Abstract
Immun flukt og metastasering er kjennemerkene til flere typer kreft, inkludert blærekreft. En av de som er involvert i disse prosessene mekanismene har vært knyttet til indoleamine 2,3-dioksygenase (IDO). Selv IDO er klassisk anerkjent for sin immunmodulerende eiendom, har det presenteres nonimmunological effekter i noen svulster. TGF-β1 er antatt å bidra til carcinoma utvikling av modulerende immunossupressive molekyler, inkludert IDO. I tillegg induserer TGF-β1 den epiteliale-mesenkymale overgang (EMT), som er et kritisk trinn i den tumor invasivitet og metastase. Vi har undersøkt rollen til MT og IDO modulasjon i induksjon av EMT av TGF-β1 i T24 humane blære-carcinomceller. Når T24-celler ble inkubert med IDO inhibitor (MT, 1-metyl-D-tryptofan), med TGF-β1, og med MT + TGF-β1, ble det observert en signifikant reduksjon av IDO ekspresjon og aktivitet. I tillegg ble nedregulering av e-cadherin og oppregulering av N-cadherin og EMT transkripsjonsfaktorer som induseres av behandlinger, noe som bekrefter induksjon av EMT. siRNA-mediert knockdown av IDO redusert e-cadherin uttrykk, men hadde ingen virkning på EMT transkripsjonsfaktorer. I bunnen av viklet assay ble forsterket overføringsprosessen intensiveres når cellene ble inkubert med MT + TGF-β1. Disse effektene var assosiert med en sterk inhibering av Akt-aktivering. Etter inokulering av T24-celler under nyrekapselen på Balb /c naken, cellene var positive for IDO i sentrum av cellen infiltrere, blir negativ i periferien, hvor EMT er høy. Som konklusjon, inhibering av IDO av TGF-β1 og MT er forbundet med EMT i T24 humane blære-carcinomceller. MT har poten effekt i TGF-β1-indusert EMT, uavhengig av IDO. Dette nonimmunological effekten av MT bør vurderes hvis IDO er målet å unngå immun flukt i blærekreft
Citation. Brito RBO, Malta CS, Souza DM, Matheus LHG, Matos YST, Silva CS, et al. (2015) 1-metyl-D-Tryptofan Potenserer TGF-β-indusert Epitelial-Mesenchymale Overgang i T24 Menneskelig blærekreft celler. PLoS ONE 10 (8): e0134858. doi: 10,1371 /journal.pone.0134858
Redaktør: Michael Platten, Universitetssykehuset i Heidelberg, Tyskland
mottatt: 28 januar 2015; Godkjent: 14 juli 2015; Publisert: 12. august 2015
Copyright: © 2015 Brito et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av São Paulo Research Foundation (FAPESP), gi 2012 /04423-0, https://www.fapesp.br/.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i urinblæren er den vanligste kreftformen i urinveiene [1]. Selv om den vanligste formen av human blære krefttype er ikke-muskel-invasiv (70% til 80%), 30% til 50% av disse tilfellene fremdriften til en muskel-invasiv form etter gjentatte resections, som til slutt fører til kreft-spesifikk død og metastase [2].
Flere mekanismer har vært implisert i tumor invasivitet og metastase, inkludert den epiteliale-mesenkymale overgang (EMT). I denne fremgangsmåten forutsetter en polarisert epitelcelle en mesenkymale fenotype, noe som fører til et tap av cellulær adhesjon til basalmembranen, aktivering av motilitet og invasivitet, og produksjon av ekstracellulære matrise-nedbrytende enzymer [3]. Flere molekyler er involvert i initieringen av EMT, inkludert TGF-β superfamilien proteiner. TGF-β1 er en viktig induserer EMT i flere forskjellige typer av tumorer [4], inkludert blærekreft [5]. Visse genetiske variasjoner og økte plasmanivåer av TGF-β er potente prediktorene for blærekreft risiko [6,7].
Indoleamine 2,3-dioksygenase (IDO) er et enzym som katalyserer degradering av aminosyren tryptofan, noe som fører til opphopning av tryptofan metabolitter, for eksempel kynurenine. Som beskrevet av Munn et al., Har IDO en rolle i maternal-føtal grensesnitt og funksjoner for å beskytte fostre mot mors immunsystemet [8]. Deretter IDO er blitt undersøkt for anvendelse som en effektiv immunmodulerende molekyl. Fordi IDO er produsert av mange celletyper av immunsystemet, inkludert dendrittiske celler, makrofager, og regulatoriske T-celler, og IDO vært implisert i immun-medierte forstyrrelser, slik som allograft-forkastelse [9], autoimmunsykdommer [10] og unnslippe antitumorimmunitet i kreft [11]. Når det gjelder kreft, er IDO-aktivitet til stede i mange humane krefttyper, så vel som tumor-drenerende lymfeknuter [11]; imidlertid rollen IDO i tumorvekst fortsatt dårlig forstått. Mens IDO ekspresjon er korrelert med en mindre gunstig prognose for mange typer kreft, inkludert kolorektal [12], livmorhals [13], endometrial [14], bryst [15], melanom [16], eggstokk [17], og lungekreft [18], IDO uttrykk er også assosiert med tilbakefall overlevelse av hepatocellulære pasienter [19] og langtidsoverlevelse av pasienter med nyrekreft [20]. Selv om det er en uenighet om rollen til IDO i kreft, har molekyler som kan modulere IDO-mediert trasé blitt sett på som lovende for kreftbehandling. I denne sammenheng har en-metyl-D-tryptofan, en kompetitiv inhibitor av IDO, blitt intensivt studert som anticancer-middel. Foreløpig ble foreningen av 1-metyl-D-tryptofan (MT) med docetaxel brukes i en fase I klinisk studie med pasienter med metastaserende solide svulster [21]. Imidlertid kan dette molekylet handle uavhengig av IDO aktivitet [22], samt som tryptofan å regulere mTOR pathway [23].
IDO uttrykk har blitt funnet ikke bare i tumor infiltrere immunceller og tumor drenering lymfeknuter, men også i neoplastiske celler. I blærekreft, produserer humane T24 overgangs carcinoma cellelinje IDO konstitutivt i kultur [24], selv uten medvirkning av immunsystemet, som fører til den hypotese at IDO kan ha en rolle i ikke-immune prosesser. LEVINA et al., Demonstrerte at oppregulering av IDO i brystkreftceller økt celleproliferasjon og apoptose ble redusert på en måte som var uavhengig av de immunologiske virkninger av IDO [25].
Interessant induserer TGF-β en tolerogene fenotype i immunogene dendrittiske celler, og denne effekten er mediert av IDO gjennom aktivering av PI3K /Akt sti [26]. Fordi TGF-β induserer EMT i T24 blære-carcinomceller [27, 28], hypotese vi at modulering av IDO kan være assosiert med TGF-β i induksjon av EMT i T24 karsinomceller. I denne studien analyserte vi effekten av MT og siRNA-mediert knockdown av IDO i TGF-β-indusert EMT i T24 blære carcinoma celler.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneskelige blærekreft T24 celler (HTB-4; American Type Culture Collection-ATCC, Manassas, VA, USA) ble kjøpt fra cellen bredden av føderale universitetet i Rio de Janeiro. T24-celler ble dyrket i McCoys 5A medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) supplementert med 10% føtalt bovint serum og penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og holdt ved 37 ° C med 5% CO
2.
for å analysere effekten av TGF-β1 på IDO uttrykk, T24 celler ble sådd i 6-brønners plater (1X10
5 celler per brønn). Cellene ble inkubert med 1 ng /ml, 5 ng /ml eller 10 ng /ml TGF-β1 (R medium inneholdende 1 mM metyl-tryptofan (MT, 1-metyl-D-tryptofan, katt 452 483, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); medium inneholdende TGF-β1 (5 ng /ml); og medium inneholdende MT pluss TGF-β1. Ved slutten av 48 timer ble supernatanter oppsamlet for kynurenine måling, og de cellulære monolagene ble trypsinert for RNA-ekstraksjon. Dette eksperimentet ble gjentatt for protein isolasjon.
Små interfering RNA (siRNA) transfeksjon
For å knockdown endogen IDO, T24 celler ble transfektert med siRNA for IDO (Silencer Velg inventoried 4.392.420, Ambion, Carlsbad, CA) eller med en ikke-måls kontroll siRNA for transfeksjon kontroll (Silencer Velg negativ kontroll inventoried 4.390.843, Ambion, Carlsbad, California), ved hjelp av Lipofectamine 3000 Reagens (Invitrogen, Carlsbad, California). I korthet ble cellene dyrket i 6 brønners plater, og deretter ble holdt i serumfritt McCoy medium inneholdende (per brønn) 1 ug av siRNA, 5 ul P3000-reagens, og 5 ul av Lipofectamine 3000 Reagent, i løpet av 24 timer. Etter transfeksjon, ble mediet fjernet og cellene ble dyrket i 24 timer i McCoys 5A medium supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO
2. Etter denne utvinning tid, ble cellene inkubert med TGF-β1 (5 ng /ml, i 48 timer, i serumfritt McCoy medium), nøyaktig som tidligere beskrevet. De følgende fire betingelser i tre eksemplarer ble utført: T24-celler tidligere transfektert med kontroll siRNA (Si-Control), uten TGF-β 1; T24 celler tidligere transfektert med IDO siRNA inkubert uten TGF-β 1 (siIDO); T24-celler som tidligere transfektert med kontroll siRNA inkubert med TGF-β 1 (TGF-β); og T24 celler tidligere transfektert med IDO siRNA inkuberes med TGF-β1 (siIDO + TGF-β).
RT-qPCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp PureLink RNA Mini Kit (Ambion Inc, Carlsbad , CA) ifølge produsentens instruksjoner, og den første tråd cDNA ble syntetisert ved hjelp av M-MLV (Promega, Madison, WI) etter DNase-behandling (Promega, Madison, WI). Real-time PCR ble utført ved hjelp av Power SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA). Spesifikke primere for TBP (
TATA-boks-bindende protein
; sende 5′-TTCGGAGAGTTCTGGGATTGTA-3 «og 5′-revers TGGACTGTTCTTCACTCTTGGC-3′, tilgangsnummer NM003194), IDO (forover 5»-GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3 «og reversere 5»-ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3 «; sjonsnummer NM002164), E-cad (forover 5′-GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3′ og omvendt 5»-ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3 «; sjonsnummer Z18923), N-cad (forover 5»-TGCCCGGTTTCATTTAGGGG -3 «og omvendt 5′-TCCCTCAGGAACTGTCCCAT-3′; sjonsnummer X57548), TWIST (forover 5»-AGAGATGCAACTAAGCCCTCT-3 «og omvendt 5′-AAGCAGCTACTGACAGGCAC-3′; sjonsnummer Y11177), Snail (forover 5»-ACCACTATGCCGCGCTCTT -3 «og revers 5′-GGTCGTAGGGCTGCTGGAA-3′, tilgangsnummer NM005985), og Slug (forover 5»-TGTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3 «og 5′-revers GACCCTGGTTGCTTCAAGGA-3», tilgangsnummer NM003068) ble anvendt. Triplikat for hver prøve ble oppvarmet ved 95 ° C i 5 minutter og deretter underkastet 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing ved 60 ° C i 60 sekunder og forlengelse ved 60 ° C i 60 sek. Disse reaksjonene ble utført ved anvendelse av en Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Ca, USA). Etter real-time PCR, syklusen terskel (C
t) ble bestemt for husholdningsgenet (TBP) samt målgener ved hjelp av auto baseline og automatisk terskel forhold. Normaliserte genuttrykk data, ved hjelp ΔΔC
t (A C
t referanse- A C
t mål) og formel 2
-ΔΔCt, ble benyttet for videre analyse.
Western blot
Western blot analyse ble utført for å analysere IDO uttrykk og Akt /Pakt signalveien aktivering. I korthet, ble totalt protein ekstrahert fra T24 celler ved lysis buffer (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,001% Triton X-100, 0,1 mM AEBSF, 0,08 uM aprotinin, 4 uM bestatin, 1,4 uM E- 64, 2,0 mikrometer leupeptin og 1,5 mikrometer pepstatin). Ett hundre mikrogram av totalt protein, ble denaturert og applisert på en 12% natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamide elektroforese gel og så overført til en nitrocellulosemembran ved halvtørr elektroblotting (Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Etter blokkering med ikke-fettholdig melk, ble membranene inkubert med 1: 250 muse-anti-human IDO (MAB5412; Merck Millipore, Billerica, Massachusetts) eller 1: 1000 kanin-anti-human-fosfo-Akt (MAB 2965, Cell Signaling Technology Inc ., Danvers, MA). Etter påvisning av forsterket kjemiluminescens (ECL-deteksjon system; Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) ble anti-IDO og anti-fosfor-Akt membraner strippet med stripping buffer (62,5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 0 , 1 M 2-merkaptoetanol) og inkubert med 1: 5000 muse-anti-human β-aktin (A1978; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 1: 1 000 kanin-anti-human Akt (MAB 4685, Cell Signaling Technology Inc., Danvers, Massachusetts), henholdsvis. Deteksjon, 1: 5000 geite-anti-kanin IgG HRP-konjugert (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 1: 5000 geit-anti-mus IgG HRP-konjugert (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) sekundære antistoffer ble anvendt.
Kynurenine måling
HPLC ble utført for å måle kynurenine i cellekultursupernatanter. Prøvene ble avproteinisert ved sentrifugering ved 5000 g (15 min ved 4 ° C) med 10% trikloreddiksyre (1: 1, v /v). Parallelt ble en standardkurve konstruert med følgende konsentrasjoner: 0,5 pM, 1,0 pM, 2,0 pM, 4,0 pM, 8,0 pM, og 16,0 um. Etter sentrifugering, ble supernatantene og standardene ble filtrert gjennom et 0,22 um sprøytefilter lastet og løses med en mobil fase av acetonitril pluss natrium-acetat-buffer (4:96, v /v), pH 4,7. En forkolonne av 12.5X4.6 mm og en kolonne av 250X4.6 mm (5 mikrometer; Agilent Hypesil ODS, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ble brukt. Toppen representerer kynurenine ble oppdaget med ChemStation Agilent programvare (G2170AA, Agilent Technologies, Santa Clara, USA).
Ripe sår migrasjon og Transwell invasjons analyser
For ripe såret analyser, T24 cellene ble sådd ut i 24-brønners plater (5×10
4 per brønn) og dyrket til å nå 80% konfluens (24-30 timer). Celler ble opprettholdt i serumfritt McCoy 5A medium i 24 timer og deretter behandlet med følgende (triplo): MT (1 mM), TGF-β1 (5 ng /ml), og TGF-β1 + MT. -Celler opprettholdt i serumfritt medium utgjorde kontrollen. Etter en 24 timers inkubering med behandlingen ble supernatantene fjernet og friskt medium ble tilsatt (10% FBS). En skrape per brønn ble utført ved å bruke en 200 ul pipettespiss og fire bilder pr brønn ble tatt ved 40X forstørrelse i henhold til et invertert mikroskop (Ti-S; Nikon Corp., Tokyo, Japan). Etter tre timer ble det flere bilder ervervet. Hver ripe sår område ble beregnet ved hjelp av ImageProPlus 6.0 programmet (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD).
Transwell invasjons analyser ble også utført. Transwells ble utstyrt med membraner (6,5 mm diameter, 8,0 um porestørrelse, Corning Inc., New York), belagt med BD Matrigel basalmembran Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA) ved en konsentrasjon på 3 mg /ml, og deretter inkubert ved 37 ° C i 2 timer. Celler ble behandlet som beskrevet for skrape viklet analyse, og deretter sådd på toppen av Matrigel belegg med serumfritt medium (triplo). Cellene ble tillatt å migrere i 6 timer og 24 timer mot et kammer som inneholder McCoys medium supplert med 20% føtalt bovint serum. Etter inkubasjon ble membranene fiksert i metanol og farget med hematoksylin. Antallet migrerte celler ble bestemt under mikroskop forstørrelse (400X).
Animal modell for invasjonen analyse
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Nove de Julho Universitetet Institutional Animal Care og bruk komité.
Tre BALB /c naken mus (5-6 uker gamle) ble brukt. Musene ble opprettholdt i individuelt ventilerte bur i henhold filtrert luft (ALESCO, Capivari, São Paulo, Brasil) med fri tilgang til vann og mat. Intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg /kg; Ketamin-S, São Paulo, Brasil) og xylazin (10 mg /kg, Rompun, Bayer, Leverkusen, Tyskland) ble benyttet for å oppnå generell anestesi. En 10 mm lumbar snitt ble utført for å få tilgang til venstre nyre. T24-celler (1X10
6) ble resuspendert i 10 mikroliter PBS og inokulert under nyrekapselen ved hjelp av en 21G-nål forbundet med en 100 ul Hamilton-sprøyte (Hamilton Company, Reno, Nevada). Etter nøye inokulering ble kapsel snittet senere cauterized. Mus ble fulgt daglig i 28 dager. På 28
th dag, ble musene bedøvet med ketamin /xylazin, etterfulgt av laparotomi og torakotomi å verifisere metastase. For hver mus, ble en midcoronal seksjon av venstre nyre løst i Duboscq-Brasil løsning i 60 minutter etterfulgt av post-fiksering i en bufret 10% formaldehydoppløsning inntil parafin innebygging. Seksjoner (3 mikrometer tykke) ble farget med hematoksylin og eosin og deretter brukt for immunhistokjemi. Histologisk analyse ble brukt for å bekrefte tilstedeværelse av T24 celler i subkapsulære rom og nyreparenchymet.
Immunhistokjemi
Parafin-snitt ble underkastet mikrobølgebestråling i citrat-buffer for å forbedre antigen gjenfinning. Biotin blokkeringsfrie bremser (X0590, Dako Co, Danmark) og ikke-fett melk blokkering ble brukt før primært antistoff inkubasjon. Mus anti-human IDO (MAB5412; Merck Millipore, Billerica, Massachusetts) (1:25) ble anvendt som det primære antistoff for analyse av IDO uttrykk. For å fullføre sandwich, ble deler inkubert med LSAB + System-HRP reagenser (K0690, Dako Co, Danmark). Til slutt ble DAB substrat-kromogen anvendes for å fullføre reaksjonen (K346811; Dako Co., Danmark)
Statistical Analysis
Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM.. For parametriske data ble enveis analyse av varians med parvise sammenligninger utført i henhold til Newman-Keuls formulering. For ikke-parametrisk data, ble Kruskal-Wallis eller Wilcoxon brukt. En p-verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
TGF-β1 og MT hemme IDO uttrykk
Inkubasjon av T24 celler med TGF-β1 betydelig redusert IDO uttrykk (fig 1), for alle testede konsentrasjoner. Som illustrert i figur 2A, behandling med MT og MT + TGF-β1 betydelig redusert ekspresjon av IDO i T24-celler (relativ ekspresjon av 0,16 ± 0,18 vs 1,00 ± 0,01). Denne effekten ble også observert i resultatene av Western blotting for IDO-proteinet (figur 2B). For å bedømme IDO-aktivitet, ble kynurenine målt i supernatanten av de T24 celler ved hjelp av HPLC. Konsentrasjonen av kynurenine ble markert redusert etter inkubering med MT, TGF-β1, og MT + TGF-β1 (0.59 ± 0.12 uM, 0,29 ± 0,02 uM, og 0,38 ± 0,06 uM, respektivt, sammenlignet med 3,45 ± 0,16 uM i kontroll ; p . 0,0001) (fig 2C)
IDO uttrykk er nedregulert av TGF-β i T24 celler
(A) IDO uttrykk ved real-time PCR, (B. ) Western blotting for IDO, og (C) IDO aktivitet vurderes av kynurenine måling i supernatanten.
MT forsterker EMT genuttrykk
En betydelig reduksjon ble observert i ECAD uttrykk med MT og TGF-ß1 behandlinger (figur 3A). I motsetning til dette, Ncad ekspresjon betydelig øket med TGF-β1 behandling (figur 3B), en effekt som ble forsterket ved kombinasjon av TGF-β1 med MT (mer enn 8 ganger vs. TGF-β1 alene). I tillegg ble ekspresjon av EMT-assosierte transkripsjonsfaktorer (Twist, snegle og Slug) økte med TGF-β1, og behandling med TGF-β1 i kombinasjon med MT intensivert denne effekten (fig 3C, 3D og 3E).
Relative mRNA nivåer av (A) E-cadherin (epithelial markør), (B) N-cadherin (mesenchymale markør), og (CE) EMT-assosiert transkripsjonsfaktorer (Twist, Snail og Slug). Association of MT og TGF-β1 forsterkes EMT i T24 celler, mink E-cadherin uttrykk og oppregulering spole gener av EMT. * P 0,05 vs. kontroll;
# p 0,05 vs. MT;
† p 0,05 vs. TGF-β
siRNA-mediert knockdown av IDO og uttrykk for EMT markører
Bruk av siRNA var effektivitet i å kneble IDO genuttrykk. . Som vist i figur 4, siIDO betydelig redusert ekspresjon av IDO i T24-celler. En betydelig reduksjon av IDO-ekspresjon ble observert etter stimulus med TGF-β1, effekt som ble ytterligere forsterket når den er assosiert med siIDO (figur 4). Når det gjelder EMT markører, siIDO betydelig redusert ECAD uttrykk, og dens tilknytning til TGF-β1 forsterker denne effekt ble imidlertid ikke statistisk signifikans funnet (figur 5A). Selv om siIDO viste effekt på ECAD uttrykk, siIDO hadde ingen effekt i uttrykket av N-cadherin og EMT transkripsjonsfaktorer (Twist, snegle, og Slug) (figur 5).
En negativ kontroll-siRNA ble brukt for si-kontroll og TGF-p-betingelser. En betydelig reduksjon av IDO-ekspresjon ble observert i siIDO celler, og i TGF-p-stimulerte celler. Foreningen av siIDO og TGF-β induserte en mer uttalt reduksjon av IDO uttrykk.
Relative mRNA nivåer av (A) E-cadherin (epithelial markør), (B) N-cadherin (mesenchymale markør), og (CE) EMT-assosiert transkripsjonsfaktorer (Twist, Snail og Slug). siRNA-mediert knockdown av IDO var effektive i å redusere E-cad uttrykk, og dens tilknytning til TGF-β forsterkes denne virkning. Imidlertid knockdown av IDO alene hadde ingen effekt på N-cad ekspresjon, så vel som i uttrykket av EMT-transkripsjonsfaktorer. Bare TGF-β handlet induserende uttrykk for N-cad og EMT-transkripsjonsfaktorer, og sin tilknytning til siIDO endret ikke denne effekten. * P 0,05 vs. kontroll;
# p. 0,05 vs. MT
Ripe såret og Transwell invasjons analyser
I ripe sår analysen, migrasjon kapasitet T24 celler ble evaluert av å måle arealet som opptas av migrerende celler. Som vist i figur 6, 3 timer etter introduksjon av skrape såret, MT og TGF-β1 induserte en raskere vandring av T24-celler sammenlignet med ubehandlede celler. Dette forsterkes migreringsprosess intensivert når cellene ble inkubert med TGF-β1 plus MT (figur 6A og 6B).
(A) Bilder ble tatt ved 40X forstørrelse under en invertert mikroskop, tre timer etter ripedannelse. (B) lukking av sår var betydelig raskere i MT + TGF-β i forhold til kontroll.
T24 celle invasjon ble undersøkt ved hjelp av rekonstituert Matrigel i Transwell kamre. Etter 6 timers inkubering ble det observert økt invasjon aktivitet når cellene ble inkubert med TGF-β1 plus MT, men resultatet var ikke statistisk signifikant (figur 7). Etter 24 timers inkubering, ble ingen observerbar forskjell påvises mellom de forskjellige gruppene (figur 7).
Selv om en større grad av invasive kapasitet ble observert i T24-celler etter 6 timer med TGF-β og MT + TGF β behandling, ikke statistisk signifikans ble observert. Etter en migrering periode på 24 timer, ble ingen forskjell.
Akt aktivering
For å analysere Akt pathway aktivisering, ble Western blotting eksperimenter utført. Som vist i figur 8, inkubering av T24 celler med MT, TGF-β1 eller MT + TGF-β1 fremmet robust inhibering av Akt-aktivering.
PI3K /Akt sti aktivering ble vurdert ved Western blotting for Akt og fosfo Akt i T24 cellelysatene. Etter 48 timers inkubering med MT, TGF-β, og MT + TGF-β, et redusert nivå av fosfo-Akt ble observert. Hemming av PI3K /Akt veien er forbundet med EMT i T24 celler.
In vivo
analyse
For å analysere IDO uttrykk
in vivo
, T24 celler ble inokulert under nyrekapselen på nakne mus. Fire uker etter inokulering, identifiserte vi T24-celler under nyrekapselen. Videre ble T24 celler funnet infiltrere nyreparenchymet mot nyremargen (S1 fig). Immunhistokjemisk analyse av IDO uttrykk avslørte at subcapsular og infiltrere T24 celler var positive for IDO. Med uttrykket av IDO ble spesifikt lokalisert til midten av cellen infiltrat (figur 9).
ido-positive celler ble funnet i midten infiltrat (pil), mens ido-negative celler ble hovedsakelig funnet i periferien av infiltrat (pilspiss). IDO farging ble ikke observert i nyreparenchymet (stjerne).
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi den ikke-immunologiske rolle MT og IDO i kreft progresjon og formidling , spesielt i EMT. Blærekarsinom T24 celler som konstitutivt uttrykker IDO, selv i fravær av en immunsystem. Vi var i stand til å indusere EMT i T24 celler med TGF-β1, og denne effekten korrelerer med nedregulering av IDO. Når vi bruker MT eller IDO siRNA, ble EMT forsterkes, spesielt av MT.
EMT er en prosess hvor epitelceller skaffe en invasiv fenotype, noe som fører til en systemisk spredning av de ondartede cellene. Under EMT er spesifikke gener uttrykkes som til slutt fungere for å deregulere intracellulære biokjemiske pathways, noe som bidrar til etablering av en ondartet fenotype. I vår studie, vurderte vi prosessen med redusert uttrykk av E-cadherin fulgt av økt N-cadherin uttrykk til en prosess som kalles «cadherin switching,» karakter EMT i T24 celler [29]. EMT spiller en viktig rolle i blærekreft, hvor motilitet, invasjon og anti-apoptotiske mekanismer kreves for metastasering [30].
TGF-β1 er en potent induser av EMT i visse typer vev, inkludert blære kreft. T24-celler uttrykker TGF-β reseptor 1, og siRNA-baserte hemming av TGF-β receptor en undertrykker motilitet og invasivitet av disse cellene [27]. I vår studie, T24 celler kjøpt mesenchymale egenskaper, for eksempel mesenchymale markør uttrykk og bevegelighet, etter TGF-β1 stimulans. Interessant, TGF-β1 behandling indusert EMT og hemmet IDO ekspresjon i T24-celler. I tillegg, MT, som også redusert IDO uttrykk, intensiverte TGF-β-drevet EMT.
siRNA-mediert knockdown av IDO betydelig redusert E-cadherin uttrykk, men mesenchymale markører ble ikke endret. Fordi MT betydelig økt ekspresjon av mesenchymale markører Disse resultatene indikerer at IDO pathway eventuelt deltar i EMT av T24-celler, men MT har en effekt poten TGF-β1-indusert EMT uavhengig av IDO. Metz et al viste at MT har effekt på dendrittiske celler uavhengig av IDO induserer mTOR pathway (Metz). Det er viktig å merke seg at mTOR er sterkt assosiert med EMT i blærekreft [31]. Det er mulig at MT formidler mTOR banen i T24 celler, men denne mekanismen ble ikke vurdert i vår studie.
Vår studie er den første til å undersøke forholdet mellom TGF-β1 og IDO i T24 celler. Men det finnes studier som viser at TGF-β1 kan modulere IDO uttrykk i visse typer celler. Yuan et al. vist at mens IDO ekspresjon kan bli indusert i humane fibroblaster etter stimulering med INF-y, TGF-β1 opphever denne virkning uten å påvirke INF-y-ekspresjon [32]. I motsetning til TGF-β1 indusert IDO ekspresjon i dendrittiske celler via PI3K /akt og noncanonical NFK-p veier, noe som fører til en fenotype tolerogene [26]. Mekanismene som forbinder TGF-β og IDO er ikke blitt fullstendig klarlagt, men en mer plausibel mekanisme er blitt beskrevet av Pall og Grohmann [33]. Deres studier støtter teorien om at TGF-β overfører regulerende effekt på IDO syntese. Videre kan IDO utøve sin effekt gjennom en mekanisme som er uavhengig av dets enzymaktivitet [33].
I vår studie vurderte vi PI3K /Akt sti aktivering ved hjelp av Western blotting for Akt /fosfor-Akt. Behandling med MT og TGF-β1 signifikant redusert fosfo-Akt nivåer, noe som indikerer at TGF-β drevet EMT i T24-celler er assosiert med nedregulering av denne reaksjonsvei. I mange celletyper, blir TGF-β-indusert EMT forbundet med PI3K /Akt sti oppregulering; men i T24 celler er det fortsatt uklart. Al-Azayzih et al. analysert fosfo-Akt i T24-celler etter inkubasjon med TGF-β1 (som anvendt i våre forsøk, 5 ng /ml), og de var ikke i stand til å bestemme en forskjell i fosfo-Akt nivåer [34]. Fravær av innvirkning på fosfo-Akt nivåer kan være på grunn av lengden av TGF-β1 behandling. Mens de brukte en inkubasjonstid på 24 timer, brukte vi 48 timer. Videre Iliopoulos et al. brukte Akt – /- celler for å vise at akt1 knockdown fremmet TGF-β-indusert EMT i MCF10A celler. Denne effekten viste seg å være avhengig av ekspresjonen av spesifikke microRNAs [35]. I denne sammenheng kan rollen Akt i EMT variere avhengig av modellsystemet.
I tillegg til cadherin bytte og betydelig økt uttrykk av EMT-relaterte transkripsjonsfaktorer (Twist, snegle, og Slug), T24 celler behandlet med TGF-β pluss MT demonstrert økt trekkende kapasitet og invasivitet. I tillegg til
in vitro
eksperimenter ble T24-celler inokulert i nyrene subkapsulære rom hos Balb /c nakne mus. Etter 4 uker ble T24-celler observert i nyreparenchymet mot medulla. Immunhistokjemisk analyse viste at T24 cellene i sentrum av infiltratet var positive for IDO, mens perifere celler ble IDO-negative. Det er mulig at de perifere cellene i infiltrere tapt IDO uttrykk for å erverve en invasiv fenotype. Videre studier er nødvendig for å klargjøre denne mekanisme.
Som konklusjon, MT og nedregulering av IDO er forbundet med EMT i T24 human blærekarsinom-celler, og denne effekten kan utløses av TGF-β1. Selv IDO hemming er attraktiv som anti-kreft terapi fordi IDO fremmer toleranse for svulster, de nonimmunological effekter mediert av MT og andre Ido modulatorer fortjener vurdering i blærekreft. Som perspektiv, må hemmere av IDO kombineres med andre klasser av narkotika i anti-kreft terapi for å minimere mulige skadevirkninger forårsaket av disse legemidlene.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Histologi av nyrevevet etter subcapsular inokulering av T24 celler.
For å analysere T24 celle invasjon
in vivo
, vaksinert vi 1X10
6 celler under nyrekapselen. Histologi (hematoxylin og eosin-farging) ble vurdert 28 dager etter inokulering. (A) T24 celler under nyrekapselen (pilspiss), og (B) T24 celler som infiltrerer den nyreparenchymet mot nyremargen (pil). Nyreparenchymet er indikert med stjerne
doi:. 10,1371 /journal.pone.0134858.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi er oppriktig takknemlig til Angela Batista Gomes dos Santos og Samara for deres teknisk assistanse.
