Abstract
Bakgrunn
Identifisering og karakterisering av kreft stamceller (cscs) er avgjørende for å forstå mekanismen av kreft patogenesen. Økende bevis tyder på at cscs spiller avgjørende roller i utvikling og progresjon av kreft. Det finnes imidlertid uenighet om hvorvidt cscs oppstå fra benmarg-avledede celler (BMDCs).
Metodikk og hovedfunnene
I denne studien, n-nitrosodiethylamine (DEN) ble brukt til å indusere svulstdannelse i hunnmus som fikk benmarg fra hannmus. Svulstdannelse ble indusert i 20/26 mus, inkludert 12 leversvulster, 6 lungesvulster, en blære svulst og en nasofaryngeal svulst. Gjennom sammenligning av fluorescens
in situ
hybridisering (FISH) resulterer i tilsvarende områder fra serietumorsnitt farget med H E, fant vi ut at BMDCs ble rekruttert til både svulstvev og normalt omkringliggende vev til en svært lav frekvens ( 0,2-1% i tumorer og 0 til 0,3% i normalt vev). Imidlertid omtrent 3-70% av celler i vev som omgir tumoren var BMDCs, og prosentandelen av BMDCs var sterkt assosiert med inflammatorisk status av vevet. I denne studien ble ingen bevis funnet å støtte eksistensen av fusjonsceller dannet skjema BMDCs og vevsspesifikke stamceller.
Konklusjoner
I sammendraget, våre data tyder på at selv om BMDCs kan bidra til tumorprogresjon, de er i motsetning til å bidra til startfasen
Citation. Lin H, Hu L, Chen L, Yu H, Wang Q, Chen P, et al. (2012) Kjemisk-indusert kreft ikke stammer fra benmarg-avledede celler. PLoS ONE 7 (1): e30493. doi: 10,1371 /journal.pone.0030493
Redaktør: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de kreft, Brasil
mottatt: 16 november 2011; Godkjent: 16 desember 2011; Publisert: 24 januar 2012
Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation Zhejiang Provincial of China (Y2100464) og National Key Sci-Tech spesielt prosjekt av smittsomme sykdommer (2012ZX10002-013). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en økende mengde litteratur antyder at svulster stammer fra en liten del av celler, referert til som kreft stamceller (cscs) eller tumor initiere celler (tics) fordi disse cellene bære stamcellelignende egenskaper som selv -renewal og differensiering [1]. Hittil har cscs blitt vist å eksistere i kreft i hematopoetiske system [2], bryst [3], hjerne [4], prostata [5], gastrisk [6], lunge [7], tykktarm [8] og leveren [9]. Men lite er kjent om opprinnelsen til cscs. En mulig opprinnelse cscs er benmargen, som benmarg-avledede celler (BMDCs) finnes ofte i tumorvev og BMDCs har evnen til å differensiere til mange forskjellige typer celler, inkludert mesenchymale celler, muskelceller og epitelceller, inkludert levercellene . Nylig har vår kunnskap om forholdet mellom BMDCs og kreft progresjon dramatisk forbedret. Et interessant aspekt er at kreftcellene aktivt rekruttere BMDCs til sitt eget mikromiljøet. BMDCs i svulster er ikke bare ansvarlig for betennelse, men også for tumor angiogenese [10]. CD45-positive BMDCs finnes ofte i tumorvevet, hvor de uttrykker vaskulær endotelial cellevekstfaktor-reseptor-1 (VEGFR-1) [11], et nøkkel-reseptor av VEGF. I tillegg til betennelse, disse CD45 + /VEGFR1 + celler også bidra til tumor angiogenese. Dermed bevis viser at BMDCs gi en passende mikromiljøet til rette for kreft metastase [12].
Det er imidlertid uklart om kreftceller stammer fra BMDCs, og denne hypotesen er hyppig debattert. En fersk rapport fant at etter kronisk
Helicobacter
infeksjon, BMDCs akkumulert i mageslimhinnen og til slutt ga opphav til magekreft [6]. Videre er ytterligere studier antydet at onkogene mutasjoner av vev stamceller eller flere differensierte celler kan opprette en pool av selvpolerende celler i hvilke disse mutasjoner akkumulert og til slutt resulterte i kreft [4], [5]. I benmargstransplantasjon modeller, ble det vist at BMDCs var usannsynlig å være opprinnelsen til leverkreft [13] og hudkreft [14]. For å teste om kreft stammer fra BMDCs, ble kjemisk karsinogen n-nitrosodiethylamine (DEN) som benyttes for å indusere svulstutvikling i mus etter benmargtransplantasjon. Benmargen kvinnelige mottaker mus ble utryddet ved bestråling og deretter rekonstruert med benmarg fra normale hannmus. Y-kromosomet ble anvendt som markør for å karakterisere opprinnelsen til de induserte tumorceller. Tjue svulster, inkludert 12 leversvulster, 6 lungesvulster, en blære svulst og en nasofaryngeal tumor, ble vellykket indusert. Blant disse tumorer, ble klonal ekspansjon av Y-positive (Y +) celler ikke observert. Antallet Y + celler i tumorer korrelert med antallet av infiltrerende lymfocytter. Vi fant også at de fleste Y + celler uttrykte både CD45 og VEGFR-en. Våre data antydet at, i det minste i vår dyremodell, BMDCs ikke er opphavet til kreft stamceller, selv om de er knyttet til tumor inflammasjon, og kan bidra til dannelsen av tumor ny-fartøyene.
Resultater
Påvisning av Mouse X- og Y-kromosomene i fisk
for benmargstransplantasjon (BMT), benmargceller hentet fra seks giver hannmus ble transplantert inn i 60 mottaker hunnmus. Som vist i figur 1, fiske sonder hybridisert til både metafase og interfase-kromosomer og ga sterke og spesifikke signaler. FISH-signaler av Y-kromosomet ble bare påvist i celler fra donor hannmus benmarg (figur 1B).
(A) En metafase perifert blod lymfocytter fra en kvinnelig mottaker mus. (B) En metafase perifert blod lymfocytter fra en mannlig donor mus. (C) Perifere blodlymfocytter fra en kvinnelig mottaker mus etter BMT. En kvinnelig lymfocytt er angitt med en pil. (D) benmargceller fra en kvinnelig mottaker mus etter BMT. En kvinnelig benmargscelle er angitt med en pil. Forstørrelse x 100 (A og B) eller x 40 (C og D). Skala barer, 20 mikrometer.
benmargstransplantasjon
Alle mottaker mus overlevde BMT. Den samlede engraftment var 82,5 til 94,5% som vurdert ved å beregne prosentandelen av Y-positive celler blant både perifere lymfocytter (figur 1C) og benmargceller (figur 1D). Totalt 500 celler ble analysert i hver prøve. Dette resultatet indikerer at BMT prosedyrer var vellykket.
DEN-Induced Karsinogenese
I løpet av de 30 ukene av kjemisk indusert kreftutvikling, 34 BMT mus døde. Komp obduksjoner ble utført på hver av disse mus, med den primære årsaken til død å være omfattende lungebetennelse og leversvikt. Svulster ble indusert i 20 av de 26 overlevende mus; disse svulstene inkluderte 12 leversvulster, 6 lungesvulster, en blære svulsten og en nasofaryngeal svulst. Representative bilder av lunge- og leversvulster er vist i figur 2A og 2B, henholdsvis. Disse svulstene ble resected, i parafin, seksjonert og histologisk karakterisert ved hjelp av H E. Av de 6 induserte lungekrefttilfellene, fire ble karakterisert som plateepitelkarsinom, og de resterende to ble karakterisert som adenokarsinom (figur 2C). Alle 12 leversvulster ble karakterisert som leverkreft (figur 2D). Både blære (figur 2E) og nasofaryngeale kreft (figur 2F) ble karakterisert som plateepitelkarsinom.
(A) Brutto patologi av en representant lungekreft. (B) Brutto patologi av en representant leverkreft. Representant H E flekker seksjoner for adenokarsinom i lungene (C), leverkreft (D), plateepitelkarsinom blæren (E), og nasofaryngeal kreft (F). Forstørrelse, × 20 (C, D, E og F). Skala barer, 50 mikrometer.
Distribusjon av BMDCs i DEN-indusert Svulster
For å undersøke om den-indusert kreft stammer fra benmarg, brukte vi FISH å bestemme hvor stor prosentandel av Y -positive (Y +) celler. I hvert tilfelle ble 500-5000 celler tellet for å beregne prosentandelen av Y + celler i tumorprøver. I alle DEN-induserte tumorer, hyppigheten av Y + cellen var 0,2 til 0,6% i leveren kreft (figur 3B og 3C), 0 til 0,3% i lungekreft (figur 4), 0,6% i blærekreft (Figur 5 ) og 1% i nasofaryngeal kreft (figur 6). Interessant, frekvenser av Y + -celler var ekstremt høy i vev som omgir tumoren, hvor en stor prosentandel av infiltrerende inflammatoriske celler og fibroblaster bodde. Hyppigheten av Y + celler i vevet som omgir tumoren var 30-50% i leversvulster (figur 3B, 3C), 3-8% i lungesvulster (figur 4), 40% i blæren tumor (figur 5) og 70% i nasofaryngeal tumor (figur 6). Men en betydelig hyppighet av Y + celler ble ikke observert i de normale vev tilstøtende til leveren, lungene og blæretumorer. Disse data tyder på at mobilnettet opprinnelsen til kreft er ikke benmargen
(A) En representant H . E farging bilde demonstrere histopatologiske funksjonene i HCC vev og omkringliggende vev. (B) Et representativt FISH bilde av det samme område fra en tilstøtende serie seksjon konstruert ved fusjon av flere bilder. (C) Forstørrelse av områder fra vevet som omgir tumoren (a) og tumorvevet (b) i (B). T, svulstvev. Forstørrelse, × 20 (A B). Skala barer, 20 mikrometer
(A) H . E farging bilde presentere histopatologiske trekk ved lungekreft og omkringliggende normalt vev. Forstørrelse, × 20. (B) H NT, ikke-tumorvev. Forstørrelse, × 40. Skala barer, 20 mikrometer
(A) H . E farging bilde presentere histopatologiske funksjonene i NPC og omkringliggende vev. Forstørrelse, × 20. (B . E farging bilde presentere histopatologiske funksjonene i blærekreft og omkringliggende vev. Forstørrelse, × 20. (B) FISH bilder av forstørrede områder i (A). T, svulstvev; NT, ikke-tumorvev. Forstørrelse, × 40.
For å vurdere om BMDCs kan smelte sammen med kreftceller, analyserte vi antall X- og Y-signaler i BMDCs i svulstene og deres omkringliggende vev. Ingen fusjon-avledet karyotype (XXY, xxxy) celler ble funnet i vår studie. Dette resultatet er i tråd med mange andre funn [6], [11], [15], [16] og antyder at cellefusjon er ikke det viktigste bidraget fra BMDCs til ondartet patogenesen.
Diskusjoner
Selv om kreft stamcelle hypotese forblir diskutert mange forskere tror at cancere inneholder et lite antall av kreft stamceller (cscs). Disse cscs er i stand til å fornye seg selv, differensiere, og motstå kjemoterapi og dermed opprettholde kreft vekst. Til dags dato, opprinnelsen til cscs er fortsatt et mysterium. Minst tre mulige opprinnelse cscs har blitt foreslått, blant annet 1) vevsspesifikke stamceller [17]; 2) BMDCs [6], [15]; og 3) fusjons celler avledet fra BMDCs og vev-spesifikk progenitor eller stamceller [18] – [20]. I denne studien har vi benyttet en benmargstransplantasjon dyremodell for å undersøke opprinnelsen til cscs i kjemisk indusert (DEN) svulster. DEN er et karsinogen som kan indusere svulster i forskjellige organer, inkludert lever og hud, og i den gastrointestinale, respiratoriske og hematopoietiske system hos mus. Når metabolisert, DEN i omgjort til et elektro ethyldiazonium ion som kan reagere med DNA-baser og danne addukter og dermed kan forårsake DNA mutasjoner og trådbrudd som til slutt bidrar til patogenesen [21]. I vår modell ble det benyttet en høy dose av DEN (60 ppm) i drikkevannet i 12 uker for å øke frekvensen og forkorte perioden for tumordannelse. Ved hjelp av denne strategien ble svulster med hell indusert i lever, lunge, blære og nasopharynx.
BMDCs har evnen til å differensiere til epitelceller i løpet av vevsreparasjon i mange organer, inkludert leveren [22], [23] , lunger, hud, øyne, mage-tarmkanalen og nyrene [24]. Men om og hvordan BMDCs står for vev reparasjon er fortsatt debattert. Selv om antallet BMDCs var variabel, de fleste publikasjoner viser at BMDCs ble rekruttert til vevsskader områder [25] – [28], mens en annen publikasjon rapport som BMDCs ikke ble påvist i de modellene som brukes [29], [30]. I murine leveren og bukspyttkjertelen tumormodeller, de mer avanserte svulstene hadde en høyere tendens til å rekruttere BMDCs [31]. I vår modell har vi funnet at prosenter av BMDCs i både tumor og normalt vev var svært lav ( 1%); imidlertid, BMDCs ble funnet i vev som omgir tumoren. Dette området er infilitrated med inflammatoriske celler, noe som tyder på at disse BMDCs var assosiert med inflammasjon. Dette resultatet tyder på at BMDCs hadde mindre sannsynlighet for å bli forvandlet til ondartede celler som ingen av svulster i vår modell inneholdt gruppert Y + celler.
Nyere funn viser at BMDCs kan innlemme i lever og tarm gjennom cellefusjon [18] – [20], som hevet muligheten for at BMDCs kan spille en rolle i regenerering og tumordannelse ved å fusjonere med forløper- eller stamceller fra målorganet. Men mange rapporter hevder at det ikke finnes klare bevis for å vise at cellefusjon oppstår mellom BMDCs og målrette organceller i sine modeller [6], [11], [15], [16]. I denne studien fikk vi bekreftet mangelen på bevis for å demonstrere cellefusjon både i tumorer og i omkringliggende normalt vev av fisk. Spesielt, selv om BMDCs ble funnet innlemmet i tarm adenom i APC-muterte flere tarm neoplasi mus, ingen av adenomer ubiquitously besto av BMDCs [20], som tyder på at mekanismen ved hvilken BMDCs bidrar til patogenesen var ikke sannsynlig å være cellefusjon. Oppsummert våre data viste at selv BMDCs kan bidra til tumorprogresjon, muligheten for at BMDCs er opprinnelsen til selve svulsten er ekstremt lav.
Materialer og metoder
benmargstransplantasjon (BMT )
seks til åtte uker gammel mannlig og kvinnelig C57BL /6J mus ble kjøpt fra Model Animal Research Center of Nanjing University (Nanjing, Kina). De dyreforsøk ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer, og studien ble godkjent av etisk komité av Zhejiang University (Godkjenning ID: SYXK2004-0050). For BMT, ble samlet benmarg isolert fra lårben og tibias av donor hannmus, vasket, triturert ved anvendelse av en 20-gauge nål og ført gjennom en 40-mikrometer nylonmaskecelle sil (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ) for å produsere en enkelt-celle-suspensjon i PBS ved en tetthet på 1,5 x 10
7 celler /ml. Mottakeren female C57BL /6J mus ble bestrålt med 900 rad fra en
60Co irradiator, rekonstituert med 3 × 10
6 donor margceller via halevenen injeksjon eller retro-orbital prøvetaking av bedøvet mus 36 timer senere, og brukes for forsøk 4-5 uker etter utvinning. For å bekrefte vellykket transplantasjon av donor benmargceller, mottaker perifert blod og benmarg-celler ble erholdt 4 uker etter BMT og undersøkt for tilstedeværelse av Y-kromosom med fluorescens
in situ
hybridisering (FISH).
kjemisk induserte Karsinogenese med n-Nitrosodiethylamine (DEN)
Ca 4-5 uker etter BMT, 60 mottaker mus ble matet DEN (60 ppm i drikkevann, Sigma, St. Louis, MO) for 12 uker for to økter med en to-ukers separasjon intervall for å starte prosessen med kreftutvikling. Musene som overlevde ble ofret etter 30 uker.
Histologisk og Patologisk Study
Den induserte svulster ble fjernet og fiksert i 4% formalin over natten. Etter dehydrering ble tumorvevet innstøpt i parafin. Tumorvevet i parafin ble serie seksjonert (5 mikrometer i tykkelse), og velge objektglass ble rutinemessig farget med hematoksylin-eosin (H E). Alle de tumorsnitt ble anmeldt i en blindet måte av to erfarne patologer.
Fluorescence
in situ
Hybridisering
To bakterielle kunstig kromosom (BAC) kloner (RP24-0090J19 og RP24-185C22) inneholdende sry genet til mus Y-kromosomet ble valgt for å identifisere celler som stammer fra hannmus. Bács inneholdende DNA-fragment fra den murine X7A.1 region (RP23-0170B5 og RP23-0011C16) ble anvendt som kontroll prober for den murine X-kromosomet. Parafininnstøpte vevssnitt ved siden av H E-fargede seksjonene ble valgt for FISH deteksjon. Snittene ble deparaffinized, spaltet med protease K og deretter hybridisert med fluoroforen-merkede BAC-prober i henhold til metoden tidligere beskrevet [32]. De FISH resultater ble observert, og fanges opp ved hjelp av et fluorescens mikroskop utstyrt med et avkjølt CCD-kamera. De FISH signaler ble sammenlignet med H . E farging av det samme området i en suksessiv svulst seksjon
Takk
Forfatterne ønsker å takke dr Mei Jin og Dr. Jing-Yao Xu for sin ekspertise i å gjennomgå tumorsnitt.
