Abstract
Det er vel kjent at B-1 B-celler er hovedcelletype som er ansvarlig for produksjonen av naturlig immunoglobulin M (IgM) og kan svare på infeksjon ved å øke IgM-sekresjon. Men vi uventet funnet at noen epitelceller kan også uttrykke rearrangert IgM transkripsjon som har naturlige IgM egenskaper, slik som kimlinje-kodet og begrenset omleirings mønstre. Her studerte vi IgM-ekspresjon i humane ikke-B-celler og fant at IgM ofte ble uttrykt av mange menneskelige epiteliale kreftceller, så vel som ikke-cancer epitelceller. Videre CD79A og CD79B, to molekyler som er fysisk knyttet til membranøs IgM på overflaten av B-celler for å danne B-celle-antigen-reseptor-komplekset, ble også uttrykt på celleoverflaten av epiteliale kreftceller og samlokalisert med IgM. Som den naturlige IgM, epiteliale kreftcelle-avledet IgM føres en serie av mikrobielle antigener, slik som enkeltkjedet DNA, dobbeltkjedet DNA, lipopolysakkarid, og den HEp-2 celle-antigen. Mer viktig, stimulering av toll-lignende reseptor-9 (TLR9), som etterligner bakteriell infeksjon, vesentlig øket sekresjon av IgM i humane epiteliale kreftceller. Disse funnene tyder på at menneskelige epiteliale kreftceller så vel som ikke-kreft epitelceller kan spontant produsere IgM med naturlig antistoffaktivitet
Citation. Hu F, Zhang L, Zheng J, Zhao L, Huang J, Shao W , et al. (2012) Spontan Produksjon av immunglobulin M i Human epithelial kreftceller. PLoS ONE 7 (12): e51423. doi: 10,1371 /journal.pone.0051423
Redaktør: Jonas Fuxe, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 27 august 2011; Godkjent: 07.11.2012; Publisert: 12.12.2012
Copyright: © 2012 Hu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd 30973389 og 30772470 fra Natural Science Foundation of China National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det er vel kjent at som en klassisk immunitet molekyl, immunoglobulin (Ig) spiller en viktig rolle i immunsystemet [1]. Den kan festes til fremmede stoffer slik som bakterier og bistå i å ødelegge dem, [2]. Ig ble tidligere antatt å være produsert bare av B-lymfocytter og plasmaceller. I løpet av det siste tiåret, men dette konseptet har blitt utfordret av en rekke studier [3], [4], [5], [6],. I 2003, vi først rapportert IgG uttrykk i menneskelige epiteliale kreftceller [3]. Siden da, har vår gruppe og andre bekreftet at mange humane ikke-B-cancerceller og noen normale celler kan produsere Ig, særlig IgG eller IgA [4], [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Dessuten, disse ikke-B-kreft-celle-avledede IgG eller IgA er involvert i overlevelse og proliferasjon av kreftceller [3], [4], [18]. Imidlertid er ekspresjonen av IgM i humane ikke-B-celler sjelden studert [8]. Nylig fant vi at IgM tung kjede (Ig μ) genet med en distinkt repertoar ble transkribert i menneskelige epiteliale kreftceller [8], noe som tyder på at IgM kan også uttrykkes i disse epiteliale avstamning celler.
Det er to klasser av IgM, naturlige og immun. Naturlig IgM har vært antatt å være produsert bare av medfødt-eksempel B-1 B-celler i fravær av patogene møter, og immun IgM er produsert av både medfødt lignende B-1 B-celler og adaptiv B-2 B-celler fulgt av et antigen eller patogen møte. Naturlig IgM utgjør mesteparten av den totale sirkulerende IgM. Mesteparten av den naturlige IgM er kimlinje kodet og polyreactive, og det binder seg med lav affinitet for en rekke forskjellige antigener, som for eksempel mikrobielle patogener, som bidrar til tidlig immunitet før utbruddet av det adaptive humoral respons og spiller en fundamental rolle i begynnelsen av antimikrobiell immunitet [19]. Men nyere studier av Zhou et al. viste at ikke alle polyreactive naturlige IgM-produserende antigenbindende B-celler uttrykker B-1 B celleoverflatemarkører (f.eks IgM
hei, IgD
lo, B220
lo, Mac-en
hi , CD23
lo og CD5
hi) [20], noe som tyder på at, i tillegg til B-1 B-celler, andre celletyper kan også være involvert i produksjonen av naturlig IgM.
Toll-like reseptorer (TLR) er en klasse av proteiner som spiller en fundamental rolle i det medfødte immunsystemet. De gjenkjenner «patogen-forbundet molekylære mønstre», som er strukturelt konserverte molekyler avledet fra mikrober og kan skilles fra verts molekyler, og aktiverer medfødte immunresponser [21]. Mer enn 13 medlemmer av TLR familie er blitt identifisert i pattedyr. TLR9 spesifikt gjenkjenner unmethylated CpG-sekvenser i mikrobielle DNA [21], [22]. Syntetiske oligodeoksynukleotider (ODN) med unmethylated CpG motiver, som kan etterligne effekten av mikrobiell DNA, er også anerkjent av TLR9 [23], [24], [25], [26]. Når aktivert, TLR9 og dets tilknyttede adaptere, slik som myeloid differensiering antigen 88 (MyD88) [27], [28], rekruttere intracellulære signalformidlere og indusere aktivering av den nukleære faktor-kB (NF-kB) og mitogen-aktivert protein kinase veier, noe som resulterer i produksjon av cytokiner og Ig, hovedsakelig IgM [29].
Hos mennesker er TLR9 uttrykkes fortrinnsvis i B-celler, plasmacytoid dendrittiske celler, monocytter og naturlige drepeceller [22]. Funksjonell TLR9 er også blitt funnet i mange humane epiteliale kreftceller, slik som lungecancer, brystcancer og prostatacancer [30], [31], [32], [33], [34]. Mer viktig, CpG ODN, og selv ikke-CpG ODN kan aktivere TLR9 uttrykt i brystkreftcellelinjer og prostatakreftcellelinjer, noe som resulterer i økt cellulær invasjon [32], [33], [34]. Når aktivert av unmethylated CpG, induserer TLR9 utskillelsen av mange cytokiner, slik som interleukin (IL) -1α, IL-6 og IL-8 [31], [35]. Det er fortsatt uklart om TLR9 på epiteliale kreftceller kan megle IgM produksjon og sekresjon.
I denne studien, vurderte vi IgM uttrykk i menneskelig non-B-celler, og viste at menneskelige epiteliale kreftceller samt ikke- kreft epitelceller kan spontant produsere naturlig IgM. TLR9 agonister stimulert sekresjon av IgM i humane epiteliale kreftceller. Som B-1 B-celle-avledede naturlige IgM, epiteliale kreftcelle-avledet IgM føres en serie av mikrobielle antigener og noen autoantigen. Disse funnene tyder på at menneskelige epiteliale kreftceller så vel som ikke-kreft epitelceller kan spontant produsere IgM med naturlig antistoffaktivitet.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur
den menneskelige livmorhalskreft cellelinje HeLa MR, en
O
6-metylguanin-DNA metyltransferase-mangel derivat av HeLa S3 [36], [37], [38], [39], [40 ], [41], var en gave fra Dr. Shouping Ji (Academy of Military Medical Science, Beijing, Kina). Alle andre cellelinjer, inkludert menneskelige livmorhalskreft cellelinje HeLa, tykktarmskreft cellelinjer HT-29 og SW480, leverkreft cellelinje HepG2, U-2 OS osteosarkomcellelinje, embryonale nyrecellelinjer 293 og 293T, og B lymfatisk leukemi celle linjen Raji ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HeLa MR, HT-29, SW480, HepG2, U-2 OS, 293 og 293T ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika, mens HeLa og Raji ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FBS og 1% antibiotika ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Cellene i logaritmisk vekstfase ble anvendt for eksperimentene.
vevsprøver
Tissue microarrays ble kjøpt fra Avdeling for patologi, Beijing Friendship Hospital. Vi studerte totalt 202 sampler, som omfattet 26 forskjellige tumortyper, 19 motsvarende prøver av godartet sykdom, og normale vev. Vi kuttet 4-mikrometer deler av de resulterende multitumor tissue microarray blokker og montert hver seksjon på et lim-belagt lysbilde (Instrumedics Inc., Hackensack, NJ, USA). Frosne kreft vev, inkludert brystkreft (2 tilfeller), tykktarmskreft (2 tilfeller), lungekreft (2 tilfeller), og eggstokkreft (1 tilfelle) var fra svulstvev prøven bank av Peking University Cancer Hospital. 4-um frosne snitt ble utarbeidet og fastsatt med aceton.
Immunohistochemistry
Tissue microarray seksjonene ble deparaffinized, rehydrert gjennom etanol vasker av graderte konsentrasjoner som er lagt inn i 10 mM citratbuffer (pH 6,0), og deretter oppvarmet to ganger i en mikrobølgeovn i 5 minutter hver. Platene ble deretter inkubert med 3% hydrogenperoksid i 5 minutter, vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS), og blokkert i PBS plus 10% normalt geiteserum i 10 minutter. Etter å ha fjernet overskudd av blokkeringsbuffer, utførte vi indirekte immunhistokjemisk farging med monoklonalt mus anti-human Ig μ (1:100, Dako, Carpinteria, CA, USA). Platene ble inkubert i et fuktet kammer ved 37 ° C i 45 minutter, vasket grundig, og deretter inkubert med geite-anti-muse-IgG-pepperrot-peroksidase (HRP) (1:100, Dako) ved 37 ° C i 30 minutter. Lysbilder ble vasket igjen, og bundet antistoff ble påvist ved hjelp av 3,3′-diaminobenzidintetrahydroklorid (DAB, Dako). Kontroll seksjonene ble farget med geit anti-mus IgG-HRP alene.
immunfluorescens Farging
For å bekrefte uttrykk for IgM i humane epitelceller, ble to farger immunfluorescens farging utført på frosne vev lysbilder . Kort sagt ble de frosne vev glir blokkert med 10% normalt geiteserum, og deretter lysbildene ble inkubert med muse-anti-human Ig μ (Mabworks Biotech Co., Beijing, Kina) og kanin-anti-human pan-cytokeratin eller kanin anti-human CD19 (Santa Cruz, CA, USA) ved 37 ° C i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med TRITC-konjugert geit-anti-mus-IgG og Alexa Fluor® 488-konjugert geit-anti-kanin-IgG (Santa Cruz) ved 37 ° C i 30 minutter. Etter kontra med Hoechst 33342, ble platene observert direkte under en omvendt fluorescens mikroskopi (Olympus IX71-141, Tokyo, Japan).
flowcytometrisystemer Analysis
Vi utførte flowcytometri analyse for å vurdere ekspresjonen av IgM og TLR9 i humane epiteliale kreftceller. For påvisning av IgM og TLR9 på celleoverflaten, ble cellene høstet, vasket to ganger med PBS, blokkert med 2% FBS i PBS ved 4 ° C i 30 minutter og farget med mus-monoklonale antistoffer (mAb) mot human Ig μ (Mabworks) eller TLR9 (IMG-305A, IMGENEX, San Diego, CA, USA) ved 4 ° C i 40 minutter. Etter to vaskinger med PBS, ble cellene inkubert i 100 ul PBS inneholdende fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert geite-anti-mus IgG (Santa Cruz) ved 4 ° C i 30 minutter. Cellene ble vasket to ganger med PBS, og 10.000 celler ble analysert på et FACSCalibur flowcytometer ved hjelp av Cellquest-programvare (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA). Bakgrunnsfluorescens ble bestemt ved anvendelse av celler inkubert med det sekundære antistoff, men uten det primære antistoff.
For vurdering av intracellulær IgM og TLR9, ble de høstede cellene fiksert i 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 30 minutter, vasket med PBS og permeabilized to ganger med 1 x permeabiliseringsbuffer (eBioscience, San Diego, CA, USA). Cellene ble deretter sentrifugert ved 1500 rpm ved 4 ° C i 5 minutter. Supernatanten ble kastet, og cellene ble merket med passende primære og sekundære antistoffer som beskrevet ovenfor.
For å utelukke muligheten for forurensning av cancercellelinjer ved B-lymfocytter, ble cellene høstet, vasket to ganger med PBS, blokkert med 2% FBS i PBS i 30 minutter og farget med monoklonale anti-human CD19-fykoerytrin (PE) (Becton Dickinson) ved 4 ° C i 40 minutter. Etter to vaskinger ble cellene vurdert for CD19-ekspresjon på et FACSCalibur strømningscytometer. Den CD19
+ Raji-cellelinjen ble brukt som en positiv kontroll. Bakgrunnsfluorescens ble bestemt ved anvendelse av celler inkubert med PE-konjugert mus-IgG (Becton Dickinson).
Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) og Realtime PCR-analyser
Totalt RNA ble ekstrahert fra celler eller prøver vev ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og ble behandlet med TURBO DNase (Ambion, Austin, TX, USA) for å eliminere forurensning av genomisk DNA. Revers transkripsjon ble utført med RevertAid First Strand cDNA syntese kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Det resulterende cDNA ble underkastet PCR og realtime PCR-analyser.
PCR ble utført for å analysere ekspresjon av Ig μ, Ig κ, CD79A, CD79B, TLR9 og MyD88 i de humane epithelical kreftcellelinjer (primere vist i Tabell S1). PCR-produktene ble separert ved gelelektroforese på 1% agarose. Identiteten av PCR-produktene ble ytterligere bekreftet ved DNA-sekvensering.
To-trinns realtime PCR ble utført for å kvantifisere ekspresjonen av IgM og CD19 i den menneskelige epiteliale kreftvevet ved hjelp av SYBR grønn Master Mix (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner (primere vist i Tabell S2). Reaksjonen ble utført på 7300 Fast Realtime PCR System (Applied Biosystems). Genekspresjon ble kvantifisert relativt til uttrykk av husholdningsgenet GAPDH, og normalisert til den positive kontrollen (humane perifere mononukleære blodceller) med standard 2
-. △△ CT beregning
Protein Extraction og Western Blot analyse
Hvis du vil trekke cytoplasmatiske proteiner ble høstet celle pellets lysert i radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) lysebuffer (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA), og inkubert på is i 30 minutter. Lysatene ble sentrifugert ved 16000 rpm ved 4 ° C i 30 minutter. Supernatantene ble samlet opp for Western blot-analyse.
For å oppnå utskilte proteiner, ble cellekultur-supernatanten uten celleavfall ble oppsamlet, utfelt over natten med 100% mettet ammoniumsulfat (01:01), og sentrifugert ved 16000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble kastet. Pelleten ble resuspendert i 100 ul PBS, dialysert to ganger med 0,05 M PBS i 24 timer, og deretter benyttet for Western blot-analyse.
Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av redusert (med β-merkaptoetanol) og ikke-redusert ( uten β-merkaptoetanol) proteinprøver som ble separert ved hjelp av SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner (Amersham Pharmacia, Little Chalfont, UK). Membranene ble blokkert med Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20 og 5% fettfri melk eller 5% bovint serumalbumin (for detektering av fosfoproteiner) ved romtemperatur i 2 timer, og ble inkubert med primære antistoffer, så som mus anti- human Ig μ mAb (Mabworks), geite-anti-humant Ig-u polyklonalt antistoff (Sigma, St. Louis, MO, USA), muse-anti-human CD79A og CD79B mAbs (Abcam, Cambridge, MA, USA), muse anti-human TLR9 mAb (IMGENEX), anti-fosfo-PKC-mAb, anti-fosfo-Akt mAb, anti-fosfo-ERK mAb, anti-fosfo-IkB-mAb og anti-IkB-mAb (alle fra Cell Signaling, Danvers, MA, USA ), kanin-anti-ERK-polyklonalt antistoff (Kangcheng Biotech Co, Shanghai), og anti-actin mAb (Sigma) ved 4 ° C over natten. Membranene ble vasket tre ganger med Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20 i 10 minutter hver, og inkubert med IRDye 800- eller 700-konjugerte sekundære antistoffer (LI-COR Bioscience Inc., Lincoln, NE, USA) ved værelses temperaturen i mørket i 1 time. Det signal som ble påvist ved anvendelse av den Odyssey Imaging System (LI-COR Bioscience).
intracellulært kalsium Flux Måling
Måling av intracellulært kalsium fluks ble utført som beskrevet tidligere [42]. Kort sagt ble HeLa-celler dyrket i MR spesialiserte glassbunn mikroskåler (Mattek Corp., Ashland, MA, USA) og lastet med 5 uM Fluo-3 /AM i HEPES-bufret saltvann ved 37 ° C i mørke i 30 minutter . Cellene ble vasket med HEPES-bufret saltvann og stimuleres med 20 ug /ml geite anti-humant IgM eller geit IgG. Fluorescens ble overvåket ved 488 nm (eksitasjon) og 530 nm (emisjon) ved anvendelse av et Leica TCS-NT konfokal fluorescens mikroskop (Leica MicroImaging, Mannheim, Tyskland) med en 40 x neddyppingsobjektivet linse (Wetzler, Heidelberg, Tyskland). Bilder ble samlet på 5 sekunder for fem ganger før stimulering, og hvert 1,5 sekund i 60 sekunder, deretter hvert 5. sekund for ytterligere 120 sekunder. Målingen ble gjennomført ved romtemperatur, og hvert felt av celler ble valgt tilfeldig. Bildene ble analysert for relativ fluorescens bruker Leica konfokal programvare (Wetzler). Alle kalsium flux analyser ble utført i nærvær av ekstracellulært kalsium og i fravær av EDTA eller EGTA i assay-buffere. Derfor ble både intracellulært kalsium utgivelsen og ekstracellulært kalsium tilstrømningen analysert.
Cell Behandling med ODN Stimulering
HeLa MR-celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS før ODN stimulering. Mediet ble deretter byttet til DMEM supplert med 2% FBS og 10 ug /ml av en stimulus, slik som fosfortioat-modifiserte, human-spesifikke CpG 2006 [5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 «] non-CpG-ODN styrer CpG 2078 [5»-TGCTGCTTCCCCCCCCCCCC-3 «] og GPC [5′-TGCTGCTTTTG TGCTTTTGTGC TT-3′], eller nøytraliserende CpG-N ODN208 [5»-TGCCGCGGCAGA-3 «]) ble tilsatt med eller uten 10 umol /l klorokin ( Sigma) i 1 time for preinkubering før ODN ble tilsatt. Etter 3 dager ble cellene høstet for RT-PCR, flowcytometri, og Western blot-analyse. Cellekultursupernatanten ble også oppsamlet for Western blot som beskrevet ovenfor.
MyD88 knockdown-analysen ble utført ved anvendelse av syntetisert MyD88 sirnas som tidligere beskrevet [43]. SiRNA ble transfektert inn i HeLa MR-cellelinjen ved elektroporering. De ovenfor nevnte stimulus (CpG 2006, CpG 2078 eller GPC) ble tilsatt til cellekulturen 24 timer etter elecroporation, og cellene ble høstet etter ytterligere 3 dager for RT-PCR, flowcytometri, og Western blot-analyser.
konfokalmikroskopi analyse
HeLa MR-celler ble stimulert med eller uten geit anti-humant Ig-u polyklonalt antistoff (20 ug /ml) i 5 minutter, og dobbel farget med PerCP /Cy5.5-konjugert mus anti-human Ig μ (Biolegend, San Diego, CA, USA) og FITC-konjugert mus-anti-human CD79A (ABD Serotec, Kidlington, UK) eller FITC-konjugert mus-anti-human Ig μ og PE-konjugert anti-mus menneskelig CD79B (eBioscience). Cellene deretter gjennomgikk konfokalmikroskopi analyse, og bildene ble samlet inn med en Axioskop-2 mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan), en 63 × NA 0,75 Plan Apochromat oljeneddyppingsobjektivet og standard filtersett (Leica MicroImaging), en 1300 × 1030 pixel-avkjølte CCD kamera (CCD-1300-Y, Princeton Instruments, Trenton, NJ, USA), og Metavue programvare (Visitron Systems, Puchheim, Tyskland)
Analyse av Natural antistoffaktivitet av epithelial. Cancer Cell-avledet IgM
For å analysere om epitel kreftcelle-avledet IgM har naturlig antistoffaktivitet mot de mikrobielle antigener som enkelttrådet DNA (ssDNA), dobbelttrådet DNA (dsDNA), eller lipopolysakkarid (LPS ), utførte vi antigen-spesifikke enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) ved anvendelse av HeLa MR cellekultursupernatant inneholdende IgM. Mikrotiterplater ble belagt med 10 ug /ml, ssDNA-dsDNA eller LPS (alt fra Sigma). Mus anti-human Ig μ mAb og HRP-merket geit anti-muse-IgG ble benyttet for å detektere IgM, med tetrametylbenzidin som substrat. OD450 ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Bio-Tek, Winooski, VT, USA).
Vi kan også utføres indirekte immunfluorescens-farging for å analysere aktiviteten av autoantistoff epitelial kreft celle-avledet IgM. Vi inkuberes HEp-2 celle lysbilder (EUROIMMUN, Lübeck, Tyskland) med HeLa MR cellekultursupernatant inneholder IgM. Etter vasking med PBS, ble muse-anti-human Ig μ mAb og FITC-konjugert geite-anti-muse-IgG brukt til å påvise positive signaler.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført med den statistiske programvare SAS versjon 8.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Forskjeller mellom ulike grupper ble beregnet ved Students
t
test eller chi-kvadrat test. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant når
P
var. 0,05
Resultater
IgM er hovedsakelig uttrykt i humane epitelceller
Vi analyserte vev microarray av 202 vevsprøver for IgM uttrykk ved immunhistokjemi, inkludert kreft eller normale vev av epitel, mesenchymale og neuroglial opprinnelse samt kjønnsceller (tabell S3). Vi fant at IgM ble uttrykt hyppigere i epitel-celler, inkludert 17 av 34 (50%) epiteliale kreftceller, spesielt karsinomer i lunge, bryst, lever og bukspyttkjertel (figur 1A-D), og 23 av 66 (34,8% ) ikke-cancer epitelceller (figur 1E, F). I motsetning til dette ingen eller lav-frekvens IgM ble funnet i neoplastiske mesenchymale celler (en av 47, [2,1%]; inkludert lipoma, fibroma, og leiomyoma celler [figur 1i]) og i normale mesenchymale celler (en av 34, [2,9 %]; inkludert lipocytes, fibroblaster og glattmuskelceller). Ingen av de neuroglial cellene vurderes uttrykt IgM (0 av 13, [0%]). Det er interessant at IgM-ekspresjon ble påvist ved høye nivåer i seminom celler og i enkelte normale kjønnsceller i testiklene (figur 1 K, L). To tilfeller av T-celle lymfom hadde ingen påviselig IgM uttrykk, som forventet (fig 1J). Disse resultater antyder at ikke-B-celle-avledede IgM finnes hovedsakelig i epitelceller
A, lungekreftceller.; B, brystcancer-celler; C, leverkreftceller; D, kreft i bukspyttkjertelen celler; E, nyretubuli epitelceller; F, endometrium epitelceller; G, renale tubulære epitelceller, farget med geite-anti-muse-IgG-HRP bare, som en negativ kontroll; H, endometrium epitelceller, farget med geite-anti-muse-IgG-HRP bare, som en negativ kontroll; Jeg, Leiomyomer celler; J, T lymfom celler; K, Seminoma celler; L, spermatocytter.
For ytterligere å bekrefte at IgM er uttrykt ved de epiteliale kreftceller, men ikke de infiltrert B-celler, to-farge immunfluorescens farging ble utført på frosne epiteliale kreft vev lysbilder, inkludert tykktarmskreft , brystkreft, lungekreft og eggstokk-kreft, med anti-IgM og anti-pan-cytokeratin antistoffer. Som vist i figur 2A, ble en signifikant ko-lokalisering avslørte bewteen IgM og cytokeratin; bare noen få B-celleinfiltrasjon ble påvist i disse vevene som demonstrert av IgM og CD19 dobbel farging (figur S1). Videre realtime PCR-analyse viste at det ikke var noen korrelasjon mellom nivåene av IgM-transkripter og B-celle-spesifikke transkripter CD19 i disse vevene, som de uttrykte høyere nivåer av IgM enn humane perifere mononukleære blodceller (PBMC), men uttrykkes ganske lavere nivå av CD19 enn PBMC (figur 2B). Alle disse resultatene tyder på at IgM-positive signal ble avledet fra epiteliale kreftceller.
a, co-lokalisering i humane epiteliale cancere av IgM og cytokeratin. Humane epiteliale kreftformer, inkludert tykktarmskreft, brystkreft, lungekreft og eggstokk-kreft, var dobbelt farget med anti-humant IgM (rød), anti-human pan-cytokeratin (grønn), og Hoechest 33342 (blå). Den colocalization av IgM og cytokeratin ble vist (gul). Tykktarmskreft farget med TRITC-konjugert geit-anti-mus-IgG og Alexa Fluor® 488-konjugert geit-anti-kanin-IgG bare ble anvendt som en negativ kontroll. B, var det ingen korrelasjon mellom nivåene av IgM-transkripter og B-celle-spesifikke CD19-transkripter i humane epiteliale kreftformer. Humane epiteliale kreftformer, inkludert tykktarmskreft, brystkreft, lungekreft, eggstokk-kreft og ble utsatt for QRT-PCR-analyse av IgM og CD19 ekspresjon. Humane perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble brukt som positiv kontroll for IgM og CD19 uttrykk.
IgM er mye Uttrykt i flere menneskerettighets epithelial kreft celle linjer
Vi har tidligere funnet uttrykk av monoklonale, omorganiseres Ig μ i HeLa S3 og HT-29 celler [8]. For å avgjøre om IgM ble allment uttrykt i ikke-B-celler, spesielt epiteliale kreftcellelinjer, vurdert vi uttrykk for Ig um og Ig κ gener i fire menneskelige epiteliale kreftcellelinjer (livmorhalskreftcellelinjer HeLa og HeLa MR, tykktarmskreft celle linje SW480, og leverkreft cellelinje HepG2), en osteosarcoma-cellelinje (U-2 OS), og to humane embryonale nyrecellelinjer (293 og 293T) av RT-PCR. Raji-celler ble anvendt som en positiv kontroll. Resultatene viste at Ig um og Ig κ transkripsjoner ble påvist i alle disse cellelinjene (GenBank tiltredelse No. FJ197674, figur 3A). Sekvensanalyse viste at Ig κ hadde en dominerende Vκ4-1 /Jκ3 rekombinasjon mønster (data ikke vist).
A, deteksjon av Ig um og Ig κ transkripsjoner i flere kreftcellelinjer av semi-nestet RT- PCR. HeLa og HeLa MR, livmorhalskreft cellelinjer; SW480, tykktarmskreftcellelinje; U-2 OS, osteosarcom-cellelinje; HepG2, leverkreft cellelinje; 293 og 293T, humane embryonale nyrecellelinjer. Raji, human B-lymfatisk leukemi-cellelinje, som positiv kontroll; GAPDH, intern kontroll. B, flowcytometri studie ved hjelp av mus anti-human Ig μ mAb viste at IgM var lokalisert ikke bare på plasmamembranen, men også i cytoplasma av epiteliale kreftceller, spesielt HeLa-celler MR. Rød linje, isotypekontrollantistoff IgG1; Blå linje, anti-humant IgM. C, Konfokalmikroskopi analyse av HeLa MR-celler ved anvendelse av mus anti-human Ig μ mAb viste at IgM var tilstede både på cellemembran og i cytoplasma. Mus IgG, som isotypekontroll. D, hele IgM ble detektert i HeLa MR-celler ved ikke-reduserende SDS-PAGE (uten β-merkaptoetanol) og Western blot med geite-anti-humant Ig-u polyklonalt antistoff. Humant IgM, som positiv kontroll. E, IgM ekspresjon ble påvist i HeLa-celler MR ved reduserende SDS-PAGE (med β-merkaptoetanol) og Western blot med muse-anti-human Ig μ mAb. Humant IgM, som positiv kontroll; p-aktin, intern kontroll. F, IgM ble også påvist i kulturoverstående av HeLa MR-celler ved reduserende SDS-PAGE og Western blot ved bruk av mus anti-human Ig μ mAb. Humant IgM, som positiv kontroll; Medium, som negativ kontroll.
Strømningscytometri-analyse viste membran og cytoplasmisk ekspresjon av IgM i HeLa-celler MR, og lite eller ingen ekspresjon av membranøs IgM med lav ekspresjon av cytoplasmisk IgM i HeLa-celler og HepG2 ( Figur 3B). Da HeLa MR ble valgt som en cellemodell for videre analyse. Konfokal mikroskopi bekreftet lokalisering av IgM for å være på membranen og i cytoplasma (figur 3C). Reduserende og ikke-reduserende Western blot-analyse avslørte at ekspresjonen av IgM i cellene, så vel som cellekultursupernatant (figur 3D-F).
Som en av de viktigste kontrollene, har vi funnet at ingen av kreftcellelinjer som vurderes uttrykt overflate CD19 bortsett fra Raji-celle som ble anvendt som en positiv kontroll (figur S2). Disse funnene utelukke muligheten for forurensning av kreft cellelinjer av B-lymfocytter.
Uttrykk av BCR-lignende Complex i Human Epithelial kreftceller
CD79A og CD79B, to B-celle spesifikke molekyler, er fysisk knyttet til membranøs IgM på overflaten av B-celler, danner B-celle-antigen-reseptor (BCR) kompleks. For å løse enten CD79A og CD79B også er knyttet til epitelial kreft celle-avledet IgM, som danner en BCR-liknende kompleks, vi først analysert om disse molekylene kan bli uttrykt av disse cellene. Ved hjelp av RT-PCR og Western blot analyser demonstrerte vi uttrykket av CD79A og CD79B i epiteliale kreftceller (figur 4A, B). Ved hjelp av HeLa MR som en cellemodell, ytterligere bekreftet vi at disse molekylene ble co-lokalisert med membran IgM (figur 4C). Mer viktig, ble det bemerket at før stimulering, ble BCR-liknende kompleks jevnt fordelt på epiteliale kreftceller. Etter stimulering, anti-IgM-antistoff tverrbundet BCR-lignende kompleks i små og store flekker (figur 4C) og induserte en økning i kalsiumstrøm (figur 4D). Videre, BCR nedstrøms signalveier, fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt og fosfolipase C (PLC) -γ2-PKC, ble aktivert etter stimulering med anti-humant IgM (figur 4E). Tatt sammen tyder disse resultater på at CD79A og CD79B er knyttet til membranøs IgM på overflaten av epiteliale kreftceller, som danner et BCR-liknende kompleks, som kan formidle signaler som fører til vekst og overlevelse av de epiteliale kreftceller.
A, RT-PCR, viste at CD79A og CD79B ble påvist i humane kreftcellelinjer, U-2 OS, HT-29, HeLa MR og HeLa, og at det var to isoformer av både CD79A og CD79B. Raji, som positiv kontroll; GAPDH, intern kontroll. PCR-produktene ble separert ved gelelektroforese på 1% agarose og ble ytterligere bekreftet ved DNA-sekvensering. B, Western blot-analyse viste nærvær av den større isoformen av CD79A og CD79B. p-aktin, intern kontroll. C, konfokalmikroskopi analyse viste samlokalisering (gul) for CD79A (FITC, grønn) og Ig M (PerCP /Cy5.5, red) (øvre to paneler), eller CD79B (PE, rød) og Ig M (FITC, grønn) (nedre to paneler) i HeLa MR celler med eller uten stimulering med anti-IgM. D, kalsium-fluks analyse ved konfokal mikroskopi i HeLa MR-celler lastet med Fluo-3 /AM og stimulert med geite anti-humant IgM (a) eller geit-IgG-isotypen som controle (b). Bilder ble tatt til fange etter stimulering for 0, 1, 15, 30, 60 og 150 sekunder. Den tilsvarende tidsforløpet av kalsium fluks er vist. Den relative fluorescens fra bildene som ble beregnet med Leica konfokal programvare. Hver linje representerer signalet som utledes fra en enkelt celle. E, fosforylering av PKC og Akt nedstrøms av PLC-γ2 og PI3K signalveiene, respektivt, ble påvist i HeLa MR-celler etter stimulering med 20 ug /ml geite anti-humant IgM for henholdsvis 5 og 15 minutter.
Analyse av Natural antistoffaktivitet of human epitelial Cancer Cell-utskilt IgM
den spontane uttrykk for IgM i den menneskelige epiteliale kreftceller uten tegn på infeksjon eller annen stimulering oppfordret oss til å oppdage om de har aktiviteten til naturlig IgM. For dette formål, testet vi muligheten av HeLa MR celle-avledet IgM for å gjenkjenne ssDNA, dsDNA, og LPS. Ved hjelp av ELISA, oppdaget vi at HeLa MR-celle IgM utskilt føres alle disse tre antigener (figur 5A-C). I tillegg har denne IgM hadde autoantistoff aktivitet og anerkjent veldefinerte autoantigener i kjernen, cytoplasma, og cytoskjelettet av HEp-2 celler (Figur 5D).
A-C, ELISA viste at utskilt IgM i kultur
