Abstract
microRNAs har vært innblandet i mange kritiske cellulære prosesser, inkludert apoptose. Vi har tidligere funnet at apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler ble indusert av adarnantyl retinoid relaterte (ARR) molekyl 3-Cl-AHPC. Her rapporterer vi at 3-Cl-AHPC avhengig apoptose innebærer å regulere en rekke microRNAs inkludert MIR-150 * og MIR-630. 3-Cl-AHPC stimulert MIR-150 * uttrykk og forårsaket redusert uttrykk av c-Myb og IGF-1R i kreft i bukspyttkjertelen celler. 3-Cl-AHPC-formidlet reduksjon av c-Myb resulterte i svekket binding av c-Myb med IGF-1R og Bcl-2 promotorer, for derved å forårsake undertrykking av deres transkripsjon og proteinekspresjon. Over-uttrykk for MIR-150 * også resultert i redusert nivå av c-Myb og BCL-2 proteiner. Videre er tilsetningen av miRNA inhibitor 2′-O-metylerte MIR-150 blokkerte 3-Cl-AHPC-mediert økning i MIR-150 * nivåer og opphevet tap av c-Myb protein. Knockdown av c-Myb i PANC-1-celler resulterte i økt apoptose både i nærvær eller fravær av 3-Cl-AHPC bekrefter anti-apoptotiske egenskap av c-Myb. Overekspresjon av MIR-630 også indusert apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler og hemmet target protein IGF-1R mRNA og protein uttrykk. Sammen disse resultatene implisere viktige roller for MIR-150 * og MIR-630 og deres satsing på IGF-1R å fremme apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation. Farhana L, Dawson MI, Murshed F, Das JK, Rishi AK, Fontana JA (2013) oppregulering av MIR-150 * og MIR-630 induserer apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler ved å målrette IGF-1R. PLoS ONE 8 (5): e61015. doi: 10,1371 /journal.pone.0061015
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 14 desember 2012; Godkjent: 05.03.2013; Publisert: 10 mai 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Veterans Affairs Merit omtale Grant (JAF, MID) og National Cancer Institute (NCI) tilskudd (JAF, MID) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
etter deres første funnet i 1993, har microRNAs blitt studert for deres formål av et stort antall forfattere [1]. Evnen til microRNAs til å regulere ekspresjonen av et bredt utvalg av gener på det post-transkripsjonelle nivå har blitt godt dokumentert [2]. Disse små RNA-molekyler er bevart og uttrykkes i et stort antall organismer inkludert
Homo sapiens Kjøpe og spiller viktige roller i regulering av viktige biologiske prosesser, inkludert celledeling, differensiering og apoptose.
microRNAs er transkribert i kjernen primært av RNA polymerase som lange primære transkripsjoner (pre-microRNAs). Disse molekylene blir så behandlet i kjernen av RNase III drosha inn i 70- og 100-nukleotider forhånds microRNAs og deretter eksportert til cytoplasma hvor de blir ytterligere behandlet med RNase III dicer å generere dobbelt-trådede RNA (dsRNA) på ca. 22 nukleotider [3]. Hvorvidt det er nedbrytning av antisense-strengen på dette punktet er kontroversielt. Nylige bevis antyder sterkt at den omvendte mRNA tråden ikke kan nedbrytes, og kan spille en betydelig rolle i regulering av en rekke cellefunksjoner [4]. Den gjenværende modne enkelt-trådet RNA mikro hindrer translasjon ved å bli et kompleks som binder komplementært til 3′-UTR av målgenet. Gjennom gratis bindende, bestemte microRNAs har vist seg å målrette en rekke gener som øker eller hemmer deres uttrykk, noe som resulterer i en mitogen effekt på en rekke cellulære funksjoner [5].
feilregulering av mikroRNA uttrykk har vært assosiert med kreft initiering og progresjon ved å regulere uttrykket av tumor suppressors og onkogener. Det har tidligere blitt vist at mikroRNA profilene er funnet i pankreas karsinom vev skiller seg vesentlig fra de som finnes i normalt pankreatisk vev eller i pankreatitt [6]. Det har blitt antatt at økt eller redusert ekspresjon av spesifikke microRNAs kan være kraftig måte ved behandling av en rekke ondartede sykdommer [5]. En rekke tilnærminger til modulerer mikroRNA uttrykk har blitt utviklet. Den adamantly-substituert retinoid relaterte (ARR) molekyler har blitt funnet å indusere apoptose i en rekke av ondartede celler både
in vitro Hotell og
in vivo product: [7]. Et antall mekanismer har blitt foreslått gjennom hvilken apoptose oppnås ved denne klassen av molekyler [7]
Vi har tidligere vist at ARRs er kraftige indusere apoptose i kreftcellene i bukspyttkjertelen -. En sturen sykdom med en ofte ødeleggende prognose [8]. Vi antok at eksponering av celler til den 3-Cl-AHPC kan resultere i modulering av mikroRNA uttrykk, og at denne differensial mikroRNA ekspresjon kan bidra til ARR-mediert inhibering av cellulær proliferasjon og celledød induksjon. I foreliggende serie forsøk, viser vi at det ARRs faktisk modulerer microRNAs ekspresjon og at denne forbedring av spesifikk mikroRNA ekspresjon MIR-150 * og MIR-630 fører til nedregulering av IGF-1 R-protein som er viktig formidler av cellevekst og apoptoseinduksjon.
Materialer og metoder
reagenser og celler
(
E
) -4- [3- (1-adamantyl) -4- hydroksyfenyl] -3-klorkanelsyre (3-Cl-AHPC) ble syntetisert som tidligere beskrevet [9]. Humane pankreas karsinom-cellelinjer, ble PANC-1 og MiaPaCa-2 erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og holdt i DMEM-F12-medium inneholdende 10% FBS og 100 ug /ml gentamycin. DMEM-F12-medium, ble føtalt bovint serum (FBS) og lipofektamin 2000 innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Antistoffer og deres kilder var som følger: antistoffer for flowcytometri, CD44-PE, CD24-FITC fra BD Biosciences (San Jose, CA); anti-IGF-1Rβ, anti-SMAD1, anti-spaltet caspase 3 (Asp-175), anti-caspase 3 var fra Cell Signaling Technology (Boston, MA); anti-EGFR, anti-CDK6, anti-c-Myb og anti-BCL2 antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); Cdc14A og ABCC1 fra Abcam, Cambridge, MA og Thermo Scientific, Rockford, IL, henholdsvis; og anti-α-tubulin og β-actin antistoff (onkogen Forskning Produkter, Boston, MA). Puromycin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louise, MO).
miRNA microarray analyse og validering
Panc-1 celler ble utsatt for en mikrometer 3-Cl-AHPC i 30 timer. Total RNA fra 3-Cl-AHPC behandlede og ubehandlede celler ble ekstrahert med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) og deretter prøvepreparering, hybridisering til G4470A 15K human miRNA Microarray (V2) (Agilent Technologies) og analyse ble utført ved Asuragen, Inc. (Austin, TX). For miRNA validering, ble total RNA renset med RNeasy Mini Kit (Qiagen) og 100 ng av RNA ble brukt til å fremstille cDNA ved anvendelse av TaqMan mikroRNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems) under anvendelse av spesifikke primere mikroRNA. Den miRNA sekvensspesifikk primer og probe av MIR-134, MIR-150 *, MIR-630, MIR-345, MIR-382, miR410, og miR129-5P, endogen kontroll RNU6B og TaqMan 2 × PCR Master miks for TaqMan mikroRNA analyser ble kjøpt fra Applied Biosystems og fulgt protokollen som beskrevet av produsentens anvisninger. Real-time QRT-PCR og analyse ble utført i Applied Biosystems 7500 Real Time PCR system. Dataanalyse ble utført med ΔCt verdier av mirnas fra hver prøve ble beregnet ved å normal med internkontroll RNU6B og hver verdi var gjennomsnittet av tre gjentak.
mRNA Kvantitering
Total RNA ble fremstilt fra PANC- 1-cellelinjer under anvendelse av TRIzol som anbefalt av produsenten og renset ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen). For real time PCR, cDNA ble utarbeidet med Superscript III First-Strand cDNA syntese system for RT-PCR (Invitrogen) og analysert i tre eksemplarer med 2 × SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) og ABI Prism 7500 sekvens detection system . PCR bestod av 40 sykluser med 95 ° C i 10 min og deretter 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 60 sek. Oligonukleotidprimeren settene ble syntetisert fra Integrated DNA-teknologi Inc. (Coralville, IA). Primeren satt for hvert gen er listet nedenfor:
EGFR, frem 5’CTTTCGATACCCAGGACCAAG-3 «; reversere 5’CAACTTCCCAAAATGTGCCC -3 «; CDK6, frem 5’TGCACAGTGTCACGAACAGA -3 «;
reversere 5’ACCTCGGAGAAGCTGAAACA-3′; ABCC1, etter
frem 5’AGGTGGACCTGTTTCGTGAC-3 «;
reversere 5’ACCCTGTGGATCCACCAGAAG-3′; SMAD1 frem
5’CAACAATCGTGTGGGTGAAG -3 «; reversere 5’TCCGGTTAACATTGGAGAGC -3 «;
CDC14A, frem 5’GCACACCCAGTGACAACATC -3′; reversere
5’CCTTCACTGGATGGTCGATT -3 «; IGF-1R, frem
5’AACCCCAAGACTGAGGTGTG -3 «; reversere 5’TGACATCTCTCCGCTTCCTT -3 «;
c-Myb, frem 5’GTCCGAAACGTTGGTCTGTT -3′; reversere
5’GGCAGTAGCTTTGCGATTTC-3 «; BCL2, frem 5’ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA -3 «
reversere 5’ACAGTTCCACAAAGGCATCC -3′; β-aktin, frem
5′-TCCTTCCTGGGCATGGAG-3 «; reversere 5»-AGGAGGGGCAATGATCTT-3 «.
miRNAexpression vektor konstruksjon og shRNA-c-Myb plasmid
For bygging av MIR-150 * ekspresjonsvektor, pre-MIR-150 * sekvenser ble syntetisert fra Integrated Technologies Inc. og glødet MIR-150 * sekvensen ble kloner inn pcDNA6.2-GW /EmGFP-Mir vektor fra BLOCK-iT-Poll II MIR RNAi uttrykk Vector sett (Invitrogen). MIR-150 * sekvens i plasmidet ryggrad forhånds MIR-150 * ble bekreftet ved sekvensering. MIR-150 * ekspresjonsvektor stabilt transfektert inn i PANC-1-celler ved å bruke lipofektamin 2000 og de stabile cellelinjer ble selektert med puromycin.Vector inneholder egge sekvens ble anvendt som en kontroll.
Små hårnål (sh) -RNA Myb ekspresjonsvektor ble konstruert ved retnings kloning 5 «-
Bam
HI og 3
EcoRI
jeg overheng nukleotider i en pSIREN-RetroQ vektor i henhold til produsentens instruksjoner (Clontech, Mountain View, California). Genet tie målsekvenser var fra den kodende sekvensen til PubMed deponeringsnummer NM_001130172 og SH-RNA-sekvenser, 5′- TGAAGAAGCTGGTGGAACA -3 «(Myb-KD1) og 5′- ACAGATGACTGGAAAGTTA -3» (Myb-KD2), 5 « – CAGAAGAGGAAGACAGAAT-3 «(Myb-KD3) ble syntetisert fra Integrated DNA-teknologi Inc shRNA regioner i plasmidet ryggraden ble bekreftet ved sekvensering. shRNA-Myb knockdown plasmider ble stabilt transfektert inn PANC-1 celler ved hjelp lipofektamin 2000 og de stabile cellelinjer ble valgt med puromycin. SH-vektor- inneholdende kodede sekvenser i pSIREN-RetroQ vektor ble anvendt som en kontroll. For MIR-630 overekspresjon, ble pep-har-MIR-630 ekspresjonsvektor kjøpt fra Cell Biolabs. Inc. (San Diego, California). For å hindre MIR-150 * og Mir-630 mirnas ble cellene transfektert med antisense O’methylated MIR-150 * (OME-MIR-150) og Mir-630 (OME-MIR-630) sekvenser; sekvensene ble syntetisert fra Integrated DNA Technology Inc.
apoptose og veksthemming
bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble behandlet med en mikrometer 3-Cl-AHPC for ulike angitt tid. Apoptose i celler ble analysert ved flowcytometri hjelp Annexin V-FITC bindende sammen med propidiumjodid (PI) farging (Annexin V-FITC apoptose Detection Kit 1, BD Biosciences, San Diego, California). Datainnsamlingen ble gjort på en FACS Calibur flowcytometer (BD) og analysert med Cellquest programvare (BD Biosciences). Induksjon av celledød av MIR-630 transient transfektert PANC-1-celler ble bestemt ved celledød gjenkjennings ELISAplus sett (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Inhibering av cellevekst ble bestemt ved 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Cellene ble sådd ut på 96-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn i et volum på 200 ul kulturmedium og pre-MIR-630-ekspresjonsvektor, ble MIR vektorer transfektert med lipofektamin. Etter 48 timer av transfeksjon, 25 ul /brønn av MTT (5 mg /ml) tilsatt til mediet og inkubert i 4 h og MTT-utfellinger ble oppløst med 200 ul DMSO og platene ble avlest på en BioTek Synergy HT (BioTek Instrument Inc ., Vermont) ved en absorbans 590 nm. Alle forsøkene ble utført i fire eksemplarer for å bestemme gjennomsnitt og standardavvik.
Western blot
Celler ble ekstrahert med lyseringsbuffer inneholdende 25 mM Tris-Cl buffer (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,2 % Nonidet P-40, 10% glycerol 10 mM NaF, 8 mM β-glycerofosfat, 0,2 mM Na
3VO
4, 1 mM DTT, og 10 ul /ml protease inhibitor cocktail (Sigma Aldrich, St. Louise , MO) og Western blots ble utført som vi tidligere beskrevet [10].
Chromatin Immunoutfelling (chip) assay
PANC-1 kontrollceller ble behandlet med 1 pM 3-Cl-AHPC for 24 timer og formaldehyd tverrbinding og immunoutfellingsanalyse ble utført ved anvendelse av en metode som er beskrevet [10]. Kromatin Lysatet ble inkubert med 1 pg anti-c-Myb antistoff over natten ved 4 ° C og immunoutfelle kompleksene ble samlet opp med Dynal magntic kuler (Invitrogen). De følgende primere ble anvendt i i brikken analyseprøvene for IGF-1R og BCL2 promoter region, etter
IGF-1R, fremover, 5′- AGGGGAATTTCATCCCAAAT-3 «; omvendt, etter
5′-AGGAAAAGTTCCCGCAGTG – 3 «; BCL2, fremover, etter
5’CAGAGGAGGGCTTTCTTTCTTCTT-3 «; revers, 5»-CCCGGCCTCTTACTTCATTCT -3 «
Real-Time PCR ble utført som beskrevet tidligere i mRNA kvantifisering delen. Dataanalysen ble utført med ΔCt-verdier fra hver c-Myb bundet kontroll. 3-Cl-AHPC behandlede prøver ble beregnet ved normalisering med inngangsstyreinngang og behandlet verdi, og hver verdi var gjennomsnittet av tre replikater. PCR-produktene ble kjørt ved elektroforese på en 2% agarosegel og visualisert ved etidiumbromid-farging, og bildet som er tatt ved Gel Logic 2200 Imaging system, Molecular Imaging System Carestream Health, Inc.
fluorescens-aktivert cellesortering (FACS ) av CD44
+ /CD24
+ celler og sfære formasjon
celler ble dyrket til 70-80% konfluens, trypsinisert og vasket med sortering buffer (1 x PBS, 5% FCS). Cellene ble resuspendert med 100 ul sortering buffer og inkubert med 15-20 pl anti-CD44-PE og anti-CD24-FITC primære antistoffer i 30 minutter ved is. Cellene ble vasket og resuspendert i 500 ul buffer sortering og sortert ved hjelp av strømningscytometri FACSAria system (BD Immunocytochemistry Systems, Franklin Lakes, NJ).
Ordnet CD44
+ /CD24
+ celler ble suspendert i serumfritt stamcelle medium inneholdende DMEM /F12 (01:01) supplert med B27 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 20 ng /ml EGF (Biomol International, Plymouth, PA), 20 ng /ml fibroblast vekstfaktor (Biomol International, Plymouth, PA), og 100 ug /ml gentamycin. Omtrent 150-200 celler per brønn ble sådd i en ultra low-vedlegg 96-brønns plate (Corning Inc, Lowell, MA). 3-Cl-AHPC (1,0 uM) ble tilsatt dagen etter at cellene ble sådd ut eller etter 7 dagers sfære formasjonen. Spheres ble fotografert og målt med et Olympus mikroskop (OLYMPUS CKX41) og Olympus mikroskop digitalkamera med DP2-BSW programvare (Olympus myk bildeløsninger GmbH, Tyskland). All statistikk ble utført ved hjelp av VassarStats web statistisk programvare (Richard Lowry, Poughkeepsie, NY, USA). Én-veis analyse av varians (ANOVA) ble utført for å påvise eventuelle forskjeller mellom grupper av sfære kontroll, 3-Cl AHPC behandlede kuler. Dersom resultatet av ANOVA var signifikant (** P 0,01 vs kontroll), parvise sammenligninger mellom gruppene var laget av en post-hoc test (Tukey-HSD prosedyre). Signifikansnivået ble satt til ** P 0,01 vs kontroll og * P 0,05 vs kontroll. Klammer ble brukt i tallene som tyder behandlinger som er vesentlig forskjellig fra kontrollen.
Resultater
3-Cl-AHPC mediert modulering av spesifikke microRNAs
PANC-en celle eksponering til en pM 3-Cl-AHPC modulert ekspresjon av et antall microRNAs (tabell 1 mikromatriseanalyse). Oppregulering av MIR-134, MIR-150 *, MIR-630, MIR-345, MIR-382, MIR-410 og MIR-129-5p og nedregulering av MIR-202 og MIR-578 ble også observert ( ikke vist). Ytterligere bevis av 3-Cl-AHPC-mediert miRNA modulering ble oppnådd ved sanntids-PCR ved anvendelse av en Taqman probe. Real-time PCR viste en statistisk signifikant økning i uttrykket av ulike mikroRNA arter på 24 timer (figur 1) i
microRNAs ble validert av kvantitativ real time PCR. Celler ble behandlet med 3-Cl-AHPC i 24 timer. Detalj metoder var som beskrevet i materialer og metoder. Feilstolpene representerer gjennomsnittet av tre separate bestemmelser ± standardavvik (SD). *, ** Og *** ( 0,05, 0,01 og 0,001) var signifikant forskjellig i forhold mellom kontroll og behandlede prøver ved hjelp av
t
-Test
PANC-1 og MiaPaCa-2 celler. Vi har også fastslått hvorvidt 3-Cl-AHPC modulering av ekspresjon mikroRNA resulterte i opp- eller ned-regulering av genene som målrettes av disse microRNAs; målgener ble identifisert ved hjelp av TargeScanHuman 5,0 data base. Modulering av de målrettede genene inkludert EGFR, c-Myb, CDC14A, IGF-1R, SMAD1, ABCC1, CPEB3, og CDK6 både på mRNA (figur 2A og B), og proteinnivå (figur 2C og E) ble demonstrert innenfor 24 t av 3-Cl-AHPC eksponering. Vi fant også at eksponering av PANC-1 celler til 3-Cl-AHPC for 24 timer eller 48 timer økt uttrykk av MIR-150 * samtidig redusere uttrykket av c-Myb protein og IGF-1R i celler (figur 2D og E) .
(A og B) Redusert ekspresjon av mRNA av SYBR-grønn RT-PCR; (C og E) ble redusert proteiner nivåer ble demonstrert ved Western blot analyse. D). 3-Cl-AHPC eksponering øket MIR-150 * ekspresjon og deretter redusert ekspresjon av c-Myb, og IGF-1 R-proteiner (E). Feilstolpene representerer gjennomsnittet av tre separate bestemmelser ± standardavvik (SD). *, ** Og *** ( 0,05, 0,01 og 0,001) var signifikant forskjellig i forhold mellom kontroll og behandlede prøver ved hjelp av
t
-Test
over-uttrykk for miR150 * forbedret apoptose ved å regulere c-Myb og IGF-1R og hemmet CD44
+ /CD24
+ stamcelleliknende kuler formasjon
Tidligere forskning har vist at speil 150 målene proto-onkogen transkripsjonsfaktoren c-Myb i løpet av flere trinn av lymfocytt utvikling [11]. For ytterligere å demonstrere MIR-150 * modulering av c-Myb og IGF-1R de PANC-1-celler, pre-MIR-150 * var stabilt over-uttrykt ved anvendelse av en pre-MIR-150 * ekspresjonsvektor (pre-MIR -150 *) i Panc-1 celler som resulterer i en 7-ganger økning i pre-MIR-150 * uttrykk (figur 3A); pre-MIR-150 * over-ekspresjon resulterte i en 80% hemning av IGF-1R og c-Myb mRNA-nivåer, redusert med 50% ekspresjon av c-myb proteinnivåer og en 32% reduksjon av IGF-1R uttrykket (figur 3B -D). I tillegg er både økt ekspresjon av pre-MIR-150 * av seg selv, og i nærvær av 3-Cl-AHPC betydelig forbedret apoptose i PANC-1-celler (figur 3E). Pre-MIR-150 * aktivert caspase 3 1,5 ganger, viser proteolytisk spaltet-caspase 3 fragmenter (figur 3E, panel øverst til høyre) og indusere DNA-fragmentering (Figur 3E, høyre panel lavere). Disse resultatene sammen implisere en pro-apoptotiske rollen MIR-150 gjennom sin regulering av sine mål gener. Inkubasjon av PANC-1 celler med inhibitor 2′-O-meyhylated MIR-150 * antisense (OME-miR150 *) blokkert 3-Cl-AHPC-mediert heving av MIR-150 * nivåer og redusert i c-Myb uttrykk sterkt . Dette resultatet tyder på at 3-Cl-AHPC utøver sin effekt på c-Myb og IGF-1R uttrykk gjennom modulering av microRNAs (figur 4A-C).
(A) Økt uttrykk av pre-MIR-150 * ekspresjonsvektor og pre-MIR-150 * redusert ekspresjon av c-Myb og IGF-1R mRNA og protein i pre-MIR-150 * stabilt transfekterte celler (B-D). Celler ble behandlet med 1 pM 3-Cl-AHPC i 24 timer. (E) pre-MIR-150 * indusert apoptose av seg selv og forbedret 3-Cl-AHPC mediert apoptose i PANC-1-celler. Cellene ble transient transfektert med pre-MIR-150 * ekspresjonsvektor i 24 timer og deretter eksponert for 3-Cl-AHPC i 24 timer. Induksjon av apoptose ble bestemt ved bruk av Annexin V-FITC merking med propidiumjodid (PI) farging i celler og de Feilstolpene representerer gjennomsnittet av tre separate bestemmelser ± standardavvik (SD). Alle behandlede prøver er vesentlig forskjellige fra MIR-vektor. * ( 0,05), ** ( 0,01) og *** ( 0,001) signifikant forskjellig i forhold til Mir-vektor av
t
-Test. Over-uttrykk for MIR-150 * indusert aktivering av caspase 3 som indikert av spaltede caspase 3 fragmenter i pre-MIR-150 * forbigående transfekterte celler (panel øverst til høyre). pre-MIR-150 * uttrykt Panc-1 celler indusert apoptose som angitt i acridinoransje /etidiumbromid fargede celler i panelet nederst til høyre. Cellene ble transfektert med pre- MIR-150 * i 48 timer og deretter farget og fotografert med Olympus fluorescens mikroskop digitalkamera programvare og DP2-BSW programvare.
(A) Inhibitor 2′-O-metylert MIR-150 * (OME-150) hemmet 3-Cl-AHPC mediert MIR-150 * uttrykk i forbigående transfekterte celler. (B og C) MIR-150-inhibitor blokkerte 3-Cl-AHPC mediert c-Myb degradering. Celler ble behandlet med 1 pM 3-Cl-AHPC i 24 timer. (D) Slå ned av c-Myb uttrykk i celler. (E) Slå ned av c-Myb forbedret apoptose i celler. -Celler stabilt transfektert med tre sh-myb-knockdown ekspresjonsvektorer og Scrumble sekvensstyring vektor ble eksponert for 3-Cl-AHPC i 24 timer. Induksjon av apoptose ble bestemt ved bruk av Annexin V-FITC merking med propidiumjodid (PI) farging i celler og de Feilstolpene representerer gjennomsnittet av tre separate bestemmelser ± standardavvik (SD). Alle behandlede prøver og sh-Myb er vesentlig forskjellig fra kontroll og sh-vektor; • og ••, ** ( 0,05 og mindre enn 0,01 henholdsvis) er vesentlig forskjellige ved
t
-Test og • representert sammenligning mellom 3-Cl-AHPC til OMe-150 * + 3-Cl -AHPC behandlede prøver.
Vi antok at c-Myb var anti-apoptotiske i PANC-1-celler og knockdown av c-Myb ville forsterke apoptose av celler både i fravær og tilstedeværelse av 3-Cl-AHPC. Tre kloner av sk-Myb knockdown ble samlet i PANC-1-celler og lave nivåer av c-Myb ekspresjon ble funnet (Figur 4D). Knockdown av Myb vist forbedret apoptose i sh-Myb-KD celler. Tilsetning av 3-Cl-AHPC til disse cellene også resultert i betydelig større grad av apoptose enn bemerket med celler transfektert med bare vektoren (figur 4E).
BCL-2 spiller også en viktig rolle i å motvirke apoptose ved et antall agenter [12]. Det er tidligere blitt rapportert at c-Myb har et bindingssete i Bcl-2-promoteren, og er en positiv regulator av Bcl-2-ekspresjon. Redusert c-myb nivåer i den induserbare dominant-negativ Myb protein FDCP-blanding klon A4-celler resulterte i redusert Bcl-2-ekspresjon [13]. Vi undersøkte derfor BCL-2 uttrykk i celler eksponert for 3-Cl-AHPC. Vi har funnet signifikant redusert Bcl-2-mRNA og protein ekspresjon i begge PANC-1 og MiaPaCa-2-celler (Figur 5A og B). I tillegg, i forhold til ekspresjon av pre-MIR-150 * resulterte i redusert Bcl-2-protein ekspresjon tyder den er regulert av MIR-150 * gjennom c-Myb (figur 5C). Kromatin immunoutfellingsstudier analyser ble preformet for å belyse mekanismen som 3-Cl-AHPC senker Bcl-2 og IGF-1R uttrykk. 3-Cl-AHPC eksponering førte til en betydelig reduksjon i binding av c-Myb til IGF-1R og Bcl-2-promotorer (figur 5D).
(A og B) 3-Cl-AHPC redusert BCL-2 mRNA og protein uttrykk. (C) Over uttrykk for pre-MIR-150 * redusert BCL-2 protein uttrykk. (D) 3-Cl-AHPC redusert c-Myb- binding til IGF-1R og BCL-2 promoter områder i kromatin immunpresipitering analysen. Celler ble eksponert for 3-Cl-AHPC i 24 timer. Feilstolpene representerer gjennomsnittet av tre separate bestemmelser ± standardavvik (SD). ** Og *** ( 0,01 og 0,001). Var signifikant forskjellig i forhold mellom kontroll til 3-Cl-AHPC behandlet mRNA og Myb bindende i promotor nettsider ved hjelp av
t
-Test
Vi har tidligere funnet at Panc-1 celler beriket for CD24 /CD44 positivitet besatt stamcelleliknende trekk danner kuler i ikke-heftende vekstvilkår [8]. Tilsetningen av 3-Cl-AHPC til disse sfærene hemmet deres vekst og resulterte i induksjon av apoptose. Vi vurderte derfor effekten av forhøyede nivåer av pre-MIR-150 * og knockdown av c-Myb uttrykk på veksten av disse sfærene (6A, B og C). Begge forhøyede nivåer av pre-MIR-150 * og knockdown av c-Myb ekspresjon resulterte i en signifikant vekstinhibering av kuler 7 og 14 dager. Tilsvarende Zhang
et al.
[14] nylig har vist at økt Mir-150 uttrykk hemmer CD133 positiv leverkreft stamceller gjennom hemming av c-Myb uttrykk.
(A og C ) Pre-MIR-150 * hemmet sfære formasjonen i CD44
+ /CD24
+ celler. (B og C) c-Myb knockdown hemmet sfære dannelse i CD44
+ /CD24
+ PANC-1-celler. For sfære formasjon, ble den CD44
+ /CD24
+ celler sortert etter flowcytometri fra stabilt transfektert pre-miR150 * og sh-Myb slå ned celler, henholdsvis. Størrelsen på kulene ble fotografert og målt på en 100 mikrometer skala og forstørrelse 400 × bruker Olympus fluorescens mikroskop digitalkamera programvare og DP2-BSW programvare. De feilfelt representerer gjennomsnittet av 15 sfære bestemmelser ± standardavvik. ** Var signifikant forskjellig i forhold til kontroll kuler. Data ble analysert ved ANOVA; Tukey HSD-test for multiple sammenligninger. ** P 0,0001 vs kontroll. (D) Scheme viser spådd mål konservert område av MIR-630 i 3’UTR av IGF-1R.
Target protein IGF-1R er regulert av MIR-630
Galluzzi
et al.
har vist at MIR-630 regulerer cisplatin indusert vekst arrest ved å modulere cellesyklus inhibitor p27
Kip1 og induserer apoptose i ikke-småcellet lungekreft [14]. Vi har funnet at PANC- 1 celler eksponert for 3-Cl-AHPC forbedret MIR-630 uttrykk 6-fold. Bruke TargetScanHuman 5.1 programvare (tabell 1), fant vi potensielle Mir-630 mål gener IGF-1R og Cdc14A. MIR-630-par til en 7 nukleotid konservert region lokalisert i posisjon 2658 til 2665 av IGF-1R 3′-UTR (figur 6D). Over-uttrykk for pre-MIR-630 redusert IGF-1R mRNA og protein uttrykk i forbigående transfekterte celler (Figur 7A-D), mens det var ingen endring i mRNA nivå målet genet Cdc14A. 3-Cl-AHPC redusert Cdc14A mRNA og protein ekspresjon (figur 2A og C). Den mekanismen som 3-Cl-AHPC utløst redusert Cdc14A uttrykk gjenstår å fastslå. Den anti inhibitor 2′-O-denaturert MIR-630 blokkerte pre-MIR-630 mediert IGF-1R mRNA degradering indikerte at en MIR-630 target genet er IGF-1R (figur 7E). I tillegg over uttrykk for pre- MIR-630 forbedret hemming og apoptose betydelig i PANC-en celle (Tall 7F og G). Disse resultater viser den viktige rollen MIR-630 i induksjon av apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A) forhånds MIR-630-ekspresjon i PANC-1 og MiaPaCa-2-celler. (B og C) Økt ekspresjon av pre-MIR-630 ble redusert IGF-1R mRNA, men ikke Cdc14A i celler. (D). Redusert IGF-1R protein uttrykk i pre-MIR-630 uttrykt celler. (E) Inhibitor 2′-O-denaturert MIR-630 (OME-630) blokkerte IGF-1R mRNA degradering. Cellene ble transient transfektert med pre-MIR-630 i 48 h (F og G) pre-Mir-630 uttrykk hemmet vekst og indusert apoptose i PANC-1 celler. Inhibering av celle proliferations ble evaluert etter 48 timer med pre-MIR-630 forbigående transfekterte celler ved hjelp av MTT-analyse og uttrykt som prosent av det inhiberte på et tidspunkt i forhold til mir-vektorkontroll. Feilstolpene representerer gjennomsnittet av fire separate bestemmelser ± standardavvik (SD). *, ** Og *** ( 0,05, 0,01 og 0,001) var signifikant forskjellig i forhold mellom MIR-vektor og MIR-630; • var meget signifikant og representerte sammenligningen mellom MIR-630 til MIR-630 + OME-630 ved hjelp av
t
-Test. Apoptose av MIR-630 celler ble evaluert etter 48 timer med transfekterte celler. Den celledød ble målt ved cytoplasmatiske histon-assosiert-DNA-fragmenter av ELISA (berikelse faktor = OD av MIR-630 uttrykt lysat /OD av MIR-vektor, OD ved 405 nm-490 nm).
diskusjon
betydningen av mikroRNA uttrykk i å opprettholde normal cellefysiologi er godt dokumentert [15]. Inhibering av mikroRNA behandling har vist seg å øke cellulær transformasjon [16]. Den ufullstendige knockdown av dicer 1 i mus lunge adenokarcinomceller resulterte i økt cellulær proliferasjon og invasivitet samt forbedret
in vivo
tumordannelse [16]. Videre redusert mikroRNA ekspresjon i mus embryonale fibroblaster resulterte i ufullstendig transformasjon av celler [16]. Mekanismer som mikroRNA uttrykk avtar i de ondartede cellene i motsetning til normale celler er ikke klart. Nylig har epigenetisk regulering av mikroRNA ekspresjon er vist i en rekke forskjellige tumorer [17]. MikroRNA gener ble brakt til taushet av avvikende hypermethylation av CpG øyer som grenser til og omgir mikroRNA gener og ved acetylering av mikroRNA gen forbundet histoner [17] i humane tumorer. Det har vist seg at en større andel av kjente mikroRNA genene har blitt funnet å være epigenetiske reguleres ved metylering (11,6%) enn det som finnes i protein-kodende gener (1-2%) [18], [19].
i foreliggende publikasjon, har vi vist at 3-Cl-AHPC modulerer ekspresjon av en rekke microRNAs som regulerer oversettelse og degradering av mRNA. Disse mRNA koder for ekspresjon av proteiner som tidligere er påvist å ha viktige fysiologiske roller i cellulær proliferasjon og død. Det er funnet at 3-Cl-AHPC eksponering resulterte i opp-regulering av en rekke microRNAs inkludert MIR-150 * og MIR-630. Betydningen av moduler av disse microRNAs ble demonstrert ved observering følgende modulering av deres forutsagte mål genes- inkludert EGFR, c-Myb, SMAD1, ABCC1, CPEB3, IGF-1R og CDK6.
3-Cl-up AHPC -regulation av MIR-150 * resulterte i redusert ekspresjon av c-Myb og IGF-1R. Begge proteiner spiller avgjørende roller i styrke celleformering. Over-ekspresjon av IGF-1R har blitt funnet i en rekke forskjellige maligniteter, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [20]. Hemning av IGF-1R anvendelse av små molekyl-inhibitorer har ført til redusert vekst kreft i bukspyttkjertelen [21].
