Abstract
Nyere bevis antydet at prostatakreft stilk /stamceller (CSC) er ansvarlig for kreft initiering samt sykdomsprogresjon. Dessverre, konvensjonell terapi er bare effektive i målretting de mer differensierte kreftceller og spare cscs. Her rapporterer vi at PSP, en aktiv komponent hentet fra sopp Tyrkia halen (også kjent som
Coriolus versicolor
), er effektivt i målretting prostata cscs. Vi har funnet at behandling av prostatacancercellelinje PC-3 med PSP førte til nedregulering av CSC markører (CD133 og CD44) i en tid og doseavhengig måte. I mellomtiden, PSP behandling ikke bare undertrykkes evnen til PC-3 celler til å danne prostaspheres under ikke-heftende dyrkningsforhold, men også hemmet deres tumorigenicity
in vivo
, ytterligere beviser at PSP kan undertrykke prostata CSC egenskaper. For å undersøke om den anti-CSC effekt av PSP kan føre til prostatakreft chemoprevention, ble transgene mus (TgMAP) som spontant utvikler prostatatumorer oralt matet med PSP i 20 uker. Mens 100% av musene som matet med vann bare utviklet prostatakreft ved slutten av forsøket kunne det ikke noen tumorer bli funnet i noen av musene matet med PSP, noe som tyder på at PSP behandling kan fullstendig inhibere prostatatumordannelse. Våre resultater ikke bare demonstrert spennende anti-CSC effekten av PSP, men avslørte også, for første gang, den overraskende chemopreventive tilhører oral PSP forbruk mot prostatakreft
Citation. Luk SU, Lee TK-W Liu J, Lee DT-W, Chiu YT, Ma S, et al. (2011) chemopreventive Effekt av PSP Gjennom målretting av Prostate Cancer Stem Cell-Like Befolkning. PLoS ONE 6 (5): e19804. doi: 10,1371 /journal.pone.0019804
Redaktør: Kelvin Yuen Kwong Chan, Tsan Yuk Hospital, Hospital Authority, Kina
mottatt: 23 desember 2010; Godkjent: 16 april 2011; Publisert: 16 mai 2011
Copyright: © 2011 Luk et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Visekansler Stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste mannlige malignitet i vestlige land, og representerer en betydelig sykdomsbyrde i verden. Når diagnostisert på et avansert stadium hvor kirurgi er ikke lenger mulig, er det kun frontlinjen behandling tilgjengelig hormonbehandlede terapi. Dessverre, de fleste av PCA pasientene til slutt tilbakefall og utvikle hormon ildfast PCa (hrpc), en fatal og sluttfase ansett som uhelbredelig [1].
Kjemoprevensjon er en ideell strategi for battling prostatakreft, og en rekke kjemoterapi eller naturlige kosttilskudd blir nå testet for deres potensial til å hemme prostata kreft utvikling. For eksempel finasterid, en 5-alfa-reduktase spesifikk inhibitor, har vist seg å redusere forekomsten av prostatakreft med 25% i en klinisk studie [2]. På samme måte, dutasteride, en analog av finasterid, ble også rapportert å inhibere prostatakreft utvikling [3]. Til tross for lovende resultat, bivirkninger forbundet med finasterid behandling er fortsatt den største bekymringen for at den skal brukes mye for prostata chemoprevention. Derfor bioaktive matvare forbindelser slik som epigallocatechin-3-gallat eller resveratrol [4], [5], [6] representerer et attraktivt alternativ for prostatakreft chemoprevention, hovedsakelig på grunn av deres relativt lave toksisitet. Dessverre, de fleste av de tidligere studier har gitt noe svar angående deres chemopreventive potensial.
Nylig identifisering av prostatakreft stamceller (cscs) [7] har gitt en ny innsikt i prostata kreftutvikling. Evnen til disse kreftstamceller til selv fornye og differensiere i bulk kreftceller foreslo at de kan være opprinnelsen til prostatakreft [7]. Videre er det svært motstandsdyktig naturen av disse cscs for forskjellige kjemoterapier antydet at cscs kan også bidra til behandlingssvikt og sykdom tilbakefall [8]. Interessant, har en rekke bioaktive mat forbindelser nylig vist seg å ha anti-CSC effekt. For eksempel, vi nylig rapportert at gamma-tokotrienol hentet fra palmeolje hemmer prostasphere formasjon evne og tumorigenicity av prostatakreftceller [9], noe som tyder på at gamma-tokotrienol er effektiv i å undertrykke prostata CSC egenskaper. I tillegg ble en triterpene ekstrahert fra frukt også funnet å hemme den selvfornyelse evne til leveren cscs og sensibilisere den levertumor til cisplatinbehandling [10]. Disse funnene markere potensialet av bioaktive mat forbindelser som CSC målsøkende middel enten for forebygging eller for behandling av prostatakreft.
Her har vi vist at polysaccharopeptide (PSP) hentet fra Tyrkia hale (kjent som
Coriolus versicolor
eller Yun-zhi) rettet mot prostata cscs in vitro og undertrykker tumordannelse in vivo. Behandling av prostatacancercellelinje PC-3 med PSP førte til nedregulering av CSC markører (CD133 og CD44) i en tid og doseavhengig måte. Samtidig dannelse av prostasphere, en viktig egenskap av prostata cscs, ble fullstendig undertrykket i PC-3-celler i nærvær av PSP. Videre PSP forbehandling undertrykte betydelig startfasen av PC-3 celler hos immunsupprimerte mus, noe som tyder på at PSP undertrykker tumorigenitet av PC-3 celler. Enda viktigere, ble oral mating av transgene mus (TgMAP) som spontant utvikler prostata svulst med PSP funnet å fullstendig inhibere prostatatumordannelse. Våre funn støtter at PSP kan være en potent chemopreventive middel mot prostatakreft, eventuelt gjennom målretting av prostata CSC befolkningen.
Resultater
Effekter av PSP på CSC markør uttrykk
PSP har tidligere vist seg å ha anti-kreft egenskaper [11], [12], [13], selv om de underliggende mekanismer er fortsatt uklart. For å teste om anti-kreft effekt av PSP er gjennom målretting av CSC egenskaper, må vi først undersøkt om PSP behandling påvirker uttrykket av prostata CSC markører i PC-3 cellelinje, som har blitt rapportert å inneholde cscs. PC-3-celler ble behandlet med 250 og 500 ug /ml PSP for enten 48 eller 72 timer, og ekspresjonen av CSC markører så som CD133 eller CD44 ble undersøkt ved western blotting. Som vist i figur 1B, protein ekspresjon av CD133 var signifikant nedregulert etter PSP behandling i en tid og doseavhengig måte. Nedregulering av CD44 ble også observert etter PSP behandling, men effekten var mindre åpenbare. Imidlertid undersøkelse av mRNA nivå av både CD133 og CD44 avslørte at den nedregulering av begge proteiner av PSP er ikke på grunn av hemming av gentranskripsjon (data ikke vist). Likevel, disse data tyder på at PSP kan være effektive i målretting de antatte prostata cscs.
A) Western blotting av prostata CSC markører CD44 og CD133 i PC-3 celler etter PSP behandling. Merk at PSP signifikant nedregulerer både stamcellemarkører i en dose- og tidsavhengig måte. B) Levedyktigheten av PC-3-celler etter behandling med 5, 25, 125, 250 og 500 ug /ml PSP i 48 eller 72 timer ble målt ved MTT-analyse. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. C) Strømningscytometri-analyse av PC-3-celler etter behandling med 250 ug /ml av PSP i 72 timer. Legg merke til at ble ikke observert noen signifikant forskjell i cellesyklusfordeling. D) Western blotting resultater for apoptotiske markører (venstre panel) og stamcellevedlikeholds proteiner (panel høyre) i PC-3 celler etter PSP behandling. Legg merke til at ingen endringer i Bax og BCL-2 eller spalting av PARP ble oppdaget.
For å teste om nedregulering av CSC markør uttrykk av PSP skyldes en nedgang i celle levedyktighet, PC- 3-celler behandlet med PSP ved forskjellige doser (0, 5, 25, 125, 250 og 500 ug /ml) i 24, 48 eller 72 timer ble undersøkt ved hjelp av MTT-analyse. Interessant nok har 48 h PSP behandling ikke har noen observerbare effekter på celle-levedyktighet, selv om de samme behandlingene ble funnet å signifikant undertrykke ekspresjonen av CSC markører (figur 1B 0,001, **
P
. 0,0001,
t
test
PSP reduserer tumorigenitet av prostata kreftceller
in vivo
Siden CSC er ansvarlig for initiering kreft, er det mulig at PSP behandling kan hemme tumordannelsen evnen av PC-3-celler in vivo. For å teste denne hypotese, vi først behandlet PC-3-celler som stabilt uttrykker den luciferase-proteinet (PC-3-Luc) med PSP i 72 timer før orthotopically injisert dem inn i SCID-mus. Som undersøkes av bioluminescens avbildning, alle de mus som ble injisert med bærer-forbehandlede PC-3-luc-celler dannet svulster to uker etter implantasjon (figur 3A). Forbløffende tre av de åtte mus som ble injisert med PSP pre-behandlet PC-3-Luc celler mislyktes i å utvikle svulster selv i uke fire innlegget implantasjon (figur 3A B). Mangelen på svulster i PSP-forhåndsbehandlede gruppe ble ytterligere bekreftet ved undersøkelse av museprostatakjertlene ved slutten av eksperimentet (figur 3C). Til sammen våre resultater antydet at PSP var effektive i å redusere tumorigent potensialet i prostatakreftceller, som er et viktig kjennetegn ved cscs.
A) Bioluminescent bilder av SCID-mus orthotopically injisert med PC-3-luc celler I to uker. SCID-mus i den øvre rad ble injisert med bærer-behandlede PC-3-luc-celler, mens mus i den nederste raden ble injisert med PSP-behandlede PC-3-luc-celler. B) Tabell oppsummerer prosenter av mus utvikler påvisbare svulster i uke 2. Omtrent 40% av mus i PSP forbehandlet gruppen ikke danner påvise svulster, mens 100% tumordannelse ble funnet i kontrollgruppen (p = 0,07). C) Valgt
ex vivo
bilder av prostata fra begge grupper. Merk at i PSP-behandlede mus med negativ luciferase signal, ble ingen synlig svulst funnet i prostata vev.
Oral administrasjon av PSP ikke klarer å hemme prostata intraepitelial neoplasi (PIN) utvikling i TgMAP mus
effekten av PSP på prostata cscs støtter hypotesen om at det kan ha en chemopreventive effekt mot prostatakreft. For å teste denne hypotesen har vi ansatt en transgen musemodell som spontant utvikler adenokarsinom av prostata (TgMAP) [17], [18]. De TgMAP mus utvikler PIN mellom 16-20 ukers alder og fremgang til prostata adenokarsinom etter uke 24 (figur 4A). Fordi PIN er regnet som den pre-maligne lesjoner og den viktigste risikofaktor for prostatakreft [19], må vi først testet om PSP administrasjon påvirket PIN utvikling i TgMAP mus. Fem TgMAP mus (14 uker gamle, i minst 2 uker før PIN-utvikling) ble foret med 200 mg /kg av PSP i 4 uker. Fire mus på samme alder ble matet med vann bare for samme periode. Alle mus ble avlivet etter 20 uker gamle og prostata vev ble samlet og seksjonert for histologi. Som vist i figur 4B C, ble det ikke observert forskjeller mellom kontroll og PSP-behandlede TgMAP mus om til brutto anatomi og histologi av prostatakjertelen. På lavt strømforbruk forstørrelse, vevssnitt fra begge gruppene beholdt kjertelstrukturer, og ved høy effekt, PIN ble observert hos både kontroll og PSP-behandlede mus. Disse resultatene tyder på at 4 uker med PSP forbruk klarte ikke å stoppe utviklingen av PIN-koden.
A) Tidsrom av PIN og PCa utvikling i TgMAP mus og tidsplanen for PSP behandling. Fjorten-ukers gamle TgMAP mus ble behandlet med 200 mg /kg av PSP ved oralt inntak fôringer for 4 uker og ofret på den tiden da PIN har utviklet (20 uker gammel). Tabellen oppsummerer resultatene fra den histologiske undersøkelse av prostata fra kjøretøy- og PSP-behandlede mus TgMAP. C) Representative bilder av Hematoxylin Eosin farging av prostata vev fra de TgMAP mus. Legg merke til at både kontroll- og PSP-behandlede TgMAP musene utviklet prostata intraepitelial neoplasi (PIN), som indikert av pilene.
Forlenge PSP forbruk hemmer prostatakreft utvikling i TgMAP mus
unnlatelse av å hemme PIN dannelsen av PSP behandling kan skyldes utilstrekkelig dose eller behandling lengde. Vi har derfor testet om en høyere dose og lengre PSP forbruk kan påvirke prostata svulstdannelse ved bruk av samme modell. Fem TgMAP-mus (8 uker gamle) ble foret med 300 mg /kg av PSP i til sammen 20 uker (figur 5A). Fire mus på samme alder ble igjen foret med vann bare for samme periode. Alle mus ble ofret på 28 uker gammel da prostatakreft ble dannet, med prostatavevet samlet og delt for histologi. Som vist i figur 5B, ble tumorer funnet i forskjellige deler av prostatakjertelen fra alle mus som ble foret med bare vann. Overraskende undersøkelse av alle de prostata seksjon viste at ingen av musene som ble matet med PSP blottlegge eventuelle prostata tumorer (figur 5C), hvilket antyder at PSP behandling fullstendig hemmet prostatatumordannelse i TgMAP mus. I mellomtiden, mens tre av de PSP-matet mus ble funnet å ha PIN, ble de to andre mus funnet å ha helt normal prostata (figur 5D). Videre, i samsvar med den lave toksisitet av PSP, vises lang sikt forbruk ikke å ha noen bivirkninger på mus, som bedømt av kroppsvektforandringer og fysiske tegn (data ikke vist) (figur 5E). Disse funnene sterkt at oralt inntak av PSP kan være en trygg og effektiv chemopreventive middel mot prostatakreft.
A) Oversikt over tidsplanen for PSP behandling. Åtte uker gamle TgMAP mus ble behandlet med 300 mg /kg av PSP ved oralt inntak fôring til 20 uker og ofret i en alder av 28 uker. B C) Representative bilder av Hematoxylin Eosin farging av prostata vev fra kjøretøyet og PSP-behandlede TgMAP mus. Merk at svulster ble funnet i alle de musene som ble behandlet med bilen bare, men var fraværende i alle PSP-behandlede mus. D) Tabellen oppsummerer resultatene fra den histologiske undersøkelse av prostata vev fra kjøretøyet og PSP-behandlede mus TgMAP. * P 0,05 sammenlignet med kontrollbehandling av Fishers eksakte test. E) Gjennomsnittlig kroppsvekt av musene i løpet av PSP behandlingen.
diskusjon
PSP er tidligere blitt vist å indusere apoptose og hemmer veksten av et bredt spekter av kreftceller som inkluderer bryst [20], [21], [22], lever [23] og prostatakreft [24], selv om de mekanismer som ligger til grunn for sin anti-kreft effekt forblir dårlig forstått. Her har vi demonstrert for første gang at PSP har anti-CSC effekter, som dokumentert av nedregulering av CSC markører og undertrykkelse av prostasphere og tumordannelse.
Prostata cscs ble først identifisert av Collins et al. i 2005 ved hjelp av CD44 + /alpha2beta1hi /CD133 + som celleoverflatemarkører [25]. Ved anvendelse av lignende metoder, er cscs også blitt identifisert i prostatakreftcellelinjer så som LNCaP [26], DU145 [26], [27] og PC-3 [28], [29]. Disse prostata cscs ikke bare uttrykker høyt nivå av CD133 og CD44, men er også svært tumorgene i forhold til den ikke-CSC befolkning. Det faktum at PSP i betydelig grad kan undertrykke ekspresjonen av både CD133 og CD44, samt tumorigenisitet av PC-3-celler, indikerer klart effektiviteten av PSP i målretting prostata cscs. Som demonstrert av Hsieh et al [24], er PSP effektive på induksjon av apoptose og inhibisjon av celleproliferasjon i LNCaP-celler. Men dets virkning var mye mindre fremtredende i androgen-uavhengige prostata cancercellelinjer så som PC-3. Dette er faktisk i tråd med våre funn, som viste at PSP kan undertrykke CSC egenskaper uten å indusere noen påvisbar cellesyklus arrest eller apoptose. Likevel, det funn at både Akt fosforylering og β-catenin uttrykk ble også nedregulert med PSP (figur 1E) antyder at PSP kan opptre ved å inaktivere PTEN /Akt /β-catenin vei til å hemme CSC fornyelse. Dette nylig identifisert stamcelle vedlikehold veien ble vist seg å spille en viktig rolle i reguleringen av prostata og melkestamcellepopulasjoner [16], [30]. Avvikende aktivering av Akt /β-catenin rute gjennom knockdown av PTEN ble funnet å berike melke stilk cellepopulasjon, som fører til induksjon av hyperplastiske lesjoner hos mus [30]. Tilsvarende knockdown av PTEN i prostatakreftceller ble også funnet å forbedre prostasphere formasjon evne og tumorigenisitet av celler [16]. Derfor kan tapet av «stemness» av prostata cscs etter PSP behandling skyldes nedregulering av PTEN /AKT /β-catenin veien.
En av de viktigste egenskaper av stamceller er deres evne for å danne kuler i ikke-adherente, serumfrie betingelser [31]. Faktisk har sfæroide formasjons analyser nylig blitt brukt til å identifisere og å berike antatte cscs [16], [32], [33], [34]. I overensstemmelse med tidligere studier, både prostatacancercellelinjer PC-3 og DU145 var i stand til å danne prostaspheres i ikke-klebende kultur [16], som tyder på tilstedeværelsen av cscs innenfor disse cellelinjene. Disse primære prostaspheres, som er resistente overfor kjemoterapeutiske medikamenter [9], er svært følsomme for PSP behandling (figur 2A). I tillegg ble de sekundære prostaspheres signifikant inhibert på en doseavhengig måte (figur 2B), som støtter at PSP er effektiv i å eliminere prostata cscs
in vitro
.
prostata cscs antas å være opprinnelse fra prostata tumor, som har evnen til å fornye seg selv og differensiere til hoveddelen tumor [35]. Det faktum at PSP forbehandling kan hemme tumordannelse av PC-3-celler (figur 3) fremhever ikke bare anti-CSC effekt av PSP, men også antyder at PSP kan ha kjemopreventive effekter mot prostatakreft. Vi testet denne hypotesen ved hjelp av en nyutviklet transgen musemodell for prostatakreft (TgMAP) [17], [18]. Den trinnvis utvikling av prostata svulst (fra lav karakter PIN til brutto svulst) i TgMAP muse høyt etterligner patogenesen av menneskelig prostata kreft, selv om det kanskje ikke helt gjenspeiler den komplekse natur av prostata kreftutvikling. Likevel, det mulig for oss å utvikle en optimal PSP dosering behandling og tidsramme. Mens fire uker med PSP oral forbruk på 200 mg /kg klarte å produsere noen forskjeller i PIN utvikling, ble fullstendig hemming av prostata tumordannelse oppnådd etter 20 uker med oral PSP fôring på 300 mg /kg. I mellomtiden, undertrykkelse av PIN dannelse ved PSP videre foreslått at Kjemopreventivt effekten av PSP kan skyldes undertrykkelse av startfasen på et tidlig stadium. Den ekstremt lav toksisitet og svært potent anti-CSC effekten av PSP-warrants videre evaluering av sin chemopreventive effekt i kliniske studier.
I sammendraget har vi vist for første gang, at PSP behandling ikke bare hemmer CSC egenskaper, men også effektivt undertrykker prostata svulst formasjonen. Våre resultater tyder på at PSP kan være et effektivt middel for prostatakreft chemoprevention.
Materialer og metoder
Polysaccharopeptide (PSP)
PSP hentet fra Yun-zhi ble vennlig levert av lurer Herb Health Products, Ltd. PSP-pulver ble oppløst i autoklavert Milli Q-vann ved en konsentrasjon på 30 mg /ml ved å blande i en rotator ved 4 ° C over natten. PSP Løsningen ble lagret ved 4 ° C. For cellekultur studie ble PSP lager sterilisert med 0,2 um filtrering før bruk. I dyrestudie ble PSP mates direkte til mus.
Cellelinjer og kulturforhold
Prostatakreft cellelinjer PC-3 og DU145 (ATCC, Rockville, MD) ble opprettholdt i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplert med 1% (vekt /volum) penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 5% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA). Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en 5% CO
2 miljø. Luciferase-uttrykke PC-tre cellelinjen ble generert i vår forrige undersøkelse.
TgMAP prostata svulst modell
TgMAP C57 /BL6 mus ved uke 8 og 14 ble administrert med PSP på 200 mg /kg for 4 uker (n = 5) eller 300 mg /kg i 20 uker (n = 5) henholdsvis ved oral sonde fôring (5 dager pr uke). Kontrollgruppen ble matet med vann bare for samme periode. Mus ble ofret (i en alder av 20 uker til 200 mg /kg behandlingsgruppen og 28 uker for de 300 mg /kg behandlingsgruppe) og prostata vev ble samlet, fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin. Hele prostata ble kuttet i 4 mikrometer seksjoner og én av fem påfølgende seksjonene ble farget med H E. Histologi undersøkelse ble utført av Dr. m.v. Chan (patolog, HKU). Statistisk forskjell ble bestemt av Fishers eksakte test, og ble ansett som vesentlig dersom p 0,05. Dyreetikk ble godkjent av komiteen for bruk av levende dyr for undervisning og forskning (CULATR) med godkjenning no. av 1694-1608. Alle dyr håndteringsprosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene for komiteen om bruk av levende dyr i undervisning og forskning (CULATR), The University of Hong Kong.
spheroid formasjon analysen
spheroid formasjon analysen ble endret fra en tidligere rapportert protokoll [36]. Kort sagt ble PCA-celler (200 celler per linje) sådd ut på 12-brønners poly-HEMA (Sigma) -belagte plater. Celler ble dyrket i DMEM /F12-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 14 dager supplementert med 4 pg /ml insulin (Sigma), B27 (Invitrogen), 20 ng /ml EGF (Sigma), og 20 ng /ml basisk FGF (Invitrogen) med PSP på enten 250 ug /ml og 500 ug /ml. For seriell passasje av primær sfærer ble de primære kuler behandlet med PSP for de ovennevnte doser i 72 timer og deretter oppsamlet, dissosiert med trypsin, og resuspendert i DMEM /F12-medium med de ovennevnte tilskudd. Hvert eksperiment ble gjentatt i triplikat, og hvert datapunkt representerer gjennomsnittet og standardavledning. Statistisk forskjell ble bestemt av Student
t
-test og ble ansett som vesentlig dersom p. 0,05
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet på PSP behandling ble målt med et tre – (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyse som beskrevet tidligere [37]. I korthet ble cellene sådd ut på 96-brønners plater og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PSP for den angitte tid. Ved slutten av behandlingen, ble MTT (Sigma, St. Louis, MO) tilsatt til hver brønn, og brønnene ble inkubert i 4 timer ved RT. DMSO ble deretter tilsatt til hver brønn for å oppløse de formazankrystaller. Platen ble inkubert i ytterligere 5 min ved RT, og den optiske densitet (OD) ble målt ved en bølgelengde på 570 nm i et Multiscan Labsystem mikroplateleser (Merck Eurolab, Dietikon, Sveits). Alle individuelle brønner ble analysert i triplikat. Prosentandelen av cellelevedyktighet ble presentert som OD forholdet mellom de behandlede og ubehandlede celler i de angitte konsentrasjoner.
Western blotting
detaljerte eksperimentelle prosedyrer er blitt beskrevet tidligere [37]. I korthet ble cellene lysert med RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% deoksykolsyre, 1% NP-40, 0,1% SDS) med proteasehemmere (1 mg /ml aprotinin, 1 mg /ml leupeptin, 1 mM PMSF), og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av en D
C protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Proteinene ble løst i SDS-polyakrylamidgel ved elektroforese, og deretter overført til Hybond-P PVDF-membran (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Membranene ble blokkert med 10% ikke-fettholdig tørrmelk i TBS-T eller 3% ikke-fettholdig tørrmelk i TBS og inkubert med primære antistoffer ved romtemperatur mot Akt (Ser 473), Bcl-2, PARP (cellesignalisering, Technology Inc, Beverly, MA), CD133 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), CD44, β-catenin og β-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking med TBS-T, ble membranen inkubert med enten anti-mus eller anti-kanin-IgG sekundære antistoffer, og de signaler som ble visualisert ved anvendelse av ECL western blotting pluss system (Amersham, Piscataway, NJ).
cellesyklusanalyse
Celler ble løst med en ml iskald 70% etanol ved 4 ° C. Etter fiksering ble cellepelletene samlet ved sentrifugering, resuspendert med 500 ul PBS, og deretter inkubert ved 4 ° C en dag før utføring strømningscytometri. På neste dag ble cellene farget med propidiumjodid (50 ug /ml) og RNase (1 pg /ml) i 30 min. Cellesyklus analyse ble utført på et flowcytometer EPICS profil analysator og analysert ved hjelp av ModFit LT2.0 programvare (Coulter, Miami, FL).
ortotopiske implantasjon av PC-3-Luc celler
den orthotopic modellen ble etablert med prosedyrene som er beskrevet tidligere [38]. Kort fortalt ble åtte uker gamle CB-17 SCID-mus bedøvet og plassert under en dissekere mikroskop. Et innsnitt på midtlinjen av magen ble gjort, utsette dorsal prostata ved bunnen av blæren. Like mengder av levedyktige PC3-luc-celler (2,5 x 10
4) med eller uten forutgående behandling PSP ble injisert inn i dorsal prostata hos musene. Organene ble erstattet, og magen ble lukket. Tumorutviklingen ble overvåket ved å måle bioluminescent signal hver uke i seks uker etter svulst implantasjon. Musene ble avlivet ved slutten av eksperimentet og prostata vev ble oppsamlet for fysisk undersøkelse. Statistisk forskjell ble bestemt av en to-tailed
t
-test og ble betraktet som signifikant hvis p 0,05. Alle kirurgiske og dyrehåndteringsprosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene for komiteen om bruk av levende dyr i undervisning og forskning (CULATR), The University of Hong Kong.
