Abstract
Oral plateepitelkarsinom (OSCC) pasienter diagnostisert i sene stadier har begrenset kjemoterapeutiske alternativer som understreker det store behovet for utvikling av nye legemidler mot kreft for mer effektiv sykdom ledelse. Vi forsøkte å undersøke anticancerpotensialet av Apaziquone, [EOquin, USAN, E09, 3-hydroksy-5- aziridinyl-1-metyl-2 (1H-indol-4,7-dion) -prop-β-en-α- ol], et pro-medikament som tilhører en klasse av anti-cancer midler som kalles bioreductive alkyleringsmidler, for OSCC. Apaziquone behandling hemmet celledeling og apoptose i OSCC celler
in vitro
. Apaziquone behandlet OSCC cellene viste økt aktivering av caspase 9 og caspase 3, og Poly (ADP ribose) polymerase (PARP) spalting tyder induksjon av apoptose ved apaziquone i orale kreftceller. Viktigere, apaziquone behandling betydelig redusert oral svulst xenograft volum i immunsupprimerte NOD /SCID /CRL mus uten å forårsake åpenbar toksisitet til normalt vev. Konklusjonen vår
in vitro Hotell og
in vivo
studier identifisert og demonstrert pre-kliniske effekten av Apaziquone, som en potensiell ny anti-kreft terapeutisk kandidat for kreft i munnhulen ledelse.
Citation: Srivastava G, Somasundaram RT, Walfish PG, Ralhan R (2015) Anticancer aktivitet av Apaziquone i Oral kreft celler og Xenotransplantat Modell: Konsekvenser for Oral Cancer Therapy. PLoS ONE 10 (7): e0133735. doi: 10,1371 /journal.pone.0133735
Redaktør: Pei-Yi Chu, School of Medicine, Fu Jen katolske universitetet, TAIWAN
mottatt: 6 februar 2015; Godkjent: 30 juni 2015; Publisert: 24.07.2015
Copyright: © 2015 Srivastava et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. den økonomiske støtten til dette arbeidet ble gitt av Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, California). De bevilgende myndighet godkjent studiedesign, men hadde ingen rolle i datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Forfatterne ønsker å takke for den kanadiske Institutes of Health Research for Chair i Advanced Cancer Diagnostics (RR), og Alex og Simona Shnaider Chair i skjoldbruskkjertelen (PGW)
Konkurrerende interesser. PGW og RR er aksjonærer i Proteocyte Diagnostics Inc. i tillegg økonomisk støtte til dette arbeidet ble gitt av Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, California). Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Oral plateepitelkarsinom (OSCC) utgjør en stor andel av hode og nakke kreft regnskap for anslagsvis 263,000 nye tilfeller og ca 127 000 dødsfall på verdensbasis hvert år [1]. Tidlig stadium (I og II) OSCC pasienter behandles med kirurgi og /eller strålebehandling, og har fem års overlevelse på 70% – 90% [2-4]. Men to tredjedeler av OSCC pasienter lider av lokoregionalt avansert sykdom (trinn III og IV) ved diagnosetidspunktet. Det foreligger utilstrekkelig data fra randomiserte kliniske studier for å definere en optimal strategi for pasienter med etapper III og IV OSCC. Pasienter med avansert eller residiverende sykdom har begrenset behandlingstilbud og en dårlig prognose (5-års overlevelse 50%) [5]. Primær kirurgi og definitive strålebehandling finnes alternativer for OSCC pasienter; både kirurgi og strålebehandling kan ha en dyp effekt på livskvaliteten til overlevende [6, 7].
I de siste årene, bruk av samtidige chemo-stråling har dukket opp som et attraktivt alternativ til tradisjonell kirurgisk behandling av avansert OSCC [8-10]. Det er verdt å merke at kjemoterapi har utviklet seg fra lindrende behandling til en sentral del av kurativ behandling for lokalt avansert OSCC. Cisplatin, carboplatin, methotrexate og taxaner er aktive som enkle midler eller i kombinasjon ved residiverende eller metastatisk OSCC [3, 11-14]. Men dosebegrensende toksisitet hos kreftpasienter begrense deres kliniske verktøyet. I dag er det ingen standard andrelinje kjemoterapi for behandling av residiverende eller metastatisk OSCCs. Monotargeted behandlinger, for eksempel hemmere av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3), nukleær faktor kappa B (NFkB), og mammalian target of rapamycin (mTOR) har vist begrenset effekt [15-18 ]. Dermed eksisterer det et stort behov for utvikling av nye legemidler for kreft i munnhulen. Imidlertid oppdagelsen av nye forbindelser med potent anticanceraktivitet er en lang og kostbar prosess. En alternativ tilnærming er utnyttelse av allerede etablerte legemidler som er godkjent for klinisk bruk for andre kreftformer.
Apaziquone [EOquin, USAN, E09, 3-hydroxy-5- AZIRIDINYL-1-metyl-2 (1H -indol-4,7-dion) -prop- β-en-α-ol] er et pro-medikament som tilhører en klasse av anti-kreft-midler som kalles bioreductive alkylaing midler som har gjennomgått en omfattende klinisk evaluering for behandling av blærekreft [19] . Apaziquone aktiveres av flere enzymer, det mest undersøkte enzym som NAD (P) H: quinon oksidoreduktase 1 (NQO1) eller DT-diaforase, noe som reduserer apaziquone inn i en DNA-alkyleringsmiddel [19]. Her i vi undersøkt muligheten anti-tumor aktivitet av Apaziquone i
in vitro Hotell og
in vivo
modeller av kreft i munnhulen.
Materialer og metoder
cellelinjer og cellekulturer
Oral plateepitelkarsinom cellelinje AMOS III, har blitt etablert fra betel og tobakk forbundet menneskelig OSCC av vårt laboratorium [20]. AMOS III ble brukt som en
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimentell modell for kreft i munnhulen i denne studien. Andre etablert OSCC cellelinje, SCC4, har vært anvendt for å evaluere den bredere anvendbarhet av apaziquone for potensiell oral cancer terapi av OSCC. Ikke-metastatisk kreft i munnhulen cellelinje, SCC4, ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC). Orale kreftceller (AMOS III /SCC4) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 mmol /l L-glutamin og penicillin-streptomycin (1X) i en fuktet inkubator (5 % karbondioksyd, 95% luft) ved 37 ° C som beskrevet tidligere [20-22]. Begge cellelinjene har blitt testet ved hjelp av korte tandem repeat polymorfisme analyse og blir rutinemessig dyrket i vårt laboratorium.
In vitro Celleproliferering /cytotoksisitet analysen (MTT assay)
Evnen apaziquone til induserer cytotoksiske virkninger ble bestemt ved omdannelse av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) til formazan av mitokondrielle dehydrogenaser. Orale kreftceller (AMOS III og SCC4) ble sådd i tre paralleller i 96-brønns plater i fullstendig medium. Cellene ble dyrket til å over over natten og deretter eksponert for varierende konsentrasjoner av apaziquone [5 nM til 100 uM] i 24 til 96 t for å bestemme dose- og tidsavhengig inhibering av celleproliferasjon. Celleproliferasjon ble målt ved tilsetning av MTT til cellene. I korthet MTT ble oppløst i sterilt PBS og tilsatt til brønnene i en sluttkonsentrasjon på 1,5 mM. Celler blir inkubert med MTT i 4 timer, media ble fjernet, og de gjenværende formazankrystaller ble oppløst i DMSO. Absorbansen av solubilisert formazan ble målt ved 540 nm ved anvendelse av en multi-brønn-skanning spektrofotometer. Den prosentvise inhibering av cellevekst ble beregnet ved hvert tidspunkt og dose som følger: (A
kontroll – A
behandlet /A
kontroll) x 100.
In vitro LD
50 målinger for apaziquone
for å bestemme styrken av apaziquone å forårsake celledød av muntlige kreftceller, sin LD
50 ble bestemt ved bruk av muntlige kreftceller AMOS III og SCC4 celler. For å bestemme konsentrasjonen av apaziquone kreves for å drepe 50% av cellene (LD
50), ble 5000 celler av hver cellelinje sådd ut i triplikat i null fluorescens vevskultur behandlede 96-brønners plater (BD Biosciences, Mississuaga, ON, Canada ). Etter inkubering over natten, ble mediet erstattet med medium inneholdende apaziquone i et konsentrasjonsområde 5nM to100μM. Etter 48 timer ble Alamar blå analyse utført for å bestemme celleviabilitet.
apoptose analysen
For å kontrollere resultatene av celle levedyktighet analyser, Annexin V og propidiumjodid (PI) dobbel farging var brukes til å kvantifisere apoptose. AMOS III celler ble enten behandlet med bærer alene eller apaziquone ved 500 nm i 48 timer. Celler ble merket med Annexin V-FITC konjugat og PI bruker Annexin V testsettet følge produsentens instruksjoner (Sigma, St. Louis, MO) og analysert ved hjelp av BD Cell quest Pro-programvaren. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av Western blot analyse for bestemte caspases og Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) assay.
Cell syklus analyse ved hjelp av flowcytometri
Den kultiverte media fra ubehandlet, kjøretøy kontroll og behandlede apaziquone AMOS III celler ble oppsamlet og sentrifugert for å samle ikke-adherente celler. Adherente celler ble vasket med PBS (pH 7,4) og trypsinisert. Både ikke-adherente og adherente cellepopulasjoner ble oppsamlet for videre analyse. Celler ble fiksert i 70% etanol (-20 ° C, over natten), og ble resuspendert i buffer inneholdende PBS (pH 7,4), EDTA (0,5 mol /l, pH 8,0), Triton X-100 (0,05%), RNase A ( 50 mg /ml), og PI (100 mikrogram /ml) før flowcytometrisk analyse.
TUNEL analysen
TUNEL analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Apaziquone-behandlede og kontroll over kjøretøyet AMOS III celler ble oppsamlet som beskrevet ovenfor. Merking og analysen ble utført etter produsentens anvisninger, og resultatene ble analysert videre med konfokal laser scan mikroskopi.
In vivo
antitumor aktivitet av Apaziquone i xenograft modell for menneskelig muntlig plateepitelkarsinom
Dette
in vivo
studie ble godkjent av dyreetikk komité Mount Sinai Hospital før oppstart og dyr omsorg ble gjort i henhold til Toronto Centre of Phenogenomics (TCP) retningslinjer for å vurdere den dyrenes velferd og redusere nød. En preklinisk studie ble utført for å sammenligne effekten av varierende konsentrasjoner av apaziquone og bærerkontrollen i en dyremodell for human oral SCC. Den mest effektive forhåndsbestemt konsentrasjon /dose apaziquone ble tatt frem for
in vivo
testing i xenograft mus modeller av kreft i munnhulen. To måneder gamle mannlige immunsvekkede NOD /SCID /CRL # 394 mus var subkutant (sc) implantert med 1 x 10
6 kreftceller i serumfritt medium i flanken regionen for å etablere svulster, i samsvar med institusjonelle dyre retningslinjer vesenet . Når tumorene nådde en størrelse på omtrent 100-200 mm
3, ble musene tilfeldig delt inn i grupper (n = 6 /gruppe) i henhold til tumorvolumer og kroppsvekter for følgende behandlinger: den ubehandlede bærerkontrollen (0,1% DMSO n = 6) og apaziquone behandlet arm av studien (n = 6). I apaziquone arm av studien, mus som bærer tumorene fikk intraperitoneale instillasjoner av apaziquone ved 0,1 mg /kg kroppsvekt eller bærerkontroll ved 0,1% DMSO 8 uker etter tumorimplanteringen. Den medikamentbehandling ble fortsatt i 6 uker. Tumor forekomst, tumor volum, vekt og generelle og median overlevelse av dyr ble registrert. Musene ble overvåket to ganger i uken for tegn og symptomer. Ved avslutningen av studien, ble blod samlet fra saphenavene av mus for en komplett blodprosent analyse og organfunksjon test før anestesi. Mus ble deretter avlivet ved cervikal dislokasjon, eller tidligere hvis tumorer oversteget 20% kroppsmasse og /eller dersom musene viser noen kliniske tegn på blekhet, krum, dyspné og unormal bevegelse. Etter euthanization ble organer fjernet og umiddelbart fiksert i formalin. Tumorvolumet ble målt. Svulster ble deretter høstet og en anterior-posterior midtlinjen ansikt snitt stykke av tumoren ble fiksert i formalin. Svulsten periferi og sentrum var terninger og flash frosset i flytende nitrogen i separate hetteglass. Ki67 immunhistokjemi (IHC) ble utført ved anvendelse av FFPE vevssnitt (4 um tykkelse) av svulster fra apaziquone behandlede og bærerkontrollgruppen muse xenografter ved å følge prosedyren som beskrevet av oss tidligere [23]. Glassene ble inkubert med anti-Ki67-antistoff i en fortynning på 1: 100 (Abcam, Cedarlane Labs, Burlington, ON, Canada) i 1 time og kanin sekundært antistoff i 20 min, etterfulgt av Vectastain Elite ABC reagens (Vector Labs, Burlingame, CA) ved hjelp av diaminobenzidin som kromogen. I den negative kontroll vevssnitt, ble det primære antistoff erstattet av isotype-spesifikke ikke-immun mus /kanin IgG. Seksjonene ble evaluert ved mikroskopisk undersøkelse lys. Hemotoxylin Eosin (H 0,001, sammen tosidige t-test mellom de behandlede og ubehandlede grupper; Fig 5B og 5C).
(A) Ingen vesentlig endring i kroppsvekt ble observert hos apaziquone behandlede mus eller kjøretøyet kontrollmusene i løpet av behandlingen. (B) Virkning av apaziquone behandling på tumorstørrelse hos mus. Representative skåret tumorer som viser forskjellen i størrelse av tumorer mellom apaziquone behandlet og ubehandlet kontrollgruppe mus. (C) Virkning av Apaziquone behandling på tumorvekstforsinkelse. Tumorxenotransplantater utviklet i flankene av NOD /SCID /CRL mus ble administrert med apaziquone (0,1 mg /kg kroppsvekt) intraperitoneale injeksjoner ukentlig i 6 uker. Apaziquone behandling forsinket tumorvekst signifikant (p-verdi 0,001, sammenkoblet to-halet t-test) i de legemiddelbehandlede gruppe mus sammenlignet med mus i de ubehandlede kontroll eller bærerkontrollgrupper. (D) Virkning av behandling på Apaziquone nyre og lever i mus. Histologi av lever og nyre vev oppnådd ved avslutningen av
in vivo
studien. Vevssnitt ble farget med hematoxylin og eosin (H E). i: Seksjon av leveren etter behandlingen med bærerkontrollen. ii: Seksjon for leveren etter behandlingen med apaziquone. iii: Seksjon for nyrene etter behandlingen med kjøretøykontroll. iv: Seksjon for nyre etter behandlingen med apaziquone. Ingen oncocytic nekrose eller fibrose ble observert i både nyre og lever etter behandlingen med apaziquone. v: IHC farging for Ki67 av ubehandlet kontroll oral svulst xenograft vev seksjon som viser høy atom Ki67 farging og vi: apaziquone behandlet xenograft viser markert redusert Ki67 flekker i apaziquone behandlet xenograft tumor vev seksjon (opprinnelig forstørrelse x 200)
De apaziquone behandlet mus viste bare noen få bivirkninger som mindre vekttap, sammenkrøket utseende, innsunkne øyne og ensidig katarakt ble observert hos noen få mus. Men brutto og mikroskopisk (H E farget) undersøkelse av leveren viste ingen tydelige tegn på oncocytic nekrose eller fibrose hos mus i apaziquone behandlede gruppen. Det ble heller ikke brutto eller mikroskopiske nyre lesjoner observert hos mus behandlet med apaziquone. Disse resultatene ble bekreftet av patologen (Fig 5D).
Leverfunksjon og nyre funksjonstester viste ingen signifikante forskjeller mellom mus i apaziquone behandlet og ubehandlet kjøretøy kontrollgrupper. Disse funnene ytterligere bekreftet at det var ingen toksisitet i apaziquone behandlede gruppe (S1 tabell). Imidlertid viste fullstendig blodtelling noen forskjeller i antall hvite blodceller (WBC) og nøytrofile teller. Musene i apaziquone behandlede gruppen hadde økt antall i begge WBCs (gjennomsnittstall 56,1 vs. 33,4) og nøytrofile (52,2 vs. 29,7) sammenlignet med mus i bilen kontrollgruppen (S2 tabell).
Diskusjoner
Formålet med denne studien var å fastslå den anti-tumor aktivitet av apaziquone å undersøke sitt potensial som et effektivt alternativ til de nåværende kjemoterapi for forvaltning av OSCC pasienter. Apaziquone er et indol kinon pro-medikament som blir aktivert av cellulære DT- diaforase reduktaser i tillegg oksygenerte områder av tumorene, mens under hypoksiske betingelser apaziquone aktiveres av cytokrom P450-reduktaser [24]. Omdannelse av apaziquone til aktive metabolitter i sin tur alkylerer den genomiske DNA og fører til apoptose /celledød. Apaziquone har vist seg å være aktive mot forskjellige krefttyper både
in vitro Hotell og
in vivo
inkludert tykktarmskreft, melanom, renal og ikke-småcellet lungekreft og sentralnervesystemet kreftcellelinjer [19, 25]. Apaziquone viste også betydelige anti-proliferative effekt mot flere murine og humane solide tumorer, inkludert generelt resistente MAC muse colontumorer og mage, eggstokkreft og brystkreft xenotransplantater [26]. Apaziquone har vært mye undersøkt mot kreft i urinblæren ikke bare prekliniske men flere kliniske studier også [27]. Så vidt vi vet, er denne studien den første rapporten om kreft effekter av apaziquone i munnhulekreft.
Her i vi demonstrert at apaziquone er potente aktive mot orale kreftceller. Våre resultater viste redusert celleproliferasjon og øker fraksjonen av celler i sub-G
o-fasen av cellesyklus som tyder apaziquone indusert celledød i OSCC celler. Vi bekreftet apoptose som viktig årsak til økt celledød i apaziquone behandlet AMOS III OSCC celler ved hjelp Annexin V analysen. Våre funn ble videre støttet av økte nivåer av fragmentert PARP (DNA reparasjonsenzymer) etter spalting av caspase 9, noe som tyder aktivering av apoptose i apaziquone behandlet OSCC celler.
Til støtte for vår
in vitro
data som demonstrerer effekten av apaziquone som et nytt medikament for OSCC,
in vivo
mus xenograft studier viste markert redusert vekst av tumoren med mindre vekttap hos apaziquone behandlede dyr sammenlignet med bærerkontrollgruppen dyregruppen. Stoffet behandles tumorer viste markert redusert ekspresjon av spredning markør, Ki67, sammenlignet med kontroll-ubehandlede tumorer ved immunohistokjemi viser at apaziquone behandling redusert proliferering av tumorceller
in vivo
. Dessuten var de seraprøver for klinisk kjemi profiler, hematologi og orgel funksjonstester av apaziquone behandlet mus ikke viser noen åpenbar toksisitet i de behandlede dyrene. Samlet utgjør disse prekliniske funn tyder på at apaziquone har en terapeutisk effekt på kreft i munnhulen
in vivo
.
Klinisk evaluering av apaziquone ble stoppet av mangel på effekt i fase II-studier [25, 28] . Dårlig levering av legemidler til svulster forårsaket av en kombinasjon av rask farmakokinetiske eliminering og dårlige overgang gjennom avascular vev var de viktigste faktorene som er ansvarlige for sin dårlige effekt. Choudry et al [29] foreslått at en undergruppe av blærekreftpasienter eksistere der tumor besitte riktig biokjemisk maskineri som kreves for å aktivere dette stoffet. Siden en betydelig faktor i apaziquone svikt i klinikken ble tilskrevet den raske farmakokinetiske eliminering resulterer i dårlig levering av legemidler til tumorer, ble intravesikal tilførsel av EO9 foreslått å omgå problemet med levering av legemidler til tumorer. Basert på en forståelse av hvorfor apaziquone mislyktes, en ytterligere fase I /II klinisk studie mot overfladisk blærekreft ved bruk intravesikal administrasjon ble bestilt i 2001 og sponset av Spectrum Pharmaceuticals (Irvine, California) [19]. Betydelige anti-tumor aktivitet ble rapportert i fase I /II-studien [30], og dette ble senere bekreftet i fase II-studier [31]. Puri
et al product: [30] viste at intravesikalt administreres apaziquone tåles godt lokalt og systemisk, og det har ablativ aktivitet for overfladisk blære markør kreft lesjoner. Hendricksen et al., [32] har vist at en enkelt like etter transuretral reseksjon blære tumor instillasjon av apaziquone ble godt tolerert med en forventet god sikkerhetsprofil. Apaziquone og metabolitten EO5a ble ikke påvist systemisk med farmakokinetiske analyser [26]. Analyse av sammenslåtte data fra to separate fase III kliniske studier for apaziquone i blærekreft viste signifikant behandlingseffekt i favør av apaziquone i det primære endepunktet av frekvensen av tumorresidiv på 2 år (p-verdi = 0,0174) og i et viktig sekundært endepunkt , tid til tilbakefall (p-verdi = 0,0076). Imidlertid gikk det ikke oppfyller sin primære endepunktet i en statistisk signifikant forskjell i forekomsten av tumorresidiv 2 år mellom de to armene [33]. Disse kliniske forsøk med intravesikal administrasjon av apaziquone direkte inn i blæren støttet vår begrunnelse for å bruke dette stoffet for kreft i munnhulen fordi munnhulen er lett tilgjengelig for lokal levering av legemidler og er sannsynlig å forbedre farmakokinetikken til apaziquone for klinisk bruk i orale kreftpasienter.
Loco-regional kjemoterapi fremstår som et viktig supplement til kirurgi og systemisk kjemoterapi hos utvalgte pasienter med visse typer kreft [34-37]. I denne sammenheng har apaziquone dukket opp som et lokalt effektivt medikament i overfladisk blærekreft [19]. Vår
in vitro Kjøpe og
in vivo
studier på apaziquone i oral cancer gi preklinisk dokumentasjon av sin effekt og garanterer fremtidig fase I og farmakologiske studier til støtte for sitt potensial klinisk bruk. I tilfelle at systemisk administrasjon av apaziquone i orale kreftpasienter gir begrenset effekt, kan det bli utforsket for lokoregionalt kjemoterapi som tillegg til kirurgi som de fleste områder innen munnhulen er lett mottagelig for lokoregionalt narkotika søknad.
en av begrensningene i vår studie er at vi ikke har bestemt uttrykk nivå eller aktivitet av NAD (P) H kinonoksidoreduktase 1 (NQO1) også kjent som DT-diaforase 1, enzymet som er involvert i metabolismen av apaziquone i muntlig SCC celler; i dybden etterforskning av NQO1 i OSCC og dens relevans for apaziquone effekt i OSCC pasienter vil bli gjennomført i en fremtidig studie. Imidlertid har NQO1 protein uttrykk nylig blitt rapportert å forutsi dårlig prognose av ikke-småcellet lungekreft [38].
Konklusjoner
Apaziquone viste lovende anticancer aktivitet i orale kreftcellelinjer drepe kreft celler ved apoptose. Videre apaziquone vist lovende antitumoraktivitet i muntlig kreft tumorxenotransplantater uten betydelig toksisitet til normalt vev og understreker pre-kliniske effekten av apaziquone, som en potensiell ny anti-kreft terapeutisk kandidat for kreft i munnhulen ledelse.
Hjelpemiddel informasjon
S1 fig. . Western blot densitometry analyse
Histograms av western blot densitometry analyse av caspase 3, caspase 9, kløyvde caspase 9, PARP og spaltet PARP normalisert p-aktin i forhold til ubehandlede kontroller (NTC)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0133735.s001 product: (TIF)
S1 Table. Klinisk kjemi profil, Liver Nyre funksjonstester
doi:. 10,1371 /journal.pone.0133735.s002 plakater (docx)
S2 Table. Komplett Blood Count
doi:. 10,1371 /journal.pone.0133735.s003 plakater (docx)
