Abstract
Innledning
målretting aktivere onkogene driver mutasjoner i lunge adenokarsinom har ført til forlenget overlevelse hos pasienter husing disse spesifikke genetiske endringer. Den prognostiske verdien av disse mutasjonene er ennå ikke klarlagt. Forekomsten av nylig avdekket ikke-kodende somatisk mutasjon i promoter-regionen i
TERT
genet er også å få den godkjent i lungekreft. Hensikten med denne studien er å vise utbredelsen, tilknytning til clinicalpathological funksjoner og prognostisk verdi av disse faktorene.
Metoder
I en kohort av pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) (n = 174, inkludert 107 lunge adenokarsinom og 67 lunge plateepitelkarsinom),
EGFR
,
KRAS
,
HER2 Hotell og
BRAF
var direkte sekvensert i lunge adeoncarcinoma, ble ALK fusjoner screenet ved hjelp av FISH (Fluorescence
in situ
Hybridisering).
TERT
promoter-regionen ble sekvensert i alle de 174 NSCLC prøvene. Sammenslutninger av disse somatiske mutasjoner og clinicopathological funksjoner, samt prognostiske faktorer ble vurdert.
Resultater
EGFR
,
KRAS
,
HER2
,
BRAF
mutasjon og
ALK
fusjon ble mutert i 25,2%, 6,5%, 1,9%, 0,9% og 3,7% av lungekreft adenokarsinomer. Nei
TERT
promoter mutasjon ble validert ved omvendt-sided sekvensering. Lunge adenokarsinom med
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner viste ingen signifikant forskjell i sykdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS). Cox Multi-varians analyse viste at bare N scenen og
HER2
mutasjon var uavhengige prediktorer for verre total overlevelse (HR = 1,653, 95% KI 1,219 til 2,241,
P
= 0,001; HR = 12,344, 95% KI 2,615 til 58,275,
P
= 0,002).
Konklusjoner
Vi har videre bekreftet at
TERT
promoter mutasjon kan bare eksistere i en svært liten brøkdel av NSCLCs. Disse resultatene indikerer at dele lungeadenokarsinom til molekylære subtyper i henhold til onkogene mutasjoner driver ikke forutsi overlevelse forskjell av sykdommen
relasjon:. Li C, Hao L, Li Y, Wang S, Chen H, Zhang L , et al. (2014) prognostisk verdi Analyse av mutasjons og Clinicopathological Faktorer i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE ni (9): e107276. doi: 10,1371 /journal.pone.0107276
Redaktør: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 02.06.2014; Godkjent: 08.08.2014; Publisert: 08.09.2014
Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Den opprinnelige datablad av vår eksperimentet resultatene kan bli funnet i saksdokumenter
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81302001 til CG Li og 81201649 til BS Sun, http: //www.nsfc.gov.cn), Kina Postdoktor Science Foundation (2014M550147 til CG Li, https://res.chinapostdoctor.org.cn/BshWeb/index.shtml), Key Program for Anti-kreft forskning av Tianjin Science and Technology Commission (12ZCDZSY15400 til CL Wang, https://www.tstc.gov.cn/) og Key Program for Application Foundation, Tianjin Science and Technology Commission (12JCYBJC17800 til CL Wang, https://www.tstc.gov .cn /). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de mest ødeleggende sykdommer og den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som står for ca 85% av lungekreft tilfellene er videre delt til histologiske subtyper av adenokarsinom (ADC), plateepitelkarsinom (SCC) og stor celle karsinom. Adenokarsinom har blitt den mest vanlige lungekreft subtype [2]. Den 5-års overlevelse av NSCLC fortsatt lav som 15-16%, til tross for bedring av behandlingen i de siste tiårene [1], [3]. Bedre forståelse av NSCLC tumorigenesis og faktorer knyttet til prognosen er nødvendig.
Avdekke av aktive mutasjoner i tyrosinkinase domenet
EGFR
har ført til utvikling og bred bruk av gefetinib og erlotinib, som har vist seg å være effektiv i behandlingen av en del av
EGFR
muterte lunge adenokarsinomer [2], [4]. Ifølge spesifikke onkogene driver mutasjoner, er lunge adenokarsinom delt til molekylære undergrupper som
EGFR
,
KRAS
,
ALK
,
HER2
,
BRAF
og så videre [5], [6]. De fleste av disse driver genene har spesifikke målrettede legemidler i bruk eller kliniske studier. Sammenlignet med adenokarsinom, kunnskap om genetiske forandringer på lunge plateepitelkarsinom er begrenset. Hyppig mutasjon, forsterkning eller tap av
FGFR1
,
PTEN
,
PIK3CA
,
NFE2L2
,
NRF
har blitt identifisert i omfattende genomisk studie i lunge plateepitelkarsinom [7]. Fordi den stort sett udefinert mutasjonsspekteret og lave frekvenser av disse genene, er målrettet terapi i lunge plateepitelkarsinom henger etter og innsnevret til kliniske studier.
Nylig har kreft hos mennesker genomsekvense studier avdekket somatiske mutaitons i kjernen promoter av menneskelig telomerase revers transkriptase (
hTERT
)
Gene, som koder den katalytiske subenhet av telomerase [8] -. [10]. Enten C228T eller C250T av
hTERT
promoter mutasjoner forhøyet transkripsjonen aktivitet av
hTERT
genet i luciferase reporter analysene [8]. Tumortyper med hyppige
hTERT
promoter mutasjoner inkludert melanom (71%), Glioma (51%), Myxoid liposarkom (79%), urothelial carcinoma av blære (66%) [8], [9]. Bevis i ovennevnte studiene antydet at
hTERT
promoter mutasjoner potensielt fungere som en driver genet i melanom. Men forekomsten av
hTERT
promoter mutasjon i lungekreft kliniske prøver er fraværende i disse studiene. Det er nødvendig å vise utbredelsen av
hTERT
promoter mutasjon hos NSCLC prøvene som lungekreft aksjer driver muterte gener med melanom, slik som
BRAF Hotell og
NRAS product: [8], [9], [11].
i denne studien, vi forsøkte å vise de omfattende molekylære og clinicopathological funksjoner i NSCLC, samt den prognostiske verdien av disse egenskapene.
Metoder
pasienter og vev
Primære tumorprøver ble innhentet fra 174 pasienter som gjennomgikk potensielt kurativ lunge reseksjon ved Tianjin Medical University Cancer Hospital fra januar 2004 gjennom januar 2008. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board Tianjin Medical University Cancer Institute og sykehus. Alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke. Pasientene ble inkludert i denne spesifikke studier basert på følgende kriterier: de hadde en patologisk diagnose på lunge adenokarsinom eller plateepitelkarsinom, inneholdt deres tumorprøve minimum 50% tumorceller som bestemmes av studie patologer, de har ikke fått neoadjuvant kjemoterapi, og de hadde nok vev for molekylær analyse. Clinicopathological funksjoner og prognose informasjon ble samlet inn.
DNA og mutasjonsanalyse
Genomisk DNA ble isolert fra formalinfiksert parafininnstøpte (FFPE) prøver i henhold til standard protokoller (TIANquick FFPE DNA Kit, Tiangen Inc, Kina).
EGFR plakater (eksoner 18-22),
HER2 plakater (ekson 20),
KRAS plakater (eksoner 2 til 3),
BRAF plakater (ekson 15 ) og
TERT
promoter-regionen ble PCR amplifisert ved hjelp av DNA og direkte sekvensert. Multipleks PCR-analyse ble utført med rTaq DNA-polymerase (Toyobo, Osaka, Japan). Primerne anvendt i disse forsøk er oppført i Tabell S1. ALK fusjoner ble undersøkt ved hjelp av FISH med FFPE- lysbilder.
Statistisk analyse
Foreninger mellom mutasjoner og kliniske og biologiske egenskaper ble analysert ved
χ
2
eller Fishers eksakte test . Overlevelseskurver ble trukket av Kaplan-Meier metoden. Den Cox regresjon (forover sannsynlighetsforhold modell) ble anvendt for å overleve multivariate analyser. Alle data ble analysert ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap versjon 16.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL). De to-sidig signifikansnivå ble satt til
P
. 0,05
Resultater
Pasient Kjennetegn
Ett hundre og syv lunge ADC og 67 SCC pasienter ble inkludert i studien, inkludert 105 menn og 69 kvinner (gjennomsnitts 58 år, range, 39-77 år). Det var 109 røykere og 65 ikke-røykere, sto for 63% og 37%, henholdsvis. Antall pasienter i trinn I-III var 57, 46 og 69, henholdsvis. To prøver var med udefinert scenen. Den detaljerte informasjonen i Tabell 1.
EGFR, KRAS, HER2 Hotell og
BRAF
Mutation Status og ALK fusjoner
Av 107 lunge adenokarsinom prøver, 25,2% (27/107) av svulster ble funnet til båtplass
EGFR
kinase domene mutasjoner. Blant disse 17 var slettinger i ekson 19 og 6 var L858R missense endringer. Andre forandringer inkludert en ekson 20 innsetting, ekson 20 D807N og T790A mutasjoner, en exom 18 R705K mutasjon. Seks prøver (5,6%) hadde en
KRAS
mutasjon, inkludert fem G12V mutasjoner og en I36M missense mutasjon. To prøver næret
HER2
ekson 20 mutasjon, inkludert en 776-779 YVMA innsetting og en S789P mutasjon. Bare én
BRAF
L588F missense mutasjon ble identifisert i disse tumorprøver (figur 1). ALK fusjoner ble detektert i 4 (3,7%) prøver. Fordi mutasjoner av
EGFR, KRAS, HER2, BRAF
, samt
ALK
fusjoner har blitt godt etablert som skal eksisterte i lunge adenokarsinom [5], [12] – [14], disse mutasjon og fusion gener som «stasjoner» lunge adenokarsinom ikke ble vist i lunge plateepitelkarsinom.
De mutasjonsrater
EGFR, KRAS, HER2 Hotell og
BRAF
var 25,2, 5,6, 1,8 og 0,9%, henholdsvis.
5 «ikke-kodende regionen mutasjoner av
TERT
genet hos NSCLC
Verken C228T heller C250T mutasjoner var validert i 174 NSCLC prøver etter omvendt sekvensering. Resultatene indikerte at
TERT
promoter mutasjon kan bare eksistere i en svært liten brøkdel av primær NSCLC prøvene.
Survival Analysis
Etter univariat analyse, avansert klinisk stadieinndeling (
P
= 0,018), lymfeknute metastaser (
P
0,001), ≥2 stasjon av metastaserende lymfeknute (
P
0,001), fikk adjuvant kjemoterapi (
P
= 0,004) var assosiert sykdom tilbakefall (tabell 2).
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjonsstatus var ikke forbundet med tilbakefall overlevelse (
P
= 0.600) eller total overlevelse i lunge adenokarsinom (
P
= 0,873) (figur 2). Cox multivariat frem trinnvis analyse (justert for alder, kjønn, røyking historie, klinisk stadium, histologiske subtyper og mutasjonsstatus) viste at bare lymfeknute stadiet (N scenen) og
HER2
mutasjon var uavhengige prediktorer for dårligere total overlevelse ( HR 1,653, 95% KI 1,219 til 2,241;
P
= 0,001; HR 12,344, 95% KI 2,615 til 58,275;
P
= 0,002). Detaljert mutasjons og overlevelse informasjonen i Tabell S2.
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjonsstatus var ikke forbundet med tilbakefall overlevelse (
P
= 0.600) eller total overlevelse (
P
= 0,873) i lunge adenokarsinom; c-d. Lymfeknute scenen (N scenen) var signifikant assosiert med tilbakefall overlevelse (
P
= 0,001) eller total overlevelse (
P
= 0,001) i NSCLC.
Diskusjoner
NSCLC er en heterogen sykdom, utfallet er forskjellig selv hos pasienter med identiske clinicopathologic funksjoner. Identifisering av onkogene driver mutasjoner i lunge adenokarsinom har i stor grad fremmet klinisk bruk og utvikling av målrettede medikamenter [5], [6], [15], [16]. Selv
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner er blitt etablert som forutsigende og prognostiske markører for pasienter som får
EGFR
-TKIs [4], [17], [18], resultater på prognostiske verdien av disse endringene i genomisk nivå hos pasienter som ikke fikk
EGFR
-TKIs ble sjelden rapportert.
Vi har vist at utbredelsen av kjente driver mutasjoner av
EGFR
,
KRAS
,
HER2, BRAF Hotell og
ALK
i en kohort av 107 lunge adenokarsinom prøven med komplett prognostisk informasjon.
EGFR
mutasjon,
KRAS
mutasjon og
EGFR Twitter /
KRAS
vill type grupper viste ingen signifikant forskjell i både tilbakefall overlevelse og total overlevelse i denne studien. Alle pasientene som deltok i denne studien fikk ikke små molekylære narkotika målretting
EGFR
. Våre resultater tyder på at bestemt driver mutasjon av
EGFR
eller
KRAS
genet ikke forutsi overlevelse fordel eller ulempe når disse pasientene ikke har fått konkrete mål terapi. I multivariat analyse,
HER2
mutasjon ble identifisert som uavhengig prediktor for ugunstig prognose. Fordi bare to eksempler næret
HER2
mutasjon, videre studier med større antall prøver for å bekrefte dette resultatet. Basert på disse fakta, konkluderer vi med at å dele lunge adenokarsinom i molekylære undergrupper bare spår terapi svar, men ikke overlevelsesgevinst hos pasienter som ikke fikk disse stoffene.
Den nye somatiske mutasjoner av
hTERT
genet 5 «promoter-regionen i melanom har gitt en annen lovende kandidat driver genet for lungekreft. Flere studier har identifisert hyppige
hTERT
5 «promotor mutasjoner i melanom [8], [10], hjernesvulst, samt fra relativt lav forekomst av selvfornyelse vev som liposarcomas, hepatocellulært karsinom, uroteliale karsinom, plateepitelkarsinom karsinomer i tungen og Medulloblastomas [9], [19]. Vi skjermet
hTERT
5 «promotorområdet i 174 NSCLC FFPE-prøver for å utforske mutasjonsraten og potensiell prognostisk verdi. Vi identifiserte bare tre C250T mutasjoner fra de 174 prøvene, men ingen av disse ble validert ved omvendt sekvensering, noe som kan muligens være forårsaket av DNA-skader i ferd med formalin festing og parafin innebygging. Resultatene bekreftet at
hTERT
5 «promotor mutasjoner kan bare eksistere i en svært liten brøkdel av NSCLC tilfeller.
begrensning av denne studien bør diskuteres. For å utforske den prognostiske betydning, brukte vi FFPE-prøver som har full overlevelse informasjon. Imidlertid er følsomheten av sekvenseringsresultatene påvirkes av forholdsvis lav kvalitet på FFPE-prøver, hvori DNA brytes ned og kunstig mutert. Mutasjonsraten kjente driver gener er lavere enn tidligere studier med høy kvalitet snap-frosne prøvene [20], [21], og de kunstige mutasjoner dukket opp i
hTERT
5 «promotor regionen. Selv påfølgende prøver med komplette overlevelsesdata er ikke alltid tilgjengelig, vår studie gitt mutasjon spekteret og prognostisk sammenslutning av disse genetiske endringer med tilgjengelig prøve og teknikker.
I konklusjonen, vårt arbeid illustrert mutasjonen spekteret av
EGFR
,
KRAS
,
HER2, BRAF Hotell og
ALK
i lunge adenokarsinom, samt bekreftet at h
TERT
5 «promotor region mutasjon sjelden skjedde i NSCLC prøvene. Vi har også bekreftet at disse driver mutasjoner mangler prognostisk verdi i lunge adenokarsinom pasienter som ikke fikk EGFR TKI behandling, og undertyper fordelt på disse onkogene driver mutasjoner ikke forutsi betydelig overlevelse forskjell.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Liste over primere som brukes for polymerase kjedereaksjon forsterkning av EGFR, KRAS, HER2 og BRAF-genet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0107276.s001 plakater (docx)
Tabell S2.
mutasjons og overlevelse informasjon om 174 NSCLC pasienter. Sex, en mann, to kvinner; Røyking, 0 ikke-røyker, en røyker; sti, patologi; WT, vill-type; DEL, sletting; INS, innsetting; NEG, negative; . POS, positiv
doi: 10,1371 /journal.pone.0107276.s002 plakater (XLS)
