Abstract
En allsidig bioreaktor egnet for dynamisk fjæring cellekultur etter tunbare skjærspenningsforholdene har blitt utviklet og foreløpig testet dyrknings kreft celleklumper. Ved å anvende enkle teknologiske løsninger og unngå roterende komponenter, utnytter bioreaktoren de skivehydrodynamikk etablerer i kulturen kammeret muliggjør dynamisk cellesuspensjon i et miljø som er gunstig for massetransport, under et bredt spekter av avstembare skjærspenningsbetingelser. Designfasen av enheten har blitt støttet av Multiphysics modellering og har gitt en omfattende analyse av drifts prinsippene i bioreaktor. Dessuten er en forklarende eksempel her presenteres med Multiphysics simuleringer brukes til å stille de riktige bioreaktor driftsforhold for foreløpig
in vitro
biologiske tester på en human lungekarsinom cellelinje. De biologiske resultater viser at den ultralav skjær dynamisk suspensjon leveres av anordningen er fordelaktig for dyrking cancercelleklumper. I forhold til den statiske suspensjon kontroll, bevarer dynamisk cellesuspensjon morfologiske trekk, fremmer intercellulære forbindelse, øker sfæroide størrelse (2,4-ganger økning) og antall sykkel-celler (1,58-gangers økning), og reduserer dobbeltstrenget DNA-skader (1,5-fold reduksjon). Det er tenkt at allsidigheten til denne bioreaktor kan tillate etterforskning og utvidelse av ulike celletyper i fremtiden
Citation. Massai D, Isu G, Madeddu D, Cerino G, Falco A, Frati C, et al . (2016) En allsidig bioreaktor for Dynamic Suspension Cell Culture. Søknad til kulturen i Cancer Cell Spheroids. PLoS ONE 11 (5): e0154610. doi: 10,1371 /journal.pone.0154610
Redaktør: Maurizio Pesce, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA
mottatt: 23 desember 2015; Godkjent: 15 april 2016; Publisert: 04.05.2016
Copyright: © 2016 Massai et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering: Dette arbeidet mottatt delfinansiering fra (1) Europa FP7 Cooperation – Collaborative Project «bioaktive svært porøs og injiserbare Stillas Control Stem Cell Rekruttering, spredning og differensiering. og Aktivering Angiogenese for Hjerte- Engineered Vev «- BIOSCENT, 2009-2013 (ID 214539), og (2) den italienske nasjonal PRIN 2012 Project» A bioteknologi for optimalisering av 3D Cardiosphere baserte konstruksjoner for Cardiac Regenerative Medicine «- BEAT3DHEART 2014 -2017 (20123E8FH4), samt ekstra midler internt Politecnico di Torino og Università degli Studi di Parma. Bioexpansys Srl gitt økonomisk støtte i form av lønn for forfatteren GFDL og forskningsmateriale, men hadde ingen ytterligere rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og forfatterne av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser: Giuseppe Falvo D’Urso Labate fungerer som administrerende direktør for Bioexpansys Srl, distributøren av den dynamiske kultur-enheten. Ingen av forfatterne har mottatt honorarer eller konsulenthonorar i å skrive dette manuskriptet. Ingen andre potensielle interessekonflikter som er relevant for denne artikkelen ble rapportert. Verken Bioexpansys Srl eller noe annet privat selskap har hatt noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Betingelsene for Dr. Falvo D’Urso Labate eller andre forfatteres arbeid endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data eller materiale.
Innledning
storskalaproduksjon celler er et obligatorisk trinn for å sette opp økonomisk levedyktig in vitro eksperimentelle modeller for grunnforskning, sykdom modellering og narkotika testing, og definitivt oversette tissue engineering og regenerativ medisin strategier til klinisk praksis for terapeutiske anvendelser. Men, skalerbarhet og standardisering i cellulære produksjonsprosesser er fortsatt store utfordringer. Spesielt når et stort antall celler (10
10-10
12) er nødvendig, vanlige to-dimensjonale (2D) kultur strategier, hovedsakelig basert på manuell, ekstremt plass og arbeidskrevende tiltak, er praktisk talt og økonomisk uholdbar [1-5].
i en skalering-up perspektiv og inspirert av produksjonsprosesser av legemiddelselskap i biofarmasøytiske industrien [6,7], tredimensjonal (3D) suspensjon kultur har vist seg å være en fordelaktig alternativ til enkeltlag teknikker for storstilt utvidelse av celler [4,5,8,9]. I detalj, er suspensjonsfremgangsmåter vært i omfattende bruk: (1) for skalerbar og kontrollert ekspansjon av stamceller [10-15] og kreft celler [16-18]; (2) for føring av stamcelledifferensiering [13,19-22]; (3) for fremstilling av cellulære kuler og vev-lignende konstruksjoner [23-25]. Bestemmelsen av en 3D-suspensjon kultur miljø, etterligne mikromiljøet av den cellulære nisje, har vist seg å være gunstig, fremme celle overlevelse og beholde celle funksjonelle egenskaper
in vitro product: [9,26,27]. Dessuten, når suspensjonen er oppnådd ved dynamisk blanding av dyrkingsmediet (1) dannelse av gradienter i, f.eks, temperatur, pH, oppløst oksygen, næringsstoffer /metabolitter hindres, (2) transport av oksygen og næringsstoffer økes, og (3) sedimentering av dyrkede celler /konstruksjoner unngås, og dermed går ut over de iboende begrensningene for statiske dyrkingssystemer [4,7,9,28].
i dag dynamisk suspensjonskultur for skalerbar produksjon og differensiering av celler er stort sett utført av omrørt tank og roterende bioreaktorer [2,4]. Slike anordninger er konstruert for å tilveiebringe en 3D-homogen kultur miljø og for å muliggjøre overvåkning og styring av dyrkingsparametrene, som fører til mer reproduserbare, robuste og kostnadseffektive prosesser [5, 29,30,31]. Men de fleste av disse bioreaktorer fortsatt lider av kritiske spørsmål, noe som begrenser oppskalering og standardisering av ekspansjons bioprocesses. Når det gjelder omrørt tank bioreaktorer, kan resultatene bli påvirket av (1) kollisjoner av cellene med pumpehjulet og (2) begynnende turbulent strømning, som både kan fremkalle ikke-fysiologiske mekanisk og hydrodynamisk-skjærspenninger på cellene og fører til celleskader. Videre kan disse ugunstige forhold påvirker celle vekst og metabolisme, forstyrrer stamcelle pluripotency, og begrenser effektiviteten og reproduserbarheten av dyrkningsprosessen [4,9,28,30,32,33]. Roterende bioreaktorer generere en lav-skjærspenning kultur miljø, slik at for delvis å overvinne begrensninger av omrørte tank-enheter. Men kompleksiteten av de teknologiske løsninger som er valgt for rotasjon gjøre disse enhetene ikke lett skalerbare og uegnet for kontinuerlig medium utskifting og sanntids overvåking [4].
Vi presenterer her en allsidig bioreaktor egnet for fleksibel skjærspenning dynamisk oppheng cellekultur. I detalj, ved å anvende enkle teknologiske løsninger og unngå roterende komponenter, gjør den foreslåtte bioreaktoren cellesuspensjonen ved å sikre en laminær blandestrømningsregime, noe som garanterer oksygen og nærings transport og til slutt homogen kultur miljø under et bredt område av skjærspenningsbetingelser.
for å gå utover den eksperimentelle prøving og feiling tilnærming og å nå en dypere forståelse av fluiddynamikk utviklings inne i kulturen miljøet [34,35], designfasen av enheten har blitt støttet av i silikoaluminofosfater Multiphysics modellering, gir en omfattende analyse av drifts prinsippene i bioreaktor. Videre funn fra Multiphysics simuleringene fungert som kriterier for å stille de riktige bioreaktor driftsforhold for foreløpige
in vitro
tester. Spesielt var dette første studien fokusert på å vurdere hensiktsmessigheten av bioreaktor som ultralav skjærspenning dynamisk fjæring enhet for kreftcelle spheroid kultur. For dette formålet ble den Calu-3 human lunge-carcinom-cellelinje underkastet ultralav skjær dynamisk suspensjon leveres av anordningen. De biologiske resultater tyder på at denne fremgangsmåten bevarer kreftcellevekst
in vitro
, inkludert sfæroide formasjon, og foreslår at egnetheten av den foreslåtte bioreaktor for undersøkelse på celle funksjonelle egenskaper og for utvidelse av forskjellige celletyper.
Materialer og metoder
dynamisk understell bioreaktor
utformingen av enheten (figur 1A) ble drevet av to hovedkrav: (1) for å gi dynamisk fjæring kultur med riktig blanding; (2) for å garantere en avstembar ultralav-til-moderat skjærspenning kultur miljø, kan justeres på grunnlag av kultur krav ved ganske enkelt å modifisere driftsbetingelsene. Disse målene ble nådd å kombinere de spesielle geometriske trekk ved bioreaktoren kulturkammer med en kontinuerlig resirkuleringen av kulturmediet sikres med et lukket resirkuleringskrets, unngå bruk av løpehjul og /eller rotasjonskomponenter. Denne kombinasjonen fremmer etablering av oppdrifts virvlene innenfor kultur kammeret, som opprettholder celler /konstruksjoner i dynamisk fjæring, minimere deres sedimentering.
(A) Skjematisk trekning av bioreaktor som viser sine interne komponenter og dens aksial symmetri (rød linjer). (B) Bilde av bioreaktor. (C) Skjematisk fremstilling av oppsett av bioreaktoren er koblet til den lukkede sløyfe resirkuleringskretsen og plassert inne i inkubatoren.
Bioreaktoren (figur 1B, ytre dimensjoner = 95 mm x 70 mm x 70 mm) består av: en AISI 316L rustfritt stål base; en polykarbonat kultur kammer for boliger de celler /konstruksjoner (kammervolum = 75 ml); en polykarbonat lokk. Krumningen og formen av den indre vegg av kulturen kammeret ble utviklet og optimalisert for generering av oppdrifts virvlene for prøvesuspensjon (som beskrevet i det følgende). Suspenderte celler /konstruksjonene er begrenset inne i kulturen kammeret ved hjelp av nærværet av (1) et AISI 316L rustfritt stål enveis tilbakeslagsventil (som hindrer tilbakestrømning og garanterer en symmetrisk strømning innløp), og (2) en dyrkningsmedium-gjennomtrengelige filter ( Durapore
®, MerckMillipore, Tyskland), som hindrer at utgangene av celler. Bioreaktoren er en del av et lukket sløyfekrets for resirkulasjon av oksygenert kulturmedium (figur 1C). En slik resirkuleringskretsen er sammensatt av et medium reservoar, oksygen-gjennomtrengelige peroksyd-herdet silikonslanger (Masterflex L /S
®, Cole-Parmer, IL, USA) med hurtigkoplinger, og en peristaltisk pumpe (Masterflex L /S
®, Cole-Parmer, IL, USA), for en total arbeidsvolum på omtrent 200 ml. For å garantere tilstrekkelig tilførsel av oksygen i kulturen kammeret, ble resirkuleringskretsen dimensjoneres ved bruk av en analytisk oksygenmassebalansemodell i samsvar med Orr et al. [36].
fungerer prinsipp bioreaktoren er basert på den kontinuerlige resirkuleringen av kulturmediet inne i kammeret kultur i henhold til laminære strømningsregime, oppnådd ved modulering av resirkuleringskretsen strømningshastighet, for å produsere fra ultralav til moderat skjærspenning dynamiske fjæringsforhold. I detalj, strømmer mediet gjennom tilbakeslagsventilen, drevet av den peristaltiske pumpe mot det statiske trykkgradient, og syrer kulturen kammeret. Suksessivt passerer mediet gjennom filteret og strømmer ut fra lokket, beveger seg tilbake til reservoaret i en kontinuerlig lukket prosess. Dannelsen av oppdrifts virvler inne i kulturen kammeret kan den dynamiske suspensjon av de dyrkede celler /konstruksjoner (S1 Film).
beregningsmodeller
En beregnings Multiphysics tilnærming støttes design og optimalisering faser av anordningen, som muliggjør identifikasjon av (1) den optimale geometri av dyrkningskammeret, og (2) driftsforhold for dynamisk suspensjon cellekultur i henhold til definerte skjærspenningsverdier. Et enormt antall simuleringer ble utført for å variere både celle /konstruere dimensjoner (i form av deres diameter) og svært fortynnede celle inokulasjon tettheter, for å undersøke følsomheten for fluidstrømningen til disse kultur parametre innenfor kammervolumet.
Teknisk, drar nytte av aksial symmetri av enheten (figur 1A), et sett med aksesymmetriske tidsavhengige numeriske simuleringer ble utført ved hjelp av en tilpasset endelig volum teknikk-basert kommersiell programvare (flytende, ANSYS Inc., PA, USA). Væsken domenet ble diskretisert hjelp ICEM CFD programvare (ANSYS Inc., PA, USA). En mesh kardinalitet lik 6.5×10
3 firkant celler ble vurdert. Som i tidligere studier [21,37], ble samtidig tilstedeværelse av kulturmedium og celler modellert ved hjelp av Eulersk-Eulersk Fler modell, noe som gjør at blandinger av flere adskilte ennå samspill faser av et kontinuum skal beskrives. For hver fase styrende bevegelseslikningene, Navier-Stokes ligninger ble løst ved den numeriske løser. Dyrkningsmediet, regnet som den primære fase, ble antatt å være Newtonsk med fysikalske egenskaper hos kulturmedier som vanligvis brukes i cellekultur applikasjoner (dynamisk viskositet = 1×10
-3 Pa s, densitet = 1000 kg /m
3) [21]. Suspendert celler, ansett som sekundær nedsenket fasen, ble modellert som ikke-deformerbare sfæriske perler. I det forklarende eksempel rapportert i dette arbeidet, en densitet på 1070 kg /m
3 [38] og en midlere diameter lik 20 pm (det vil si den målte diameter av Calu-3-cancerceller) ble vurdert. Tilstedeværelsen av filteret ble modellert som et porøst medium, karakterisert ved en verdi av Darcy hydraulisk motstand lik 96×10
4 m
-2 til kulturmediet og å definere det maksimale hydrauliske motstand godkjent av løser (1×10
20 m
-2) for cellene, som har filteret en midlere porestørrelse på 5 um, og dermed være ugjennomtrengelig for dem. Celle inokulering ble antatt å være ensartet i det nedre område av kulturen kammeret. Denne antakelsen ble omregnet til beregnings rammeverk foreskrives, som initial tilstand, en ensartet volumfraksjon (VF) som opptas av cellene (den sekundære fase) i det nedre kar-området (10 ml, i det forklarende eksempel ved bruk av Calu-3-cellelinjen) . Simuleringer ble utført alltid vurderer høyt fortynnede suspensjonskulturer (Stokes-tall i stor grad lavere enn 1, VF verdi lavere enn 1%), hvor variasjoner i utgangs VF ikke merkbart påvirker strømningsfeltet av den primære fase. Som en indikasjon grenseverdi for sedimentering, en VF-verdi som er høyere enn 20% ble betraktet som, svarende til omtrent en tredjedel av den maksimale pakke grensen på 63%, dvs. den pakning grensen for ikke-formbare sfæriske kuler regelmessig pakket [21]. Simuleringer ble strakte seg over strømningsrater i området 5-120 ml /min, med en simulert kultur tid som er lik 60 minutter, noe som ble ansett tilstrekkelig til fullt ut å beskrive dynamikken i mediet inne i kammeret kulturen. Den fase-koblede enkel løsning ble anvendt for den trykk hastighet kopling. The Second Order Motvinds og QUICK formuleringen ble brukt for den romlige diskretisering av momentum og sekundærfasetransport, henholdsvis. Detaljer i forbindelse med modell likninger og grensebetingelser er gitt i S1 Text.
Videre, for å undersøke innflytelsen av den dynamiske blande etablere i kulturen kammer på utviklingen av fysiske og miljømessige mengder, transport av en skalar størrelse i kulturen kammeret ble modellert. I detalj ble transport av oksygen oppløst i mediet som strømmer på innsiden av kulturen kammeret simulert ved å løse den adveksjon /diffusjon transport ligning, sammen med Navier-Stokes ligningene. Et fullt anoksisk kulturmedium inne i kammeret kulturen ble betraktet som startbetingelse (verste tilfelle). Denne beregningsmodell kan generaliseres til alle de oppløste arter preget av lignende Péclet tall (dvs. forholdet mellom advective og diffusiv transport priser). Detaljer om modellforutsetninger og ligninger er rapportert i S2 tekst.
In vitro
cellekultur
Utførelsen av bioreaktor ble forklarende testet i ultralav skjærspenningen dynamisk kultur ramme (innføre en strømningshastighet på 5 ml /min), som er identifisert fra de i silico analog in vitro eksperiment (se resultater). Den ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinje Calu-3 (American Type Culture Collection, ATCC, VA, USA) ble valgt og resultatene av den dynamiske kultur ble sammenlignet med en statisk suspensjonskultur kontroll. I detalj ble celler dyrket i komplett medium Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Sigma Aldrich, MO, USA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin (P /S) og 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA, Sigma Aldrich, MO, USA) og holdt under standard cellekulturbetingelser ved 37 ° C i en vannmettet atmosfære av 5% CO
2 i luft. Etter ekspansjon i cellekulturflasker, 9×10
6 Calu-3-celler (1.92×10
5 celle /ml) ble inokulert i bioreaktoren kulturen kammeret og dyrket i 5 dager i dynamisk suspensjon med komplett vekstmedium. Bioreaktoren ble operert ved en strømningshastighet på 5 ml /min. Parallelt ble Calu-3-celler sådd med den samme tetthet på lave festekulturflasker (Corning Inc., NY, USA) anvendt som kontroll, som representerer en modell av statisk suspensjonskultur. Etter 5 dager ble dynamiske og statiske suspenderte dyrkede celler reddet fra bioreaktoren og fra den lave festekulturflaske, henholdsvis, og resuspendert i friskt vekstmedium for videre analyse. Tre uavhengige statiske og dynamiske suspensjonskulturer ble utført.
Vurdering av
in vitro
cellekultur
Calu-3 celler høstet fra bioreaktor og fra lav festekulturen kolbe og re-suspendert i friskt vekstmedium ble undersøkt ved invertert mikroskop (Olympus CK40, Japan). Mikrofotografier ble samlet og analysert ved et bildeanalyseprogramvare (Image Pro-plus 4,0, Media Cybernetics, USA) i rekkefølge (1) for å beregne det antall enkelt Calu-3-celler og antallet Calu-3-celler som danner kulene, og (2) for å bestemme de sfæroide størrelser.
Videre ble Calu-3-celler fra dynamisk og statisk suspendert kultur behandlet for transmisjonselektronmikroskopi (TEM) analyse og for immunocytokjemi. For TEM-analyse, ble Calu-3-celler fiksert i Karnovsky løsning (4% formaldehyd, 5% glutaraldehyd). Prøvene ble postfiksert i 1% osmiumtetroksyd og dehydrert med økende konsentrasjon av alkohol. Deretter ble prøver vasket med propylenoksyd og innleiret i epoksyharpiks. Deler av 0,5 mikrometer tykkelse ble farget med metylenblått og safranin til morfologisk velge interessefelt. Deretter ble ultratynne seksjoner oppsamlet på en 300-mesh kobbergitter og, etter farging med uranylacetat og bly-citrat, ble kvalitativt undersøkt under TEM (Philips EM 208S, Nederland). For å evaluere den fraksjon av cellene i aktiv cellesyklus, er tilstedeværelsen av reversible DNA-dobbeltstrengbrudd, og den apoptotisk celledød, ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd og cytocentrifuged på en glassplate for å oppnå en tetthet på 10
5-celler per sted. Celle flekker ble farget av anti-Ki67 (Ki67, mus monoklonalt, DAKO, Italia) og anti-gamma histon H2AX (γH2AX, kanin polyklonale, Bethyl Laboratories, TX, USA) antistoffer og avslørt av DAB (3,3′-diaminobenzidin) (HRP) Substrat Kit reaksjon (DAKO, Italia). Den kvantitative vurderingen av den fraksjon av Ki67 og γH2AX positive celler ble utført ved å beregne antall positive kjerner i løpet av en total på 900-2000 kjerner telles for hver analyserte prøve. Den apoptotisk celledød ved encellede nivå ble undersøkt ved hjelp av In Situ celledød Detection Kit, Fluorescein analysen (Enzyme Solution TdT, Etikett Solution fluorescein-dUTP, Roche). Grønn atom fluorescens positivitet ble målt ved hjelp av Olympus mikroskop BX60. Kjerner ble anerkjent av den blå fluorescens av 4 «, 6-diamidine-to-phenyndole (DAPI, Sigma, Italia). Fraksjonen av døde celler ble bestemt ved telling av antallet av apoptotiske kjerner over et totalt nesten 1000 celler. Data ble analysert ved anvendelse av en enveis ANOVA test. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant når p 0,05. For å undersøke en mulig utilsiktet adhesjonen av celler /sfæroider på filteret etter 5 dager med dynamisk kulturen innen bioreaktoren ble filteret fiksert med 4% paraformaldehyd og inkubert med DAPI i 15 minutter ved romtemperatur, og suksessivt undersøkt ved fluorescens mikroskop for å vurdere tilstedeværelse av kjerner på overflaten. Til slutt, for å vurdere tilstedeværelse av klebet Calu-3-celler og sedimentering i det nedre område av dyrkningskammeret, etter celle redde den indre vegg av kulturen kammeret ble raspet av en celleskrape og vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) . PBS ble derfor samlet i en petriskål og observert av invertert mikroskop for å oppdage tilstedeværelsen av Calu-3 celler.
Resultater
Flow dynamikk innenfor bioreaktor kultur kammer
Multiphysics numeriske simuleringer lov til å karakterisere strømningsfeltet inne i bioreaktoren kulturen kammeret. Figur 2 viser skjematiske fremstillinger av de typiske middels strømningsstrukturer som etablerer inne dyrkningskammeret, som følge av den gjensidige påvirkning mellom mediet (primær fase) og celler /konstruksjonene (dispergert fase), avhengig av den pålagte strømningshastighet. I detalj, i tilfelle av strømningsrate verdier lavere enn 20 ml /min (Figur 2A og 2A1), det medium som strømmer inn i kulturen kammeret gjennom ventilen ikke har tilstrekkelig energi til å bart samvirke med sideveggen av kulturen kammeret. Balansen mellom hydrodynamiske og tyngdekraften fører til dannelse av en dynamisk stor oppdriftsvirvel ligger langt fra veggen av kammeret (figur 2A1). Dette oppdrifts vortex er omgitt av mindre Virvel strukturer som ligger nærmere veggen, som sikrer at suspensjonen av de dyrkede celler og øke blanding og transport (figur 2A1). Som et eksempel, viser figur 3 den tid utviklingen av VF okkupert av suspenderte celler inne i kulturen kammeret, erholdt som simulerer nærvær av 9×10
6 inokulerte celler (initial VF = 0,48%) og innføre en strømningshastighet verdi på 5 mL /min (ultralav skjærspenningstilstand, i likhet med den eksperimentelle in vitro-test). Det kan observeres at dyrkede celler blir opprettholdt stort sett jevnt fordelt i det nedre område av kulturen kammeret. I detalj, etter en forbigående på omtrent 5 minutter, er den 95,3% av de inokulerte cellene suspendert på et gjennomsnitt VF verdi på ca. 0,33%, som er nær den opprinnelige VF verdi (0,48%), med toppen av tetthetsfunksjonen sannsynlighet (PDF) verdi lik 2,5, svarende til VF-verdier mellom 0 og 0,5% (figur 4A). På bunnen av dyrkningskammeret, blir et lite volum på ca. 194 ul karakterisert ved et VF-verdi rundt 6%, som dynamisk involverer bare 2% av de inokulerte cellene (figur 3). Denne pakking verdi er mer enn tre ganger lavere enn den terskelverdi på sedimentering som ble satt (20%) og omtrent ti ganger lavere enn den maksimale pakningsgrensen på 63%. Spesielt, når en strømningshastighet lavere enn 20 ml /min vedtas, fordelingen av skjær-spenningsverdier som oppleves av cellene i kulturen kammeret viser at de høyeste skjærspenningsnivået er lavere enn 1 MPa (figur 4B), med middelverdi og median verdier nær 1×10
-2 mPa (den såkalte ultralav skjærspenningstilstand).
strømningsfelt visualisering av den gjensidige påvirkning mellom mediet (primær fase), og de celler /konstruksjonene (dispergert fase) innenfor kulturen kammer for ultralav (A og A1) med lav til moderat (B og B1) skjærspenningsbetingelser. Strømningsfeltet er avbildet ved hjelp av både lineære integrerte convolution linjer (A og B), og en klassisk representasjon strømlinje (A1 og B1). Gule piler indikerer strømningen innløp og utløp. Blå piler indikerer de primære flyte virvlene. Røde piler indikerer sekundære virvlene.
Contour plott av tidsmessige utviklingen av VF okkupert av de suspenderte celler inne bioreaktor kultur kammeret 0-60 min av simulert tid, med en pålagt strømningshastighet på 5 ml /min (ultralav skjærspenningstilstand, i likhet med den eksperimentelle in vitro-test) og 9×10
6 inokulerte celler (initial VF = 0,48%). Etter en forbigående på omtrent 5 minutter, er den 95,3% av de inokulerte cellene suspendert på et gjennomsnitt VF verdi på ca. 0,33%, meget nær den opprinnelige verdi VF. På bunnen av dyrkningskammeret, ul et lite volum på ca. 194 er karakterisert ved en VF verdi rundt 6%, mer enn tre ganger lavere enn den innstilte terskelverdi på sedimentering (20%), som dynamisk involverer bare 2% av de inokulerte celler.
sannsynlighetstetthetsfunksjoner (PDF) av celle VF (A) og skjærspenninger (B) verdier som oppleves av den cellulære fase i bioreaktoren kulturen kammeret etter 60 min, med en pålagt strømnings hastighet på 5 ml /min og 9×10
6 inokulerte cellene
økning av strømningshastigheten ut over 20 ml /min fremmer forekomsten av Coanda-effekten [39] i bioreaktoren kulturen kammeret. stråle inn i kulturen kammeret er tiltrukket til den nærliggende vegg og, på grunn av den særegne veggkrumning, oppstår det en separasjonsområdet langt fra bunnveggen av kammeret (fig 2B og 2B1). Som et resultat av en stor oppdrifts urviseren vortex, som motvekt gravitasjonskraften og således opprettholder celler /konstrukter i suspensjon, blir generert (Fig 2B1). I nærheten av ytterveggen, utvikler en ytterligere mindre vortex, som kan spille en gunstig rolle for å øke blanding og suspensjonen av flytende konstruksjoner (fig 2B1). Å ta i bruk en slik strømningshastighet område (30-120 ml /min), forskjøvet til høyre skjærspenningsfordeling ble oppnådd, med gjennomsnittlige verdier i området fra 2 til omkring 7 MPa, med maksimal skjærspenningsverdier innenfor dyrkningskammeret lavere enn 50 mPa (lav- til moderat skjærspenningstilstand, se detaljer i S3 Text).
Når det gjelder transport av oppløst oksygen i kulturen kammeret pålegge et fullt anoksisk første betingelse for mediet, viser tydelig numerisk simulering at innen 840 s ( 14 minutter) partialtrykket av oppløst oksygen blir oppfylt i mer enn 90% av kulturen kammervolum (S2 film, S2 tekst). De oppnådde resultater kan generaliseres til transport av andre arter som er oppløst i dyrkningsmediet, fordi deres transport er karakterisert ved Peclet nummer to-tre størrelsesordener høyere enn enhet, noe som bekrefter at fluid strukturer som etablerer inne i kammeret fremme transport av oppløst oksygen og næringsstoffer gjennom å blande, og dermed homogenisere sin konsentrasjon.
In vitro
kultur utfallet
Etter 5 dager med suspensjon kultur, celler ble reddet fra den lave festekulturen kolbe (statisk suspensjon ) og fra bioreaktoren kulturen kammeret (dynamisk suspensjon). Først ble de morfologisk analysert: observert av fasekontrastmikroskop, Calu-3 dyrket under statiske suspensjon viser individuelle celler eller svært små klynger (Fig 5A), mens celler dyrket i bioreaktor henhold dynamisk fjæring tydelig viser dannelsen av kuler (Fig 5B ). Spesielt er forholdet mellom Calu-3-celler som danner kulene og enkelt Calu-3-celler til 59,7 Calu-3-celler høstet fra den lave festekulturflaske og 76,0 for Calu-3-celler dyrket i bioreaktoren.
Etter 5 dagers suspensjonskultur, (A) Calu-3-celler dyrket i statisk suspensjon viser enkeltceller eller meget små klaser, (B) Calu-3-celler dyrket med dynamisk suspensjon viser dannelsen av sfæroider. Scale barer 200 mikrometer.
Videre ultrastructural analyse av TEM gjør det mulig å observere at Calu-3 fra statisk suspensjon er delvis forbundet med svake og små etterlevelse veikryss (Fig 6A og 6A1), med morfologiske endringer ( S1 fig). Derimot er kulene høstet fra bioreaktor kultur kammeret er 2,4 ganger (p 0,001) større (gjennomsnittlig areal = 23699 ± 5645 mikrometer
2) enn klynger reddet fra den lave festekulturen kolbe (gjennomsnittlig areal = 9787 ± 2202 mikrometer
2), og er sammensatt av celler preget av de typiske morfologiske trekk ved Calu-3, som fremtredende nucleoli og membraner microvilli (figur 6B), med godt utbygde etterlevelse veikryss (fig 6B1).
TEM-bilder viser (A) en liten klynge (3-celler) fra Calu-3-celler dyrket i statisk suspensjon, og (B) en større sfæroide (9 celler) av Calu-3-celler dyrkes i bioreaktoren, høstes både etter 5 dagers suspensjon kultur. Prominente nucleoli (N: kjerner), cytoplasmatiske strukturer og på langs og på tvers orienterte microvilli er karakteristiske trekk ved NSCLC cellelinje Calu-3. Høy forstørrelse utsikt over områdene som inngår i sorte rektangler i paneler A og B vist henholdsvis (A1) en enkelt liten tilslutning krysset (pilspiss) blant celler dyrket under statisk suspensjon, og (B1) flere velutviklede etterlevelse veikryss (pilspisser) utviklet av Calu-3 dyrket i bioreaktor. Skala barer: A og B = 5 mikrometer; A1 og B1 = 1 um.
Disse observasjonene er støttet av vurderingen av Ki67-immunfarging, noe som indikerer at fraksjon av sykkel Calu-3-celler er signifikant høyere (1,58 ganger økning) når de dyrkes i dynamisk snarere enn i statiske opphengs forhold (figur 7A). Videre fra kvantifisering av DNA-dobbeltstrengbrudd, er det mulig å merke seg et nedadgående trend (1,5 gangers reduksjon, selv om det ikke er statistisk signifikant) i den fraksjon av γH2AX
pos Calu-3-celler dyrket i bioreaktoren sammen til cellene dyrket under statisk suspensjonen (figur 7B). Dette bekreftes av apoptotisk celledød analysen, faktisk brøkdel av apoptotiske Calu-3 celler høstet fra den statiske suspensjon kontroll (46,5 ± 4,5%) var 16,9 ganger høyere enn celler høstet fra bioreaktor (2,7 ± 0,2%), ( p 0,05)
(A) Bar grafen til måling av Ki67 positive celler, viser brøkdel av sykkel Calu-3 celler etter statisk og dynamisk fjæring kultur (*: p. 0,05 vs statisk suspensjon).
