Abstract
Baicalein, et mye brukt kinesisk urtemedisin, har flere farmakologiske aktiviteter. Men forblir de nøyaktige mekanismene for de anti-spredning og anti-metastatiske effekten av baicalein på galleblæren kreft (GBC) dårlig forstått. Derfor er målet med denne studien var å vurdere de anti-spredning og anti-metastatiske virkninger av baicalein og den tilhørende mekanismen (e) på GBC. I denne studien fant vi at behandling med baicalein induserte en signifikant hemmende effekt på spredning og fremmet apoptose i GBC-SD og SGC996 celler, to mest brukte galleblæren kreft cellelinjer. I tillegg behandling med baicalein hemmet metastasering av GBC celler. Videre har vi vist for første gang at baicalein inhiberte GBC cellevekst og metastase via nedregulering av ekspresjonen nivået av sink finger-protein X-bundet (ZFX). I konklusjonen, våre studier tyder på at baicalein kan være en potensiell phytochemical flavonoid for terapi av GBC og ZFX kan tjene som en molekylær markør eller logisk mål for GBC
Citation. Liu TY, Gong W, Tan ZJ, Lu W, Wu XS, Weng H, et al. (2015) Baicalein hemmer utviklingen av galleblæren kreft celler ved Downregulating ZFX. PLoS ONE 10 (1): e0114851. doi: 10,1371 /journal.pone.0114851
Academic Redaktør: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Korea, Republikken
mottatt: 16 januar 2014; Godkjent: 13 november 2014; Publisert: 24 januar 2015
Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Denne studien ble støttet ved National Natural Science Foundation of China (No. 81172026, 81272402, 81301816 og 81172029), National High Technology Research and Development Program (863 Program) (No. 2012AA022606), Stiftelsen for Tverrfaglig forskning av Shanghai Jiao Tong University (No. YG2011ZD07) Shanghai Science and Technology Commission mellomstatlig internasjonalt samarbeidsprosjekt (nr 12410705900), Shanghai Science and Technology Commission medisinsk-guiding prosjektet (nr 12401905800), Program for Changjiang Scholars, Foundation of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Natural Science Research (No. 13XJ10037), ledende talent program for Shanghai, Sailing program av Shanghai Science and Technology Commission (14YF1403000) og Specialized Research Foundation for Ph.D program of Higher Education-Priority Development Field (No. 20130073130014). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Galleblære kreft (GBC) er den femte vanligste kreft i galleveiene, preget av tidlig lymfeknute invasjonen og fjernmetastaser [1-3]. Det pleier å være en aggressiv svulst som sprer seg tidlig og 90% av GBC pasienter er presentert på et avansert, ubrukelige stadium [4, 5]. Tidlig galleblæren karsinom er asymptomatisk eller manifesterer bare som et ubehag i magen. Noen pasienter kan utvikle symptomer på akutt eller kronisk kolecystitt, som er lett å overse eller savner. I senere tid, kan pasienter utvikle magesmerter, gulsott, og kantete, men de fleste av pasientene har ingen kirurgiske muligheter. Prognosen av avansert galleblærekreft er svært dårlig [6-10], og 5-års overlevelse er bare ca 5%. Så langt er kirurgisk reseksjon den eneste behandlingen som gir et håp for helbredelse [11]. Derfor er det svært viktig å identifisere pålitelige biomarkører og narkotika for å overvåke både progresjon og behandling av sykdommen.
Baicalein er en av de effektive ingredienser utvunnet fra
Labiatae
planter
Skjoldbærere baicalensis georgi
«s tørr rot, som har mange farmakologiske effekter som anti-inflammatorisk, anti-bakteriell, anti-virus, anti-allergi, anti-oksidasjon og så videre [12-14]. Nylig har anti-tumoreffekten til baicalein forårsaket mer og mer oppmerksomhet av mennesker. Cellular og dyreforsøk har vist at baicalein hadde sterk anti-tumor aktivitet. For eksempel, baicalein aktivert AhR og faciliated nedbrytningen av cyclin D1, noe som fører til cellesyklus-stans i G1 fase, og induserer inhibering av celleproliferasjon [15]. Baicalein hemmer DMBA /TPA-indusert hud tumorigenesisin mus ved å modulere spredning, apoptose, og betennelse [16]. Baicalein opphever reaktive oksygenforbindelser (ROS) -mediert mitokondriell dysfunksjon ved eksperimentell lungekreft
in vivo product: [17]. Baicalein kan spille en viktig rolle i inhiberende virkning på proliferasjonen av eggstokkreft celler [18]. På grunn av sitt store anti-tumor-spektrum, tilstrekkelig medisin kilde, liten toksisitet og bivirkninger, synes baicalein å være en lovende molekylær markør eller terapeutisk mål for kreft galleblæren.
Sink finger-protein, X-bundet (ZFX) er en transkripsjonsfaktor kodes for av sin gen på pattedyrs X-kromosomet. ZFX spiller en nøkkelrolle i å kontrollere selv fornye og vedlikehold av både embryonale stamceller og blodkreft stamceller [19-23]. Ekspresjonsnivået av ZFX korrelerer med aggressivitet og alvorligheten i mange krefttyper, inkludert prostatakreft, brystkreft, human ondartet gliom og leukemi. Tidligere forskning viste at ZFX kan spille en viktig rolle i celle-proliferasjon, cellesyklusfordeling, og apoptose i mange kreftceller [24-29]. Vår tidligere resulterer også funnet at ZFX kan innebære i regulering av celleproliferasjon og migrasjon i galleblæren kreft [30]. Dermed ble denne studien designet for å undersøke effekter og mekanismer baicalein mot galleblæren kreft celleproliferasjon, invasjon og metastase
in vitro Hotell og i en orthotopic galleblæren svulst modell
in vivo
. Videre ZFX hadde blitt demonstrert som nedstrøms målet for baicalein, som kan tilby en lovende ny tilnærming i effektiv behandling av galleblæren kreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Nude mus (med en innledende kroppsvekt på 20-22 g) ble oppnådd fra Shanghai SLAC Forsøksdyr Co., Ltd (Shanghai, Kina). Alle dyr behandlinger ble utført strengt i samsvar med internasjonale etiske retningslinjer og National Institutes of Health Guide om Care og bruk av forsøksdyr. Forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Shanghai Jiao Tong University.
Cellelinjer og kultur
GBC-SD og SGC996 celler ble kjøpt fra Shanghai Cell Institute Land Cell Bank . De GBC-SD-celler ble dyrket i høy-glucose DMEM (Gibco, USA) og de SGC996 celler ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco, USA). Alle de to cellene ble supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, USA), 100 ug /ml streptomycin og 100 U /mL penicillin (Hyclone, USA), ved 37 ° C, under en 5,0% CO2 atmosfære.
narkotika og antistoffer
baicalein ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), oppløst i DMSO som et lager konsentrasjon på 100 mmol /L, og oppbevares i mørke ved -20 ° C. Fig. 1 viser den kjemiske struktur av baicalein. De endelige baicalein konsentrasjonene som benyttes for de forskjellige forsøk ble fremstilt ved å fortynne stamløsningen med høy-glucose DMEM, eller RPMI1640. Antistoffene benyttet for Western-blotting var som følger: kanin-anti-kaspase-3, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p53, anti-cyclinA, anti-cyclinB1, anti-cyclinD1, anti-MMP2 , anti-MMP9, anti-ZFX og mus anti-β-aktin. Alle antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology.
Den molekylære formel baicalein er C15H10O5and sin molekylvekt er 270,24.
3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl ) -2, ble fem difenyl tetrazolium (MTT) analyse
Drug følsomhet bestemmes ved hjelp av MTT analysen. I korthet ble cellene trypsinert og sådd ut i 96-brønners plater (Corning, USA) ved en tetthet på 5 x 10
3-celler per brønn. Cellene ble dyrket over natten og deretter etterfylt med friskt medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner (0, 15, 30, 60, 120, og 240 pmol /L) av baicalein for 24, 48 og 72 timer. Deretter ble 20 ul av MTT (Sigma-Aldrich) oppløst i PBS ved 5 mg /ml ble tilsatt direkte til alle brønnene, og platene ble inkubert i 4 timer ved 37 ° C. De formazankrystaller som dannet seg, ble oppløst i 100 ul DMSO etter fjerning av supernatanten. Den optiske tetthet ble målt ved 490 nm på en mikroplateleser (Bio-Tek, USA). Resultatene representerer gjennomsnittet av 3 uavhengige eksperimenter utført over flere dager. Prosentandelen av cellelevedyktighet ble beregnet som følger:
kolonidannende analyse
Celler i den logaritmiske vekstfase ble spaltet inn i en enkeltcellesuspensjon med en trypsin-EDTA (Gibco, USA) oppløsningen , og deretter 2 ml av cellesuspensjonen ble sådd ut på 6-brønners plater (Corning, USA) ved en tetthet på 200 celler /ml. Etter tilslutning ble cellene behandlet med baicalein (0,6,12, og 24μmol /L) i 48 timer og deretter dyrket i 15 dager. Deretter ble cellene fiksert med 10% formalin og farget med 0,1% krystallfiolett (Sigma-Aldrich). Etter vasking ble platene lufttørket, og digitale bilder ble tatt av farget enkle kloner observert under et mikroskop (Leica, Tyskland). Resultatene representerer gjennomsnittet av 3 uavhengige eksperimenter gjort over flere dager.
Cell syklus analyse
Celler ble behandlet med baicalein (0,30,60 og 120μmol /L) i 48 timer. Deretter ble cellene samlet og fiksert med kald 70% etanol og lagret ved -20 ° C. Cellene ble deretter vasket og resuspendert i kald PBS og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter med 10 mg /ml RNase og 1 mg /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich). DNA-innhold analyse ble utført ved strømningscytometri (BD, San Diego, USA). Prosentandelen av celler i de ulike cellesyklusfaser ble bestemt ved bruk av Cell quest oppkjøpet programvare (BD Biosciences).
Flowcytometri analyse av celle apoptose
annexin V /propidiumjodid- Analysen ble utført henhold til produsentens anbefaling (Invitrogen, USA). I korthet ble cellene sådd ut i 6-brønners plater (Corning, USA) og inkubert i 48 timer med baicalein (0,30,60, og 120μmol /l). I korte trekk ble cellene oppsamlet og deretter vasket med kald PBS, sentrifugert, resuspendert i 100 ul av bindingsbuffer inneholdende 2.5ul FITCconjugatedannexin-V og 1UL 100 ug /ml PI og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Totalt minst 10 000 hendelser ble samlet og analysert ved flowcytometri (BD, San Diego, USA).
Påvisning av morfologiske apoptose med Hoechst 33342 flekker
Etter behandling med baicalein (0 , 30,60, og 120μmol /l) i 48 timer ble GBC-SD-celler vasket med PBS og fiksert med metanol: eddiksyre (3: 1) i 15 min ved romtemperatur. Fikserte celler ble vasket med PBS og farget med 5 ug /ml av Hoechst 33342 flekk i 10 min. Endringer i kjernen av celler etter farving med Hoechst 33342 ble observert ved bruk av et fluorescens mikroskop (Leica, Tyskland).
Cell migrering og invasjon
GBC-SD3 x 10
4-celler og SGC996 1 x 10
5-celler ble plassert på det ikke-belagte membran i det øvre kammer (Corning, USA). Celler ble sådd ut i medium uten serum. Medium inneholdende 10% FBS ble plassert i det nedre kammer for å virke som et kjemotiltrekkende. Etter tilslutning, ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Baicalein (0, 7,5, 15, 30, 60 umol /L) i serumfritt medium. Cellene ble inkubert i 24 timer; celler som ikke invadere gjennom porene ble fjernet ved hjelp av en bomullspinne. Celler migrerer gjennom 8,0 um polykarbonatmembraner til den nedre overflate ble fiksert med 10% metanol og farget med 0,1% krystallfiolett. Migrerende celler ble kvantifisert ved telling av fargede celler under et mikroskop (x 200) i fem tilfeldig felt for hver brønn. Hvert forsøk ble utført in triplo. Invasjons analyser ble utført på en lignende måte som migrerings analysene, bortsett fra at innskudd ble forbelagt med Matrigel (BD, USA).
In vitro sårheling assay
GBC-SD-celler ble dyrket i 6-brønns plater ved en tetthet på 1,5 x 10
5 /ml og dyrket til konfluens. Såret ble opprettet ved å skrape konfluent cellemono med en pipette tips. Celler ble grundig skyllet med medium for å fjerne celleavfall før behandling med forskjellige konsentrasjoner (0, 7,5, 15, og 30μmol /L) av baicalein i FBS belastede tilstand. Cellene ble tillatt å migrere til 24 timer og bilder av de migrerte celler ble tatt ved bruk av invertert mikroskop (Leica, Tyskland).
Revers transkripsjon og kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (qPCR)
Kvantitativ PCR ble anvendt for å kvantifisere ekspresjon av mRNA i de eksperimentelle gruppene. I korthet GBC-celler ble behandlet med baicalein (15, 30, 60 og 120 pmol /L) i 48 timer. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av RNA lett settet (Invitrogen, USA). Førstetråds-cDNA ble syntetisert fra 500 ng total-RNA ved anvendelse av en PrimeScript revers transkriptase (Takara, Japan). Kvantitativ real-time PCR ble utført i et reaksjonsvolum på 20 ul med 2 ul cDNA. Primersekvensene var som følger: MMP9 (forover-5′-TGT ACC GCT ATG GTT ACA CTC G-3 «, reverse-5′-GGC AGG GAC AGT TGC TTC T-3′), MMP2 (forover-5» AAC TAC GAT GAT GAC CGC AAG «; reverse-5′-GAC AGA CGG AAG TTC TTG GTG -3), ZFX (forover-5′-TGT GGA GTG TGG TAA GGG TTT T»; reverse-5′-ACT GGT GTG TTT TGC TTT CTT G -3), og GAPDH (forover-5′-AAG CTC ATT TCC TGG TAT GACA-3 «, reverse-5′-TCT TAC TCC TTG GAG GCC ATGT-3»). PCR-betingelsene var som følger: 95 ° C i 30 sekunder etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 34 sek. Glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en intern referanse-gen for å normalisere ekspresjon av apoptotiske gener. Relativ kvantifisering av apoptose-relaterte gener ble analysert ved den komparative terskelsyklusen (Ct) -metoden. For hver prøve ble den Ct-verdien av den apoptotiske genet normalisert ved hjelp av formelen: ΔCt = Ct (apoptotiske gener) – Ct (GAPDH). For å bestemme relative uttrykk nivåer, ble følgende formel benyttet: ΔΔCt = ΔCt (behandlet) – ΔCt (kontroll). Verdien som ble brukt til å plotte ekspresjon av apoptotiske gener ved hjelp av formelen 2-ΔΔCt.
Western blot-analyse
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av baicalein (0, 15, 30, 60 og 120 umol /l) i 48 timer og deretter lysert i en prøvebuffer, etterfulgt av denaturering. Den totale proteinkonsentrasjon av celleekstrakter ble bestemt ved å bruke bicinchoninic syre analysesystemet (Beyotime, Kina) med BSA som en standard. Like mengder (80 ug protein per bane) av de totale proteinene ble separert ved SDS-PAGE (8%, 12% geler) under reduserende betingelser. Proteinene ble deretter overført elektroforetisk til nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert med 5% skummet melk og inkubert withanti-caspase-3, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p53, anti-cyclinA, anti-cyclinB1, anti-cyclinD1, anti- MMP2, MMP9 anti-, anti-ZFX antistoffer, henholdsvis (1: 1000; Cell Signaling Technology) ved 4 ° C over natten. Dette ble etterfulgt av en inkubering med geite-anti-kanin /anti-muse-sekundært antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (1: 5000; Abcam). En lik mengde av hver bane ble evaluert ved immunoblotting de samme membraner med p-aktin-antistoffer etter løsgjøring av tidligere primære antistoffer. Bildene ble tatt, og de optiske tettheten av båndene ble skannet og kvantifisert med Gel Doc 2000 (BioRad, USA).
In vivo tumor xenograft studie
Seks uker gammel mannlig atymiske nakne mus (med en innledende kroppsvekt på 20-22 g) ble oppnådd fra Shanghai SLAC Forsøksdyr Co., Ltd (Shanghai, Kina) og holdt under patogen-frie forhold med kontrollert temperatur (22 ° C), fuktighet, og en 12 timers lys /mørke syklus. Mat og vann ble gitt ad libitum gjennom hele eksperimentet. SGC996 celler ble anvendt for tumor-xenografter og dyrket i kultur og deretter avspaltes ved trypsinering, vasket og resuspendert i serumfritt RPMI 1640. Hver av de atymiske nakne mus ble injisert subkutant med 1 x 10
6 av celler ina volum av 100 ul i den høyre flanken til å initiere tumorvekst. Etter SGC996 inokulasjon, ble musene randomisert til to grupper (5 mus /gruppe). En gruppe ble behandlet med bærer (10% DMSO og 90% propylenglykol) intraperitonealt, og den andre gruppen received0.4mg /mus baicalein intraperitonealt til 9 ganger. På den 21. dag ble dyrene avlivet, og tumoren vev ble fjernet og veid.
Statistisk analyse
Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD og de ble analysert ved hjelp av Student «s
t
-test i SPSS versjon 13.0 programvare. En
p
-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Effekt av baicalein på levedyktighet og apoptose av galleblæren carcinoma celler in vitro og in vivo
virkningene av baicalein på veksten av humane GBC-SD og SGC996, to mest brukte cellelinjer galleblærekreft,
in vitro
ble testet. Som vist på fig. 2 (A), etter behandling i 24, 48 og 72 timer, baicalein induserte en dose- og tidsavhengig reduksjon i levedyktigheten til både GBC-SD og SGC996 celler, som analysert ved hjelp av MTT-analysen. Som vist på fig. 2 (B) og amp, (C), evne til GBC-SD og SGC996 celler til å danne kolonier i nærvær av baicalein ble påvist med den flate platen kolonidannelse assay. Den kimtall indikerte at baicalein hadde forårsaket en nedgang doseavhengig i kolonidannelse evne. Funnene støtter det faktum at baicalein kan utøve en betydelig innflytelse på GBC-SD og SGC996 celler spredning. For ytterligere å bekrefte effekten av baicalein
in vivo
, testet vi tumorigenitet av galleblæren carcinoma celler ved hjelp av nakne mus tumor xenograft studien. Som vist på fig. 2 (D), tumorstørrelsen i gruppen av baicalein behandling var mindre enn den for kontrollgruppen.
(A) GBC-SD og SGC996 celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av baicalein, og det var celleproliferasjon bestemt ved MTT-analyse på dagene 1, 2 og 3. Hver verdi representerer gjennomsnittet ± SD (n = 3). (B og C) Baicalein trykt koloni dannelsen av GBC-SD og SGC996 celler. Celler ble behandlet med baicalein (6, 12, og 24 umol /l) og ble tillatt å danne kolonier i friskt medium i 14 dager. Påvirkningen av kolonier (gjennomsnitt ± SD, n = 3) i kolonidannelse er vist. (D) Baicalein behandlet xenografttumorer var mye mindre enn kontroll svulster. (E) Vekten av tumorene viste at xenograft tumorvekst i nakne mus var signifikant lavere i baicalein-behandlede nakne tumorer enn kontrolltumorer. Resultatene som er vist er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0.01, *** P 0,001.
For å vurdere om baicalein påvirker cellesyklusprogresjon, flowcytometrisk analyse ble utført. Resultatene viste en signifikant reduksjon i antall celler i den proliferative G0 /G1 fase og en betydelig økning i antallet av celler i S-fasen, etter 48 timers behandling med baicalein (Fig. 3 (A)). CyclinA, en G1 /S overgang opprykk protein, ble doseavhengig økt med baicalein behandling. Det kan være årsaken til S-fasen arrest indusert av baicalein. CyclinB1 og cyclinD1 som representerer S /G2 og M /G1 overgangsprosessen henholdsvis, ble doseavhengig redusert ved baicalein behandling (Fig. 3 (B) og S5 fig.). Disse resultatene indikerer at baicalein arrestert cellesyklusen i S-fasen.
(A) Celler ble behandlet med 30, 60 eller 120 pmol /L baicalein i 48 timer, og DNA-innhold ble analysert ved flow-cytometri. Prosentandelen av celler i G1, S og G2 /M-fasene av cellesyklusen er vist. Disse resultatene var fra en representativt eksperiment av 3 uavhengige forsøk. (B) Uttrykk for cyclin B og cyclin D i GBC-SD celler og cyclin A og cyclin D i SGC996 celler ble vesentlig endret etter behandling med baicalein sammenlignet med kontroll. Resultatene som er vist er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0.01, *** P 0,001.
For ytterligere å bekrefte disse resultatene, vi evaluert effekten av baicalein på apoptose i GBC-SD og SGC996 celler ved hjelp annexin V-FITC og propidiumjodidfarging. Som bestemt ved flow-cytometri og vist i fig. 4 (B), en markert doseavhengig økning i både tidlige og sene stadier av apoptose var opplagt i GBC-SD og SGC996 celler etter baicalein behandling sammenlignet med kontrollceller.
(A) apoptotiske morfologiske endringer som som unormal kjernemorfologi, reduksjon i celletallet med apoptotisk legeme dannelse, og celle krymping, indusert av baicalein (30,60 og 120 pmol /L) behandling i 48 timer ble det observert av Hoechst 33342 farging i GBC-SD og SGC996 cellelinjer . (B) Celler ble inkubert med baicalein (30,60 og 120 pmol /L) i 48 timer, etterfulgt av farging med annexin-V /PI. Celle apoptose ble bestemt ved flowcytometri. (C) Baicalein induserer aktivering av apoptose-relaterte proteiner GBC-SD og SGC996 celler. Etter behandling med baicalein (0, 15, 30, 60, og 120μmol /L) i 48 timer, ble cellelysater fremstilt, og ble utført western blot analyse mot Bcl-2, Bax, pro-kaspase-3, P53 og PARP. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Resultatene som er vist er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0.01, *** P 0.001.
Morfologiske forandringer i apoptotiske celler ble åpenbart av Hoechst 33342 flekker, som vist i fig. 4 (A). I den ubehandlede GBC-SD og SGC996 celler, ble kjernene farget svak homogen blå, mens i gruppen behandlet med baicalein, lyse kromatin kondens og kjernekraft fragmentering ble observert.
Effekt av baicalein på apoptose relaterte faktorer
for å identifisere hvilke proteiner var hovedsakelig involvert i baicalein-indusert apoptotiske prosessen, analyserte vi en rekke apoptose relaterte faktorer ved western blot. Som illustrert i fig. 4 (C), pro-kaspase-3 og P53 ble nedregulert ved baicalein behandling. Spaltes PARP ble betydelig økt. Protein nivået av Bax var oppregulert, mens proteinnivået av BCL-2 var betydelig redusert.
Effekt av baicalein på metastasering av galleblæren carcinoma celler
Siden galleblærekreft celle migrasjon og invasjon er forbundet med metastase, anvendte vi en rekke cellulære forsøk for å vurdere effekten av baicalein på metastatisk potensial av galleblæren karsinomceller. For å undersøke effekten av baicalein på kreftcelle mobilitet, utførte vi migrasjon analysen bruker GBC-SD og SGC996 celler. Som vist på fig. 5 (A), cellulær migrasjon ble inhibert med baicalein behandling. Videre utførte vi sårheling analyse for å ytterligere bekrefte hemming effekten av baicalein på celle migrasjon. Som vist på fig. 5 (C), baicalein tydelig hemmet GBC-SD celle migrasjon i en doseavhengig måte. For ytterligere å undersøke hvorvidt invasiv aktivitet ble berørt i respons til baicalein, undersøkte vi invasiv aktivitet ved hjelp av en matrigel belagt membran. Resultatene viste at baicalein dramatisk redusert antall invaderte celler, og denne inhibering forekom på en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 5 (B)). Videre er sprednings og metastase egenskaper ble ytterligere forsterkes i celler behandlet med både siRNA mot ZFX og baicalein (S4 fig.).
Celler ble behandlet med 7,5, 15, 30 og 60μmol /l baicalein i 12 timer før til migrasjon (A) eller invasjon analysen (B). (C) cellemonolagene ble såret ved å skrape med en 200 ul pipettespiss. Okkupasjonen området GBC-SD celle enkeltlag behandlet med baicalein var doseavhengig redusert 24 timer etter scratch. Baicalein påvirker ekspresjonen av matriks-metallopeptidases (MMP). (D) Et mRNA ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 ble påvist ved qPCR etter behandling med baicalein i 48 timer. (E) Proteinet ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 ble påvist ved western blot etter behandling med baicalein i 48 timer. Resultatene som er vist er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0.01, *** P 0,001.
MMP er kjent for å være avgjørende for nedverdigende ekstracellulære matrise komponenter og for å fremme tumorcelle invasjon
in vitro Hotell og
in vivo
. Etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av baicalein i 48 timer i GBC-SD og SGC996 celler, kvantitativ real-time PCR og western blot-analyse viste at mRNA og protein ekspresjon av MMP-9 og MMP-2 signifikant redusert sammenlignet med kontrollgruppen i en doseavhengig måte (figur 5 (D . E)).
Baicalein nedregulert sink finger X-kromosom (ZFX) protein og mRNA uttrykk i GBC-SD og SGC996 celler
Vår tidligere studie fant at knock-down av ZFX kunne hemme GBC-SD celleproliferasjon og migrasjon. Så vi er spent på om effekten av baicalein på galleblæren carcinoma celler er koblet til ZFX uttrykk. Western blot og kvantitativ real-time PCR-analyse viste at protein og mRNA-ekspresjon av ZFX var doseavhengig måte (figur 6 (A og. B)) ble redusert med baicalein behandling i GBC-SD og SGC996 celler og translokasjon av ZFX til atomkjerner ble undertrykket ved baicalein behandling (S2 fig.). Effekten av baicalein på ZFX ekspresjon ble bestemt fordi ekspresjonsnivået av NF-kB og STAT3 ikke ble påvirket av dette molekylet (S1 fig.).
(A og B) ZFX ekspresjon i GBC-SD og SGC996 celler indusert av baicalein. Celler ble behandlet med 0, 15, 30, 60 og 120 pmol /L baicalein i 48 timer, deretter protein og mRNA ekspresjonsnivå av ZFX ble bestemt ved Western blot (A) og qPCR (B). (C og D) Celler ble transfektert med ZFX-GFP plasmid og GFP plasmid, respektivt. 72 timer etter transfeksjon, ble cellene behandlet med 0, 7,5, 15, 30 og 60 pmol /L baicalein i 72 timer. ZFX-GFP vesentlig blokkert inhibering av proliferasjon av GBC-SD-celler ved baicalein ved hjelp av MTT-analyse (C). ZFX-GFP vesentlig blokkert induksjon av apoptose av GBC-SD-celler ved baicalein estimert ved flowcytometri (D). (E og F) 72 timer etter transfeksjon, ble cellene behandlet med 60 umol /L baicalein i 24 timer. ZFX-GFP blokkerte anti-migrasjon og invasjon effekten av GBC-SD celler ved baicalein betydelig. Den cellemigrering ble estimert ved sårheling assay (E) og celle invasjon ble estimert ved transwell-analyse (F). (G) ZFX-GFP hindret ekspresjonen av PARP, hemming av MMP2, MMP9 og oppregulert forholdet BCL2 /Bax som respons på baicalein. 72 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 60 umol /L baicalein for 48h.The proteinnivåer av PARP, MMP-2, MMP-9, BCL2, Bax og ZFX ble bestemt ved Western blot. Resultatene som er vist er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0.01, *** P 0,001.
Overuttrykte av ZFX lettet levedyktighet, apoptose og metastase effekten av baicalein i GBC-SD celler
Videre overekspresjon av ZFX (S3 fig.) Resulterte i delvis blokkering av baicalein indusert proliferasjon og apoptose i GBC-SD-celler (figur 6 (C) og amp;. (d)). Følgelig inhibering av migrering (fig. 6E) og invasjon (fig. 6F) evnene til cellene ved baicalein ble bemerkelsesverdig reversert ved overekspresjon av ZFX. På den annen side, overekspresjon av ZFX sterkt hemmet baicalein indusert aktivering av PARP og øket den forholdet mellom BCL2 /Bax. Videre er overekspresjon av ZFX også resulterte i blokkering av baicalein indusert inhibering av MMP-2 og MMP-9 (fig. 6 (G)). Dermed dataene antydet at ZFX protein kan delta i baicalein-indusert celle apoptose og anti-metastaser i galleblæren carcinoma celler.
Diskusjoner
Vår studie gir noen nye opplysninger om baicalein brukt i anti-kreftterapi. Den anti-kreft effekt av baicalein har blitt bekreftet i mange andre kreftformer, men anti-spredning og metastatisk effekt og den tilhørende mekanismen (e) i GBC celler er ikke klart. Her har vi vist de biokjemiske og molekylære mekanismer av apoptose og anti-metastatisk induksjon av baicalein.
For det første har vi funnet at baicalein kan spille en viktig rolle i GBC celleproliferasjon, cellesyklus og apoptose
i vitro Hotell og
in vivo
. Behandling med baicalein resulterte i en markert nedgang i levedyktigheten av dyrkede GBC-SD og SGC996 celler og i antall kolonier som disse cellene dannet. Så vidt vi vet, er dette den første studien for å evaluere potensielle rolle baicalein på
in vivo
xenograft dyremodell. Betydelig reduksjon av tumormassen ble observert etter en tre-ukers behandling.
in vivo
effekten av baicalein på GBC svulster støtter sterkt baicalein som et mulig nytt legemiddel for anti-GBC behandling.
Effekten av baicalein på cellesyklus arrest og induksjon av apoptose i GBC cellene ble også evaluert. Den anti-tumor effekten av baicalein var antas å bli brukt ved å påvirke arrest i cellesyklus, eller ved å interagere med cellesyklusrelaterte proteiner [31]. I vår studie, baicalein også induserte S-fasen cellesyklus arrest og hemming av cyclin B1, cyclin D1, markedsføring av cyclin A i GBC-SD og SGC996 celler. Siden apoptose er ansett som en viktig mekanisme ved inhibering av kreft, utførte vi hoechst33342 fargingsanalyse, annexin V /PI analyse og påvisning av apoptose relatert protein uttrykk for ytterligere å utforske mekanismen for baicalein-indusert apoptose. Baicalein bemerkelsesverdig induserte apoptose av både GBC-SD og SGC996 celler, som demonstrert ved forandringer i atom morfologi, en økning i prosentandelen av Annexin V-flekker celler, noe som ble ytterligere bekreftet ved forsterket ekspresjon av spalting av pro-kaspase-3, spalting av PARP, Bax og redusert ekspresjon av Bcl-2 og P53. Mange av disse genene er relatert til den mitokondrielle apoptotiske reaksjonsvei. Spalting av pro-kaspase-3, spalting av PARP og til slutt nedbrytning av DNA. Bax og Bcl-2-protein som regulerer vesentlig endring i mitokondriemembranen permeabilitet for apoptose [32]. Fra disse dataene, kan det konkluderes med at baicalein indusert GBC celle apoptose ved å aktivere den indre mitokondrielle veien.
I tillegg celleproliferasjon, migrasjon og invasiv antall celler er også to av de viktigste funksjonene i ondartet celle atferd. For å belyse virkningen av baicalein på celle motilitet, ble cellemigrering og invasivitet bestemt ved en sårtilheling migrasjonsanalyse og transwell assay, respektivt. Fra disse dataene, fant vi at baicalein kunne undertrykke migrasjon og invasjon evnen til GBC-SD og SGC996 celler. MMP er en svært regulert super av sink avhengig endopeptidaser som er årsaksmessig forbundet med utvikling og progresjon av svulster [33].
