det vist at DNA-polymeraser η og ζ var nødvendig i kombinasjon for translesion reparasjon på tvers BPDE addukter, noe som fører til G t transversions [35]. Pol ζ alene var også i stand til å generere store slettinger i denne analysen.
Avhengig av eksperimentell tilnærming, har avvik er observert mellom mutasjonsmønstre i
TP53
indusert av
in vitro
og
in vivo
eksponering for B
[a]
P eller BPDE. Ved bruk av samme gjær analysen som oss, men etter en direkte BPDE eksponering av en metylert plasmid som bærer den menneskelige
TP53
sekvens, Yoon
m.fl.
har funnet en klar overvekt av G . T transversions mens Shen
m.fl.
har funnet hovedsakelig G . Noen overganger [11], [21]. Den direkte sekvensering av
TP53
i menneske-p53 knock-in (Hupki) murine embryonale fibroblaster etter
in vitro
eksponering for B
[a]
P har vist hovedsakelig G T transversions [36], [37]. Tilsvarende G T mutasjoner ble også funnet hovedsakelig i hud svulster etter B
[a]
P eksponering [38]. Sekvensering av
TP53
fra ulike tumorer indusert etter
in vivo
eksponering av mus til B
[a]
P eller steinkulltjære førte til samme grad av G T G A og G C mutasjoner [39]. I det hele tatt, er det klart fra det store flertallet av studier, at uavhengig av genet som studeres og det biologiske system som brukes, G T transversjon er kjennetegnet av B
[a]
P eller BPDE eksponering. I denne forbindelse, var vi overrasket over å finne disse transversions utgjør bare 22% av mutasjoner i vår studie, men stiger fra 17% ved 1 mikrometer til 27% på 50 mikrometer. Som foreslått av Wei
et al.
[31], det kan være et spørsmål om dose. Mange
in vitro
studier har brukt BPDE i mikrometer området [11], [35] mens vi brukte B
[a]
P i det samme området, som åpenbart ført til en lavere eksponering å BPDE i vår protokoll. Noen
in vitro
studier brukt B
[a]
P i mikrometer rekkevidde, men i disse studiene eksponeringstiden varierte fra 4 til 9 dager i stedet for de 2 timene i vår protokoll [ ,,,0],36], [37]. Dette tyder på at G T transversions kan være kjennetegnet av en sterk eksponering for B
[a]
P, et scenario som synes plausibelt i sammenheng med passiv røyking i storrøykere, mens moderat eksponering kan føre både G T, G A, G C og slettinger, som finnes i mange studier. Denne hypotese støttes av forekomsten av G t transversions i lunge kreft i forhold til tobakk eksponering. Ifølge IARC database (figur 5), varierer dette utbredelsen fra 25% hos ikke-røykere og 32% hos røykere og 55% hos storrøykere
Fra venstre til høyre:.
in vitro
B
[en] Hotell P-eksponert humane fibroblaster AG1521 (FASAY) (n = 37); menneskelige lungekreft, ikke-røykere (n = 288); menneskelige lunge kreft, røykere (n = 870); menneskelige lungekreft, storrøykere (n = 20). Lungekreft data fra IARC database R14. Sjeldne mutasjoner ble utelatt i disse mønstrene
Motsatt til frekvensen av G . T transversjon, fant vi en høy grad av G A overganger (38%), hvorav halvparten er plassert i CpG sekvenser . Dette kan delvis forklares med spontane mutasjoner som sett i kontrollceller. Men en teknisk skjevhet kan betraktes siden vår protokoll ikke skille mellom to uavhengig oppstår men identiske mutasjon hendelser og ett av følgende situasjon: (i) flere mRNA transkripter fra samme muterte cellen som senere blir uavhengig fanget i plasmider eller (ii) klonal ekspansjon av en mutert celle før høsting av bassenget av behandlede celler. I tabell 2 kun tre mutasjoner kan være potensielt relevant for en slik skjevhet, noe som tyder på at gjenstands duplisering av mutasjoner kan være sjeldne. I tillegg duplisert mutasjoner er for det meste G A overganger i CpG nettsteder. Dette kan feilaktig øke frekvensen av denne mutasjonen.
Sammenligning av
TP53
mutasjonsprofiler innhentet for genotoxins, B
[a]
P, acetaldehyd og AFB
1
Resultatene oppnådd ved bruk av FASAY å evaluere mutagene effekter av
in vitro
eksponering av normale humane fibroblaster til B
[a]
P, acetaldehyd og AFB
1 ble sammenlignet. Fishers eksakte test avslørte at når det gjelder den type mutasjon, B
[a]
P og AFB
1 mønstrene var ikke signifikant forskjellig (p = 0,6735), mens forskjellene mellom de mønstre for acetaldehyd og enten B
[a]
P eller AFB
1 var statistisk av borderline betydning (p-verdiene av 0,0546 og 0,0705, henholdsvis). Disse tre forbindelser er kjent for å forårsake ulike typer av DNA-skade som kan i sin tur relateres til spesifikke mutasjoner. Acetaldehyd-induserte mønster er hovedsakelig kjennetegnet ved en meget høy andel av G A overganger (66%), for det meste ligger innenfor CpG-sekvenser som er en sannsynlig grunnlag for dannelsen av interstrand tverrbindings addukter i CpG sekvenser [15]. I kontrast til den høye frekvensen av G T transversions observert blant B
[a]
P- og AFB
1-indusert mutasjoner, har blitt anerkjent som et kjennetegn på deres mutagenitet,
in vitro Hotell og
in vivo product: [4], [40]. Dette er for det meste skyldes tilstedeværelsen av voluminøse addukter
B
[a]
P mønster avslører to unike egenskaper i forhold til de av AFB
1 og acetaldehyd. Forekomsten av G C overganger og en høyere rate av slettinger (11% vs 5-6%). Mens AFB
1 og acetaldehyd indusert enkelt-base slettinger, kunne B
[a]
P generere slettinger opp til 24 nukleotider. Denne funksjonen kan være et resultat av en bestemt translesion syntese sti B
[en] Hotell P-addukter som omtalt ovenfor.
Dermed vil en foreløpig analyse ved hjelp av FASAY gjort oss i stand til å ta opp og skille forskjellige eksperimentelt generert mutasjon mønstre i
TP53
, som så ble brukt til å sammenligne med eksisterende epidemiologiske data på kart DNA-addukter og kreft mutasjoner i
TP53
.
Forekomst av eksperimentell
TP53
mutanter i humane svulster og funksjonelle effekten av mutasjoner
Den samlede fordelingen av muterte kodoner som oppnås etter eksponering for hver av de tre genotoxins diskutert her mulig for oss å identifisere 6 store hot-spots i menneskelig svulster, kodoner 248, 273, 175, 245, 282, 249 (figur 4).
på den fenotypiske nivå blant de 63 mutantene som følge av en substitusjon nukleotid, de to mest hyppig gjenfinnes i humane tumorer ble også finnes i våre eksperimentelle mønstre, dvs. Arg175His og Arg248Gln (tabell 3). Videre fire erstatninger (Arg175His, Arg248Gln, Arg273Cys og Gly245Ser) representerer sammen mer enn 10% av mutanter som finnes i humane tumorer. Bare tre mutanter funnet i vår studie har aldri blitt beskrevet i humane tumorer (Gly117Val, Gly262Leu, Asn288Ile). Dette tyder på det sterkeste at FASAY gjen mutanter som bærer en funksjonell endring slik at utvalget i løpet av kreftprosessen.
Vi har evaluert den funksjonelle konsekvensen av mutasjoner oppstår etter
in vitro
mot tre kjemikalier i lys av data fra Dearth
et al.
som evaluerte effekten av 76
TP53
mutanter hyppig observert i humane tumorer [12]. Fjorten av de 76 analyserte mutanter ble hentet i våre tre eksperimentelle mønstre (Tabell 3). Som forventet, disse 14 mutanter var blottet for aktivitet på
RGC
sekvenser som ble brukt i vår FASAY protokollen. Denne analysen viser at de fleste av de eksperimentelle mutasjoner havnen større funksjonssvikt, dvs. fullstendig tap av transkripsjonen aktivitet på 22 p53 DNA-bindende Sekvenser (DBS) og Dominant negativ effekt (DNE). Omvendt, noen av mutasjonene som er hyppig i humane svulster er lite sannsynlig å bli hentet av FASAY fordi de beholder transkripsjonen aktivitet [12]. Dette inkluderer for eksempel Arg175Leu eller Glu285Lys som ikke ble funnet i vår analyse.
Men den funksjonelle analysen av mutanter av FASAY ikke gjøre oss i stand til å skille mellom ulike typer kreft. Faktisk, hvis FASAY tillate oss å hente mutanter oppstår ofte i humane tumorer, disse mutanter var verken spesielt hyppig eller sjelden i tumorer relatert til eksponering for et bestemt genotoxin. For eksempel, Arg175His og Arg248Gln funnet i B
[a]
P og AFB
1 mønstre er de hyppigst identifisert mutanter i humane tumorer, sto for 4,25% og 3,21% av alle mutanter (Tabell 3), men de utgjør bare 1,2% av lungekrefttilfellene eller hepatokarsinom mutanter ifølge IARC database. På samme måte, Arg273Cys avbildet i acetaldehyd mønsteret er mer vanlig i hele humane tumorspektrum (2,44%) enn i den for spiserørskreft (1,3%).
Denne Analysen angir muligheten av kjemikalier til å indusere hyppige og svært svekket
TP53
mutanter som kan være en viktig begivenhet som er involvert i kreftutvikling. Sammenlignet med klassiske mutagenesetester bruker reporter gener, gir dette funksjonelle
in vitro
tilnærming sterke argumenter for en biologisk plausibilitet av kreftfremkallende for en genotoxin. Likevel det rekapitulerer bare den innledende trinn i kreftutvikling og dermed er unøyaktig i forutsi hvilken mutasjon kan være en pådriver i løpet av de påfølgende trinnene i kreftutvikling i et gitt vev.
