Abstract
De fleste menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler er motstandsdyktig mot tumornekrosefaktor (TNF) -relaterte apoptose-induserende ligand (TRAIL) – mediert apoptose. Imidlertid er mekanismene som kreft i bukspyttkjertelen celler utnytte deres ekstracellulære molekyler for å motvirke den proapoptotiske signale mediert av TNF-familien er stort sett ukjent. I denne studien demonstrerer vi for første gang at DcR3, en utskilt lokkedue reseptor som ondartet kreft i bukspyttkjertelen celler uttrykker seg på et høyt nivå, fungerer som et ekstracellulært antiapoptotic molekyl ved å binde seg til TRAIL og motvirke sin død fremmende funksjon. Reduksjonen av DcR3 med siRNA avslørt TRAIL og sterkt forbedret TRAIL-indusert apoptose. Gemcitabin, en første-linje narkotika for kreft i bukspyttkjertelen, også redusert nivå av DcR3. Tilsetningen av DcR3 siRNA ytterligere forbedret gemcitabin-indusert apoptose. Spesielt, vår
in vivo
studien viste at den terapeutiske effekten av gemcitabin kan økes via ytterligere reduksjon av DcR3, noe som tyder på at nedregulering av DcR3 i tumorceller kunne tippe balansen av bukspyttkjertelen celler mot apoptose og potensielt tjene som en ny strategi for kreft i bukspyttkjertelen terapi
Citation. Wang W, Zhang M, Sun W, Yang S, Su Y, Zhang H, et al. (2013) Reduksjon av Decoy Receptor 3 Forbedrer TRAIL-mediert apoptose i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (10): e74272. doi: 10,1371 /journal.pone.0074272
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 8 mars 2013; Godkjent: 29 juli 2013; Publisert: 25 oktober 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Natural Science Fund of China Grants (81071968) til WW og Key Program for vitenskapelig forskning i Fujian Medical University (09ZD014) til WW. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: medforfatter Sunghee Kim er ansatt av BioPowerTech. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Balansen mellom proapoptotiske og antiapoptotic faktorer er en viktig faktor i skjebnen til kreftceller . Disse cellene klarer å tippe balansen mot overlevelse ved overekspresjon antiapoptotic molekyler i intracellulære og inter nettsteder. Et legeme av studier har vist at intracellulær B-celle lymfom 2 (Bcl-2) fremmer malignitet i flere typer tumorer, mens blokkering av dens funksjon forbedrer effekten av kreftbehandlinger [1], [2], [3]. Bcl-2 stabiliserer mitokondriemembranen og hindrer frigjøring av cytokrom c fra mitokondrier og dannelsen av apoptosomes i cytoplasma [4], [5], for derved å redusere tumor celle apoptose og øke evnen av tumorer til å vokse og metastasere.
Men de fleste av apoptotiske signale aktiveres ekstracellulært via binding av proapoptotiske ligander fra en celle til død-reseptorer på overflaten av en annen celle [6], [7]. For eksempel, ligandene av tumornekrosefaktor (TNF) familien binder seg til sine reseptorer (for eksempel, TNF til TNFR, Fasl til Fas, LYS til hvem /TR2) og deretter utløse apoptotisk signalering som reaksjon på ugunstige hendelser [8], [ ,,,0],9]. Det ekstracellulære mekanismen ved hvilken celler beskytte seg selv før døds ligander bindes til deres reseptorer har tiltrukket seg mye oppmerksomhet [10], [11]. Selv om oppdagelsen av lokkefugl reseptorer (f.eks DcR1, DcR2, og DcR3) har kastet noe lys over dette fenomenet [8], [12], en mer detaljert forståelse av disse mekanismene er nødvendig.
Kreftceller utnytte 2 lag med beskyttelse: (1) et aktivt forsvarssystem hvori lokkefugl reseptorer blokkere døds liganden før de når reseptorer av TNF-familien på celleoverflaten og forhindrer initieringen av død signalering; og (2) et passivt forsvar system i hvilket antiapoptotic maskiner spiller en rolle når det dødssignal blir utløst inne i cellene. Siden deler av molekyler av type I celle-døden-reseptorer (f.eks DcR3, DR3, DR5, TNFR1, OPG, og OX40) og døds ligander (f.eks Fasl, LYS, TL1A, TRAIL, og LTA) dele funksjonelt lignende domener, spesielt blant de 6 medlemmer av TNFR familie [13], brukte vi flere tilnærminger for å utforske bindingen og samhandling av DcR3 med TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL). Våre resultater viste at DcR3 binder ikke bare å Fasl, TL1A (vegi) og LIGHT [14], [15], [16], [17], men også for å TRAIL, som dokumentert av resultatene fra flere analyser, blant annet Biacore bindende, flowcytometri, immunoutfelling, Western blotting, og enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA). Ondartet kreft i bukspyttkjertelen celler uttrykker et høyt nivå av DcR3, som kan nedregulert ved DCR3 siRNA eller kjemoterapi narkotika, for eksempel gemcitabin. Kombinasjonen av DcR3 siRNA med TRAIL eller gemcitabin sterkt forbedrer apoptotiske prosessen
in vitro Hotell og bremser tumorvekst
in vivo
, noe som tyder på at nedregulering av ekstracellulært antiapoptotic DcR3 kan forbedre kreftbehandling. Dette gjelder spesielt for aggressiv kreft i bukspyttkjertelen, som utnytter DcR3 som middel for sin progresjon.
Materialer og metoder
cellelinjer og reagenser
To menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer , ASPC-1 og MiaPaCa-2, og en colon carcinoma cellelinje SW480 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler ble opprettholdt som monolagskulturer i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum, 100 ig /ml streptomycin, og 100 U /ml penicillin ved 37 ° C i en fuktig 5% CO
2 atmosfære. DcR3-relaterte reagenser ble levert av BioPowerTech (Tuscaloosa, Alabama). Gemcitabin ble kjøpt fra apoteket ved University of Rochester Medical Center (Rochester, New York). SiRNA for DcR3 ble syntetisert på Integrerte DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). Rekombinant Fasl og TRAIL og deres antistoffer ble kjøpt fra R Deretter ble 100 ul 1:4000 streptavidin-pepperrot peroksydase (SA-HRP) tilsatt og inkubert i brønnene i 45 minutter ved 37 ° C, vasket, visualisert med 3, 3 «, 5, 5» tetrametylbenzidin (TMB), og avlest ved en bølgelengde på 450 nm. I revers, ble platene belagt med DcR3 (100 ul av 2 ug /ml) og deretter inkubert med rekombinant Fasl eller TRAIL (100 ul av 1 ug /ml) med eller uten DcR3 (20-50 ug /ml, for konkurranse) etterfulgt av biotinylert anti-Fasl eller anti-TRAIL (0,5 mikrogram /ml), SA-HRP, TMB og lese på A
450.
ELISA for DcR3
DcR3 var kvantitativt målt som beskrevet tidligere 17]. Siden DcR3 er et utskilt protein, ble 100 ul kulturmedier som brukes. I korte trekk ble det inkubert over natten med en ELISA-plate belagt med anti-DcR3 mcAb (2 ug /ml) ved 4 ° C. Etter diverse proteiner ble vasket av, ble det bundne DcR3 oppdaget med biotinylert anti-DcR3 mcAb og SA-HRP og visualisert med TMB-substrat. Den ukjente prøven konsentrasjonen ble bestemt fra standardkurven, som ble beregnet samtidig.
nedregulering av DcR3 med små interfering RNA (siRNA)
Liten interfering RNA sekvenser for human DcR3 ble utformet med BLOCK -Det RNAi Designer (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California). SiRNA-sekvensen var 5′- CGCUGCAGCCUCUUGAUGGAGAUGUCC-3 «, og styre siRNA-sekvensen var 5′-AGGUAGUUCCAGAACUGCGUGUAGUGG-3». De ble kjemisk syntetisert for forbigående knockdown av DcR3 i cellekultur. I tillegg ble tilsvarende sekvensene innsatt i pSilencer ekspresjonsvektor for en stabil lav-DcR3 expresser. Transfeksjon ble gjennomført med Lipofectamine LTX reagens (Invitrogen Life Technologies) og Opti-MEM media, i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene med transient knockdown av DcR3 ble brukt innen 3 dager. De stabile transfektanter ble valgt på 50 ug /ml hygromycin B. De overlevende cellene ble slått sammen for å unngå koloni variasjon og bruk for
in vivo
studien.
apoptose assays
apoptotiske celler ble detektert med 3 analyser. Cellene ble høstet ved 24-48 timer og farget med Annexin V /propidiumjodid (PI) for apoptotiske celler eller fiksert i 75% alkohol, etterfulgt av PI farging for sub-G1-fraksjon, i henhold til standard protokoll fra produsenten. Resultatene ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Western blotting ble utført for spaltede PARP. De høstede celler ble lysert med 1% NP-40-tris lyseringsbuffer inneholdende en cocktail av proteaseinhibitorer, og proteinkonsentrasjonen av lysat ble bestemt ved BCA-metoden (Pierce, Rockford, IL). Protein (30 ug) ble applisert på 10% SDS-PAGE, elektroforese, overført til en nitrocellulosemembran, inkubert med 0,5 ug /ml av kanin-anti-spaltet PARP eller anti-GAPDH (som lasting kontroll) fulgt av anti-kanin-HRP og visualisert med ECL kjemiluminescenssubstrat.
Animal etikk
Denne studien ble utført i henhold til og godkjent av University of Rochester (Rochester, NY) Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC ), University Committee on Animal Resources (UCAR), som beskrevet i
Manuell på Responsible Care og bruk av forsøksdyr
. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse og begrense dyrenumre. Ethvert dyr som viste tegn på svakhet og dehydrering på grunn av behandling mottatt en våt mat diett. Dyr som fortsatte å vise svakhetstegn ble humant avlivet gjennom halshugging.
Tumor vekst i hårløse mus
Kontroll transfektanter eller transfektanter med lav DcR3 uttrykk (2 × 10
6 i 0.2 ml saltvann) ble injisert subkutant i bakbena atymiske nakne mus (5-6 uker gamle) med en 27,5-gauge nål. Tumorene fikk vokse i 7 dager (ca. 0,1 cm
3) før behandling. Mus som har svulster som er dannet av enten styre transfektanter eller transfektanter med lav DcR3 ekspresjon ble tilfeldig delt i 2 grupper (8 mus /gruppe), ble behandlet med saltløsning som en kontroll eller gemcitabin (IV 100 mg /kg) to ganger per uke i 4 uker. For svulsten vekstkurve, ble tumorstørrelse målt to ganger ukentlig med Vernier calipers. Tumorvolumene ble beregnet i henhold til formelen
(L x W2) /2
ved å måle tumorlengde (L) og bredden (W). Ved slutten av forsøket ble tumorene fjernet og veid. En ELISA ble anvendt for å vurdere DcR3 nivå i tumorhomogenat (30 ug). Western blotting ble utført for DcR3, TRAIL, og spaltes PARP.
Statistiske analyser
Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) på minst 3 bestemmelser, med mindre annet er angitt. Forskjellene mellom eller mellom kontroll- og behandlingsgrupper ble bestemt av Student
t-
test eller analyse av varians (ANOVA).
P
. 0,05 indikerte statistisk signifikans
Resultater
DcR3 bundet til Trail
TRAIL er et membranbundet død ligand med lave nivåer under normal dyrkningsbetingelser, og DcR3 er et utskilt lokkefugl reseptor. Selv Fasl, TL1A, og LYS har blitt identifisert som ligander av DcR3 [14], [15], [16], [17], [18], har samspillet mellom DcR3 med TRAIL ikke blitt studert i stor detalj. Fordi TRAIL aksjer funksjonelt lignende domener med Fasl, TL1A, og LYS, spekulerte vi at DcR3, som binder seg til Fasl, TL1A, og lys, kan også binde til TRAIL.
For å avgjøre om DcR3 binder seg til TRAIL, vi gjennomført state of the art Biacore bindende analyse. Det rekombinante ren DcR3 ble kovalent bundet på flyten chip overflaten og den rene rekombinant TRAIL og LYS (som en positiv kontroll) ble spylt gjennom overflaten ved forskjellige konsentrasjoner. Figur 1 viser binding kurven for TRAIL å DcR3 på ulike konsentrasjoner (1-2048 Nm). Som vist i tabell 1, selv om kontroll likevektskonstanten (
K
eq
) av rekombinant humant LYS for å DcR3 var 13,2 nM, foreningen hastighetskonstant (
K
a
) og disassociation hastighetskonstant (
K
d
) for rekombinant humant TRAIL å DcR3 var 1,97 × 10
4 1 /Ms og 1,04 × 10
-3 1 /s, henholdsvis og
K
eq
var 52,8 nM, noe som indikerer binding mellom TRAIL og DcR3; imidlertid affinitet var lavere enn for LIGHT til DcR3.
Biocore assays, strømningscytometri, Western blot og ELISA-lignende bindingsanalyser ble utført for å bestemme den fysiske vekselvirkning mellom DcR3 og TRAIL. (A) Biacore-analyse. Bindingen kurven av TRAIL å DcR3 ble bestemt ved forskjellige konsentrasjoner (1-2048 Nm). Kontrollen
K
eq
av rekombinant humant LYS for å DcR3 var 13,2 nM, mens
K
eq
av TRAIL å DcR3 var 52,8 nM. (B) Flowcytometri for DcR3 med TRAIL på celleoverflaten. Suspenderte ASPC-1-celler ble inkubert først med PBS, TRAIL (5 ug /ml) uten (kolonne 2) eller med DcR3 (felt 4), rekombinant DcR3 (spor 3) eller muse-anti-TRAIL MAb (1 pg /ml) med DcR3 (felt 5). Deretter ble 5 ug /ml biotinylert anti-DcR3 tilsatt for å bestemme bindingen av DcR3 på celleoverflaten med flowcytometri. (C og D) Flowcytometri for utsatt TRAIL. Gemcitabin ble lagt til ASPC-1 (0-1000 nM) eller MiaPaCa-2 (0-100 nM) celler for å stimulere uttrykk for TRAIL. Celler ble også behandlet med PBS, 10 nM av DcR3 siRNA (for å redusere binding og maskering av TRAIL), eller ytterligere rekombinant DcR3 (for å blokkere aksesse av anti-TRAIL) for å detektere TRAIL ved strømningscytometri. (E og F) colocalization av DcR3 og TRAIL. ASPC-1 celler behandlet uten (som kontroll) eller med 500 nM av gemcitabin (for å forbedre uttrykket av TRAIL) ble farget med anti-TRAIL-PE og anti-DcR3-FITC. Doublestained celler ble vurdert med flowcytometri. (G til L) Immunpresipitasjon og Western blotting for DcR3-TRAIL kompleks. 70-kDa DcR3-TRAIL-kompleks i 100 mL av ren DcR3 og TRAIL-blanding (G og H), lysat (I og J), eller vekstmedium (K og L) av ASPC-1-celler ble tatt med mcAb anti-DcR3 ( G, i, K) eller anti-TRAIL (H, J, L) mcAb og immobilisert med 30 mL av protein A perler. Komplekset av mcAb-DcR3-TRAIL ble eluert med Laemmli-buffer og underkastet Western blotting med biotinylert anti-TRAIL (G, I, K) eller anti-DcR3 (H, J, L) etterfulgt av SA-HRP og ECL detektor. (M og N) Binding konkurranse mellom frie og immobiliserte former for DcR3 og TRAIL. M: Etter 100 ul av 1 ug /ml rekombinant TRAIL eller Fasl ble immobilisert på en ELISA-plate, 1 ug /ml DcR3 ble tilsatt uten (ingen konkurranse gruppe) eller med 10 ug /ml TRAIL eller Fasl (konkurranse gruppe) eller kokt TRAIL eller Fasl (ingen funksjon protein kontroll), etterfulgt av biotinylert anti-DcR3 og SA-HRP og TMB-substrat. N: DcR3 ble immobilisert på en ELISA-plate. TRAIL og Fasl ble brukt som ligander uten eller med kokte eller funksjonelle 10 mikrogram /ml TRAIL eller Fasl i nærvær av DcR3, etterfulgt av biotinylert anti-TRAIL eller anti-Fasl, og SA-HRP og TMB-substrat.
for å finne ut om DcR3 binder seg til TRAIL, forinkubert vi ASPC-1 menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler med eller uten rekombinant DcR3, TRAIL, eller anti-TRAIL mcAb, og deretter farget dem med biotinylert anti-DcR3 fulgt av streptavidin-FITC. Flowcytometri (figur 1B) viste at, mens biotinylert anti-DcR3 og streptavidin-FITC alene resultat i lite farging av DcR3, kan rekombinant DcR3 binder seg til celleoverflaten og påvises med anti-DcR3. På grunn av konkurranse mellom fri TRAIL og membranbundet TRAIL, rekombinant TRAIL redusert DcR3 celleoverflaten bindende. Denne bindingen ble også redusert med preinkubasjon med anti-TRAIL, som blokkerte tilgangen til DcR3 til membranbundet TRAIL. Sammen dataene tyder på at rekombinant DcR3 binder seg til stien på overflaten av ASPC-1 celler.
For å bedre observere samspillet mellom TRAIL og DcR3, brukte vi gemcitabin, en første-linje antipancreatic kreft narkotika og kjent TRAIL inducer, å oppregulere TRAIL. På grunn av medikamentsensitivitet forskjeller, ASPC-1-celler (figur 1C) kreves et 10 ganger høyere nivå av gemcitabin, for å øke ekspresjonen av TRAIL, i forhold til MiaPACa-2-celler (figur 1D). Vi antok at løselig DcR3 ville maskere TRAIL på celleoverflaten; Dermed vil reduksjonen av DcR3 redusere maskering og forbedre fargingen av eksponert TRAIL. For å teste denne hypotesen, benyttet vi den DcR3 siRNA tilnærming. Reduksjonen av DcR3 redusert maskering av TRAIL og økt tilgjengelighet av anti-TRAIL i ASPC-1 celler (figur 1C), mens kontroll siRNA ikke har en slik effekt. Likeledes, hypotese vi at økt DcR3 omgir cellene ville styrke maskering og redusere tilgjengeligheten av anti-TRAIL til TRAIL. Rekombinant DcR3 ble tilsatt til cellene, og dermed forårsaker redusert TRAIL-farging som detektert ved strømningscytometri (figur 1C). Et lignende mønster ble observert i MiaPaCa-2 (Fig 1 D), noe som tyder på at fenomenet maske TRAIL med DcR3 er vanlig i den testede cellelinje. Disse resultatene sterkt støtte ideen om at DcR3 er knyttet TRAIL på celleoverflaten.
For å kunne fastslå bindingen av DcR3 til TRAIL, brukte vi gemcitabin å utløse overekspresjon av TRAIL [19], [20] og lagt rekombinant DcR3. Dobbel farging med anti-TRAIL-PE (rød) og anti-DcR3-FITC viste en forbedret colocalization (Fig 1 F), sammenlignet med kontrollen (Fig 1E), noe som tyder på at DcR3 er fysisk forbundet med TRAIL.
for å bekrefte den fysiske tilknytningen av DcR3 med TRAIL, utførte vi immunoprecipitation og Western blotting. Fasl, en kjent ligand for DcR3, ble anvendt som en positiv kontroll. Resultatene viste at anti-DcR3-fanget DcR3-TRAIL kompleks (ca. 70 kDa MW under mildt denaturerende forhold) kunne påvises ved anti-TRAIL i en blanding av ren rekombinant DcR3 og TRAIL (Fig 1G), lysat (Fig 1I) eller betinget media (fig 1K) av ASPC-1 celler som uttrykte både DcR3 og TRAIL. Likeledes kan den anti-TRAIL-fanget DcR3-TRAIL kompleks bli oppdaget av anti-DcR3 i de samme 3 innstillinger (fig 1 H, 1 J, og 1L). Som et side-ved-side positiv kontroll, Fasl oppviste et mønster som ligner på den for anti-Fasl-fanges DcR3-Fasl kompleks påvist ved anti-DcR3 (figur 1G, 1I, og 1K), som sterkt underbygger at TRAIL og Fasl bind til DcR3. Spesielt, DcR3-TRAIL kompleks dannet ikke bare i et rent protein tilstand (fig 1G og 1H), men også i en naturlig tilstand i den membranbundne form (i lysatet, fig 1I og 1J) og i den sekretoriske form (i media fig 1K og 1L). Bånd DcR3-TRAIL-kompleks i media var mye finere enn båndene i lysat, noe som indikerer at komplekset var bundet til membranen. Disse resultatene var konsistente med de som ble oppnådd gjennom flowcytometri.
For ytterligere å bekrefte sammenslutning av DcR3 med TRAIL, vi utført en ELISA-lignende analyse. Når TRAIL eller Fasl ble belagt på ELISA-plater, kan bindingen av DcR3 til disse ligandene bli detektert med anti-DcR3 og redusert ved tilsetning av fri rekombinant TRAIL eller Fasl, som konkurrerte med DcR3 for den immobiliserte TRAIL eller Fasl (Fig 1 M) . I kontrast, når DcR3 ble belagt på ELISA-plater, den rekombinante TRAIL eller Fasl bundet til immobilisert DcR3 og ble oppdaget av anti-TRAIL eller anti-Fasl, som også ble delvis blokkert av fri form av DcR3 (Fig 1 N).
i alle tester ble den Fasl-DcR3 kompleks tjente som en side-ved-side positiv kontroll og viste et mønster som ligner på den for DcR3-TRAIL-komplekset (fig 1G, 1I, 1K. 1L og 1M), sterkt støtte som TRAIL er faktisk en ny ligand av DcR3.
Endring av DcR3 berørte gemcitabin-indusert apoptose
for å studere den biologiske funksjonen til DcR3 i kreft i bukspyttkjertelen, målte vi nivået DcR3 av en kvantitative ELISA for DcR3 [21] i ASPC-1 og MiaPaCa-2 kreft i bukspyttkjertelen celler. Sammenlignet med SW480, en human kolon adenokarsinom-cellelinje som er kjent for å uttrykke høye nivåer av DcR3, i forhold til andre 13 cellelinjer [22], de ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler hadde en enda høyere nivå av DcR3 (Fig 2 A), som er i overensstemmelse med andre rapporter [23], [24]. Både DcR3 og TRAIL uttrykkes på et høyt nivå på de samme celler, noe som tyder på at antiapoptotic og proapoptotiske molekyler balanseres på et høyt nivå for å motvirke hverandre. Den naturlige ekspresjon av høye nivåer av begge molekylene gjør undersøkelsen av deres interaksjon mye enklere.
(A) Ekspresjon av DcR3 i ASPC-1, MiaPaCa-2, og SW480-celler (som positiv kontroll). Den DcR3 nivå i 100 ul kondisjonert medium fra celler som ble dyrket i 6-brønners plater (4 ml) ble målt med en ELISA. (B og C) Gemcitabin redusert DcR3 uttrykk. ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler ble behandlet med gemcitabin ved de angitte konsentrasjoner i 48 timer. Den DcR3 nivået ble målt i 100 ul av mediet fra hver gruppe. (D) siRNA slått ned DcR3 uttrykk. Celler (1 × 10
5) i seks-brønns plater ble transfektert med 10 nm DcR3 siRNA eller kontroll siRNA i Transfectin LTX (6,25 mL /brønn). Etter 24 timer ble DcR3 i kultur media målt med en ELISA.
For å finne ut det interaktive effekten av DcR3 og TRAIL på kreftceller, gemcitabin og siRNA for DcR3 ble brukt til å regulere nivået av DcR3. De ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler ble behandlet med forskjellige doser av gemcitabin i 48 timer, og nivået av DcR3 i mediene ble målt med en ELISA. Resultatene viste at gemcitabin redusert DcR3 på en doseavhengig måte i begge cellelinjer (Fig 2B og C). En tilsvarende reduksjon ble observert med siRNA (Fig 2D).
Hvis funksjonen av gemcitabin-redusert DcR3 er å tippe balansen mot apoptose, deretter tillegg av DcR3 bør reversere gemcitabin-indusert apoptose. Således ble ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler ble behandlet med forskjellige doser av gemcitabin, med eller uten rekombinant DcR3 i 48 timer, og deretter de apoptotiske celler ble målt med Annexin V-farging. Resultatene viste at 5-8% av cellene apoptotiske i kontrollgruppen, som økte til omtrent 30% i gemcitabin-gruppen. Dette gemcitabin-indusert apoptose ble redusert ved tilsetning av rekombinant DcR3 (0, 0,5, 1 og 2 ug /ml) på en doseavhengig måte (figur 3A og 3B). På lignende måte ble det gemcitabin-induserte økningen av kaspase 3 aktivitet reverseres ved DcR3 (figur 3C og 3D). Disse resultatene antyder at DcR3 spiller en kritisk rolle ved inhibering av apoptose, og at den gemcitabin-induserte reduksjon av DcR3 kan være relatert til dets antitumoraktivitet.
Gemcitabin ble tilsatt til mediet av ASPC-en (500 nM) eller MiaPaCa-2-celler (50 nM) inkubert med 0, 0,5, 1, eller 2 ug /ml av rekombinant DcR3 i 24 timer. Cellene ble deretter underkastet strømningscytometri for sub-G1 fraksjon (A og B) eller en enzymanalyse for kaspase 3 aktivitet (C og D). Gemcitabin-utløst apoptose ble redusert med tillegg av DcR3 på en doseavhengig måte (
P
0,01).
nedregulering av DcR3 med siRNA fremmet TRAIL-mediert apoptose i vitro
for å teste om avsløring av TRAIL kunne øke tilgjengeligheten til sin reseptor og forbedre denne død vei, undersøkte vi effekten av DcR3 på TRAIL-mediert apoptose. DNA-fragmentering (sub-G1) analysen viste at når ASPC-1 celler ble behandlet med Fasl eller LIGHT pluss kontroll siRNA eller DcR3 siRNA, gjorde apoptose ikke øke betydelig. Imidlertid, når de ble behandlet med TRAIL og DcR3 siRNA, ASPC-1 celler viste en dramatisk økning i apoptose, sammenlignet med celler behandlet med TRAIL pluss kontroll siRNA (figur 4A). MiaPACa-2-celler viste en lignende mønster (fig 4C). Den forbedrede apoptose ble ytterligere bekreftet ved øket spaltes PARP, som bestemt ved Western blotting (fig 4B og 4D). Resultatene tyder på at redusert DcR3 kan i stor grad forbedre proapoptotiske effekten av TRAIL i disse 2 bukspyttkjertelkreft cellelinjer (i forhold til Fasl og LYS), mens DcR3 brukes av disse cellene til å motvirke proapoptotiske effekten av TRAIL.
ASPC-1 eller MiaPaCa-2-celler ble transfektert med 10 nM av kontroll siRNA eller DcR3 siRNA, respektivt. Etter 24 timer ble cellene behandlet med rekombinant Fasl, LYS, eller TRAIL (100 ng /ml for ASPC-en og 20 ng /ml for MiaPaCa-2-celler) i 24 timer. Celler ble høstet og underkastet strømningscytometri for sub-G1 fraksjon (A og C), eller Western blotting for spaltede PARP (B og D). DcR3 siRNA betydelig forbedret TRAIL-indusert apoptose (
P
0,05).
DcR3 påvirket gemcitabin-mediert apoptose in vitro
DcR3 siRNA og gemcitabin redusert ekspresjonsnivået av DcR3 (figur 3 og 4). Vi ønsket å bestemme om ytterligere nedregulering av DcR3 via en kombinasjon av disse 2 faktorene kan forsterke proapoptotiske effekt, sammenlignet med en enkelt faktor alene. Etter at cellene ble behandlet med enten siRNA eller gemcitabin alene eller i kombinasjon, ble DNA-fragmentering og spaltet PARP målt. Resultatene viste at mens gemcitabin alene skyldes økt apoptose (figur 5A og 5C) og spaltet PARP-nivåer (figur 5B og 5D), dens kombinasjon med siRNA ytterligere økt apoptose og spaltes PARP-nivåer (figur 5). Uten proapoptotiske ligand med å binde og motvirke, DcR3 siRNA alene hadde ingen effekt; men når TRAIL ble oppregulert ved gemcitabin, reduksjon av DcR3 redusert maskering av TRAIL, og dermed fremme apoptose. ASPC-1 eller MiaPaCa-2-celler ble transfektert med 10 nM av kontroll siRNA eller DcR3 siRNA, henholdsvis
. Etter 24 timer ble cellene behandlet med gemcitabin (250 eller 25 nM) i 24 timer. Celler ble høstet og underkastet strømningscytometri for sub-G1 fraksjon (A og C), eller Western blotting for spaltede PARP (B og D). Kombinasjonen av DcR3 siRNA og gemcitabin forbedret i betydelig grad den proapoptotiske virkning.
Disse resultatene er i overensstemmelse med de i figur 3. I forbindelse med de resultater som er vist i figurene 1 og 4, er de data tyder på at binding DcR3 til TRAIL reduserer TRAIL-indusert apoptose og beskytter kreftceller, noe som kan forklare motstanden av svulster i TRAIL behandling.
nedregulering av DcR3 forbedret kjemoterapeutiske effekt på tumorvekst in vivo
Oppmuntret av lovende
in vitro
resultater, ønsket vi å finne ut om reduksjon av DcR3 kan forsterke virkningen av cellegift
in vivo.
ASPC-1 celler ble transfektert med et pattedyr ekspresjonsvektor som inneholdt siRNA til knockdown ekspresjonen av DcR3 og en kassett for G418-seleksjon. De sammenslåtte vektor mock-transfeksjon celler (som kontroll), eller DcR3 siRNA transfekterte celler med lav DcR3 uttrykk (bekreftet med ELISA) ble injisert i nakne mus, og de etablerte tumorer (60 mm3) ble deretter behandlet med gemcitabin.
