Abstract
Medulloblastomas og glioblastomas, de vanligste primære hjernesvulster hos barn og voksne, henholdsvis, er svært vanskelig å behandle. Arbeidet med å identifisere nye proteiner viktig for vekst av disse svulstene kan bidra til å videreutvikle vår forståelse av biologi av disse svulstene, samt, identifisere mål for fremtidige behandlinger. Den nylige identifikasjonen av flere transkripsjonsfaktorer-sentriske protein interaksjons landskap i embryonale stamceller har identifisert en rekke studerte proteiner som er viktig for selvfornyelse av disse stamcellene. For å identifisere nye proteinene nødvendige for skjebnen til hjernetumorceller, undersøkte vi protein interaksjon nettverk av transkripsjonsfaktoren, SOX2, i medulloblastom-celler. For dette formålet, flerdimensjonale Protein Identification Technology (mudpit) identifisert 280 SOX2 assosierte proteiner i medulloblastoma cellelinje DAOY. For å begynne å forstå rollene til SOX2 assosierte proteiner i hjernen kreft, vi fokusert på to SOX2 assosierte proteiner, Musashi 2 (MSI2) og Ubiquitin Spesifikk Protease 9x (USP9X). Nyere studier har implisert MSI2, en antatt RNA-bindende protein, og USP9X, en deubiquitinating enzym, i en rekke krefttyper, men ikke hjernesvulster. Vi viser at knockdown av MSI2 reduserer veksten av DAOY celler samt U87 og U118 glioblastom celler betydelig. Vi viser også at knockdown av USP9X i DAOY, U87 og U118 hjernetumorceller sterkt reduserer deres vekst. Sammen våre studier identifisere et stort sett med SOX2 assosierte proteiner i DAOY medulloblastoma celler og identifisere to proteiner, MSI2 og USP9X, som tilsier videre undersøkelser for å finne ut om de er potensielle terapeutiske mål for kreft i hjernen
Citation.: Cox JL, Wilder PJ, Gilmore JM, Wuebben EL, Washburn MP, Rizzino A (2013) The SOX2-interactome i Brain kreft celler Identifiserer Krav til MSI2 og USP9X for vekst av hjernen kreftceller. PLoS ONE 8 (5): e62857. doi: 10,1371 /journal.pone.0062857
Editor: Robert W. Sobol, University of Pittsburgh, USA
mottatt: 17. desember 2012; Godkjent: 26 mars 2013; Publisert: 07.05.2013
Copyright: © 2013 Cox et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra Nebraska Department of Health (2011-29, 2012-33). EW ble støttet delvis av en NCI trening bevilgning (CA009476). JMG og MPW ble støttet av Stowers Institute for Medical Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
glioblastomer (GB) og Medulloblastomas (MB) er sterkt svekkende sykdommer som er meget vanskelig å behandle. Til tross for forbedrede terapeutiske regimer, pasienter diagnostisert med GB, den vanligste primære voksen hjernesvulst, har en median overlevelse på 10-14 måneder [1]. Behandling av pasienter med MB, den vanligste pediatriske kreft i hjernen, utgjør et ytterligere problem. Nåværende behandlingsformer for MB forårsake dramatisk svekkelse av kognitiv funksjon og predisponere for fremtidige behandlingsassosiert svulster [2]. Det er derfor et stort behov for å identifisere nye proteiner og signalveier som kan tjene som nye mål for bedre behandling av GB og MB. Relevant for arbeidet som er beskrevet i denne studien, forhøyede nivåer av transkripsjonsfaktoren SOX2, som spiller viktige roller i utvikling av nervesystemet, har vist seg å korrelere med dårlig klinisk resultat for hjernetumorpasienter [3]. Den kritiske rollen SOX2 i hjernesvulster er støttet av funn at knockdown av SOX2 av RNA interferens reduserer
in vitro Hotell og
in vivo
vekst av GB celler [4]. Videre er SOX2 uttrykt i MB celler [3], og nylig har vi fastslått at knockdown av SOX2 i DAOY MB cellene reduserer deres spredning (Cox og Rizzino, upubliserte resultater).
I løpet av de siste 10 årene , betydelig innsats har vært viet til å forstå de mekanismer som essensielle transkripsjonsfaktorer megle deres effekter. I den senere tid har betydelige fremskritt blitt gjort mot kartlegging protein-protein interaksjon landskaper av essensielle transkripsjonsfaktorer i en rekke cellulære systemer. For eksempel har omfattende vært framgang i å bestemme proteomet av transkripsjonsfaktorer, spesielt Sox2, Oct4 og Nanog, er nødvendig for å opprettholde selvfornyelse og pluripotency av embryonale stamceller (ESC) [5] – [11]. Integreringen av interactomes for Sox2, Oct4 og Nanog, hevder at disse pluripotency assosiert transkripsjonsfaktorer er en del av en svært integrert protein-protein interaksjon landskapet, som inkluderer mange andre transkripsjonsfaktorer, kromatin remodellering maskiner, DNA-reparasjon maskiner og RNA bindende proteiner [9 ], [11] – [13]. Videre objektive proteomikk skjermer for å identifisere proteiner som assosierer med Sox2 i mus ESC har vist seg å være en kraftig tilnærming for å identifisere mindre studert proteiner, slik som Banf1 og Musashi2 (MSI2), som påvirker skjebnen til ESC [11] betydelig – [ ,,,0],15]. Gitt at SOX2 forbinder med et variert utvalg av essensielle proteiner, er det sannsynlig at proteomikk analyse av SOX2-interactome i hjernen kreftceller kan bidra til å identifisere flere proteiner som påvirker veksten av disse svulstene.
For å forbedre vår forståelse av hjernesvulster, arbeidet rapportert i denne studien satt ut for å ta opp to spørsmål. Hva er sammensetningen av SOX2-interactome i MB tumorcellelinje DAOY? Kan proteomikk skjermen på SOX2-assosierte proteiner bidra til å identifisere flere proteiner som kreves av hjernen kreftceller? Vi rapporterer at SOX2 forbinder med 280 proteiner i DAOY celler. I tillegg viser vi at to SOX2 assosierte proteiner, MSI2 og Ubiquitin Specific Peptidase 9x (USP9X), som nylig har vært innblandet i utviklingen av andre kreftformer [16] – [21], er nødvendig for å støtte vekst og overlevelse av DAOY celler og to GB tumorcellelinjer, U87 og U118.
eksperimentelle prosedyrer
Cell Culture
DAOY (HTB-186, ATCC, Manassas, VA), i- SOX2-DAOY, U87 (HTB-14, ATCC), U118 (HTB-15, ATCC) og HEK293T (CRL-11268, ATCC) celler ble dyrket som tidligere beskrevet [22]. Lentiviral partikler ble produsert, og cellene ble infisert, som tidligere beskrevet [15]. Cellevekst ble undersøkt ved hjelp av MTT-analyse, som beskrevet tidligere [15] ved hjelp av celler replated 3-4 dager etter lentiviral infeksjon.
Plasmid Produksjon
FUW-Teto-SOX2 (20724) ble oppnådd fra Addgene (Cambridge, MA). pLVX-Tet-On® Avansert vektor ble oppnådd fra Clontech (632162, Mountain View, California). Vektorer for å produsere shRNA lentiviruses for MSI2 (RMM4534-NM_011443) og USP9X (RHS4533-NM_001039590) knockdowns ble innhentet fra Open Biosystems (Huntsville, AL). En tidligere validert uspesifikk shRNA (kryptert) ble anvendt som en negativ kontroll i knockdown eksperimenter [23]. shRNA sekvenser er gitt i supplerende tabell S4.
For å konstruere pLVX-tetO- (fs) SOX2, strep og flagg koder ble sekvensielt tilsatt N-enden av SOX2 etter to runder av PCR. Den første PCR runde brukt FUW-Teto-SOX2 som en mal, oppstrøms primer: CAAGAAGCTTGCC
AACTGGAGCCACCCACAATTCGAGAAG
GGCGGAATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAG (understreket: HindIII, kursiv: Strep-epitop, fet: SOX2 CDS, fet understreket: stille mutasjon for å ødelegge en endogen BsrGI stedet) og nedstrøms primer: AGGACTCGAGCGCGGGACCACACCATGAAGG (understreket: XhoI). Dette fragment ble spaltet med Hindlll og Xhol og ligert inn i tilsvarende områder av Bluescript KS + (Sratagene, Santa Clara, CA). Den andre runden av PCR, ved hjelp av mellom plasmid som mal, ble kjørt med følgende oppstrøms primer: AAGGTCTAGATGTAC
ATGGACTACAAGGACGACGATGACAAG
GGGTCGGCCGCC
AACTGGAGCCACCCACAATTCGAGAAG product: (understreket: XbaI, grå: BsrGI, fet og kursiv: Flag-epitop, i kursiv: Strep-epitop) og nedstrømsprimeren som inneholder Xhol sete som er beskrevet ovenfor. Dette PCR-produkt ble deretter spaltet med Xbal og Xhol og ligert inn i tilsvarende områder av Bluescript. The Flag-Strep merket 5 «enden av SOX2 ble isolert fra dette mellom vektor og overført til FUW-Teto-SOX2 vektor ved hjelp BsrGI og en intern RsrII nettstedet, for å skape FUW-tetO- (fs) SOX2. (Fs) SOX2 ble isolert fra FUW-tetO- (fs) SOX2 hjelp EcoRI og ligert inn pLVX-Tight-Puro (632162, Clontech), for å skape pLVX-tetO- (fs) SOX2. Orientering ble verifisert ved sekvensering.
i-SOX2-DAOY Cell Engineering
DAOY celler ble sådd ved klonal tetthet og infisert med pLVX-Tet-On® Avansert lentivirus å produsere rtTA-DAOY. Celler ble igjen foret friskt medium 2-3 ganger per uke. Åtte dager etter utsåing ved klonal tetthet, individuelle kolonier ble isolert, og to dager senere, isolerte kolonier ble utsatt for G418 (300 ug /ml). rtTA-DAOY kloner ble utvidet for ~ 2 uker under G418 utvalg. rtTA-DAOY-celler ble sådd ut ved klonal tetthet og infisert med pLVX-tetO- (fs) SOX2. Celler ble igjen foret friskt medium 2-3 ganger per uke. Åtte dager etter såing, ble cellene eksponert for puromycin (5 ug /ml) i 72 timer, hvoretter 6-kloner ble isolert. Hver klon ble dyrket i medium supplert med doksycyklin (0,1 ug /ml) i 24 timer, og kjerneproteiner ble isolert. Induserbar ekspresjon av (fs) SOX2 ble bekreftet ved western blot-analyse (data ikke vist). En enkelt klon, betegnet som i-SOX2-DAOY, ble brukt for proteomikk analyse.
Protein Isolering og Immunoutfelling
Dounce homogenisering ble anvendt for å isolere kjerneproteiner for mudpit analyse, som beskrevet tidligere [ ,,,0],24]. For immunoutfelling ble det nukleære ekstrakter applisert på M2-perler (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og vasket, og proteinkomplekser ble eluert ved anvendelse av 3X Flag-peptid (Sigma-Aldrich), som beskrevet tidligere [9]. Differential nedtrekk mellom indusert (+ Dox) og ikke-indusert (-Dox) prøver ble verifisert ved sølvfarging [9].
mudpit Identifikasjon av SOX2-forbundet Proteiner
flerdimensjonale Protein Identification Technology (mudpit ) analyse ble utført som beskrevet tidligere [9]. MS /MS datasett ble undersøkt ved hjelp SEQUEST og
Homo sapiens
protein database (NCBI, 2010-11-22 release). Distribuerte Normalisert Spectral Overflod Factors (dNSAF) ble beregnet for hvert oppdaget protein, som beskrevet andre steder [25]. Tre uavhengige eksperimenter og statistisk analyse ble utført som beskrevet tidligere [9]. Den spektrale falsk funn hastighet ble bestemt som tidligere beskrevet [9], [26].
Western Blot analyse
Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [9]. Nukleære og cytoplasmatiske proteinekstrakter ble fremstilt ved bruk av NE-PER-sett (Thermo-Scientific, Rockford, IL) ble anvendt i henhold til produsentens protokoll for å isolere proteiner for western blot-analyse, som beskrevet tidligere [9]. Relative nivåer av detekterte proteiner ble bestemt som tidligere beskrevet [11]. Primære antistoffer som ble anvendt var: a-MSI2 (ab83236, Abcam, Cambridge, MA), α-USP9X (ab56461, Abcam), α-USP7 (A300-033A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), α-Flag (F3165, Sigma -Aldrich), α-GAPDH (G8795, Sigma-Aldrich), α-nummen (ab4147, Abcam), α-SOX2 (abl5830, Abcam), α-MCL1 (sc-819, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , α-β-catenin (9562, Cell Signaling Technology, Danvers, MA).
RNA analyse
RNA isolering og cDNA-syntese utført som tidligere beskrevet [9]. Genuttrykk av MSI2 og USP9X i DAOY, U87, eller U118 celler behandlet med målretting eller egge shRNA ble analysert ved SYBR Grønn (SuperArrayBioscience Corporation, Federick, MD) kvantitativ real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) [9]. Primere anvendt for PCR-trinnet i analysen av MSI2 RNA ble h-MSI2-F (AAGTATTAGGTCAGCCCCAC) og h-MSI2-R (TTCTCAAAAGTGACAAAGCC). Primere anvendt for PCR-trinnet i analysen av USP9X RNA ble h-USP9X-F (CAGATGACCAAGATGCTCC) og h-USP9X-R (GGGGATACTTCTTCACTGCC). Primere for GAPDH kontroll uttrykk har blitt beskrevet tidligere [15].
Resultater
Engineering av i-SOX2-DAOY Cells og mudpit Analyse av SOX2-forbundet Proteiner
For å hjelpe identifisere nye proteiner viktig for vekst av MB celler, undersøkte vi SOX2-interactome i DAOY MB celler. Viktigst, transkripsjonsfaktorer, som for eksempel SOX2, ikke i isolasjon, men fungerer som en del av store protein komplekser. I dette henseende har tidligere undersøkelser utført med ESC gjennomgår differensiering vist at Sox2 er til stede i flere store molekylvekt proteinkomplekser, noe som overstiger 880 kDa [27]. For å undersøke den SOX2-interactome, ble DAOY-celler konstruert for den induserbare ekspresjonen av epitop-tagget SOX2 (i-SOX2-DAOY), fordi antistoffer mot SOX2 egner seg ikke for høyt spesifikk og følsom isolering av SOX2-proteinkomplekser. Dette gjorde oss i stand til å konsekvent isolere SOX2 og assosierte proteiner ved hjelp av M2-perler. Til ingeniør i-SOX2-DAOY ble DAOY celler sekvensielt infisert med et lentivirus å innføre en konstitutivt uttrykt reverse-tet transaktivatorprotein og andre lentiviral vektor som uttrykker et flagg-streptokokk dual epitop tagget form av SOX2 [(fs) SOX2] under kontroll av en Dox-induserbar promoter (fig. 1A).
(A) Skjematisk fremstilling av lentiviral system som brukes for å innføre en Dox-induserbar, epitop merket SOX2 inn i DAOY MB-celler. To lentiviral vektorer ble brukt til å introdusere konstitutivt uttrykt reverse-tet transaktivatorprotein (rtTA) og induserbar (fs) SOX2 [merket: Flag-SOX2]. (B) protokoll som brukes til å isolere SOX2-proteinkomplekser fra DAOY MB celler for nedstrøms mudpit analyse. (C) Western blot-analyse sentret for SOX2 med en Sox2 antistoff. Nivået av (fs) SOX2 ble sammenlignet med nivået av endogent SOX2, som ble satt til 1. (D) Silver stain demonstrere anrikning av proteiner etter induksjon av (fs) SOX2 med Dox og immunopresipitering med M2-perler. Den fremtredende bånd ble observert ved ~45 kDa er en vanlig kontaminant når M2-perler blir anvendt for immunopresipitering. * Beregnet stilling (fs) SOX2 er angitt med en pilspiss. (E) Western blot analyse sondering for Flag-SOX2 å verifisere immunoprecipitation bruker M2-perler.
For å isolere (fs) SOX2 og assosierte protein komplekser fra i-SOX2-DAOY celler, (fs) SOX2 ekspresjon ble indusert i 24 timer (0,1 ug /mL Dox), og (f) SOX2 proteinkomplekser ble isolert fra kjerneproteinekstrakter ved immunoutfelling under anvendelse av M2-perler (fig. 1B). Som en kontroll, ble kjerneekstrakter fremstilt fra i-SOX2-DAOY-celler uten eksponering for Dox (ikke-induserte prøver). Etter induksjon med Dox, nivået av (fs) SOX2, som vandrer litt langsommere enn SOX2, ble funnet å være ~2.5 ganger høyere enn den for endogen SOX2 (Fig. 1C). Men hvis ekspresjon av eksogene SOX2 reduserer ekspresjonen av endogene SOX2 som det gjør i ESC [11] er de totale nivåer av SOX2 i Dox-behandlede celler var mindre enn 2,5 ganger høyere enn i de ubehandlede DAOY-celler. Viktigere, sølvfarging analyse av immunoutfelt eluatene viste en betydelig anrikning av proteiner isolert ved (fs) SOX2 ble indusert (Fig. 1D). Som forventet, (fs) SOX2 kunne lett påvises ved western blot-analyse i den induserte, men ikke i de ikke-induserte eluatene (fig. 1E). Den fremtredende bånd observert ved ~45 kDa (Fig. 1D) er en vanlig forurensning når M2-perler blir brukt for immunoprecipitation [9], [11].
For å identifisere proteiner som assosierer med SOX2 i i-SOX2 -DAOY celler, SOX2-proteinkomplekser fra ikke-induserte og induserte i-SOX2-DAOY celler ble utsatt for mudpit analyse. For å minimere eksperimentell variasjon og for statistisk analyse ble utført mudpit analyse på tre uavhengige par prøver. Den spektrale falske funnrate på våre proteomikk skjermene var 0,27% ± 0,16 og 0,37% ± 0,08 for ikke-induserte og induserte prøver, henholdsvis, som bestemmes av metoden for Elias og kolleger [26]. Proteiner identifisert som SOX2 assosierte proteiner ble gruppert i tre hovedkategorier i et forsøk på å minimere utelukkelse av bona-fide SOX2 assosierte proteiner: 1) proteiner bare identifisert i våre indusert prøver i tre mudpit analyser med strengere BY justert betydning p 0,05 (fig. 2A, supplerende Tabell S1); 2) proteiner bare identifisert i indusert prøver i tre mudpit analyser uten BY-justert signifikans (p 0,05), men med t-test signifikans (p 0,05) (figur 2B, supplerende tabell S2).; og 3) proteiner som ble anriket i den induserte prøve mer enn 6 ganger (fig. 2C, supplerende Tabell S3). Kategori 1 og kategori 2 utgjorde 156 og 39 proteiner, henholdsvis. Alle proteiner i kategori 1 møtte den statistiske kravet som benyttes for kategori 2. Sammen med kategori 3, som inkluderte 88 proteiner, totalt 283 SOX2 assosierte proteiner ble identifisert når alle tre kategoriene ble slått sammen.
(A ) proteiner som ble identifisert i alle de tre induserte M2-perle eluater, men som ikke er identifisert i ikke-induserte prøver, som SOX2-assosierte proteiner ved mudpit analyse, som var statistisk signifikant i henhold til den bY justerte metode (p 0,05). NSAF verdier av de tre replikater midles og feilfelt representerer standardavvik. Tomten er delt i to; de «Gjennomsnittlig NSAF verdier» av den venstre halvdelen stige venstre til høyre, og de «Gjennomsnittlig NSAF verdier» av høyre halvdel stige høyre mot venstre. (B) Proteiner er identifisert i 3 av tre, Dox-induserte, men ikke i ikke-induserte, DAOY mudpit replikater som var statistisk signifikante i henhold til students t-test (p 0,05), men var ikke signifikant i henhold til den BY-justerings ( p 0,05). (C) Proteiner som ble identifisert i alle de tre induserte, men i det minste ett ikke-indusert mudpit prøve, er plottet i henhold til folde anrikning (NSAF verdier) i Dox-induserte prøver sammenlignet med ikke-indusert. Bare proteiner med berikelse verdier 6-fold ble inkludert. Proteiner avbildet med en svart strek hadde berikelse verdier som var statistisk signifikant i henhold til BY-justering (p 0,05). Proteiner avbildet med grå stolpene var statistisk signifikant i henhold til t-test (p 0,05), men ikke signifikant i henhold til BY-justering (p 0,05).
For å bedre forstå den biologiske funksjoner av SOX2 assosierte proteiner, utførte vi genet ontologi klassifisering med Database for merknader visualisering og integrert Discovery (DAVID). Gitt den kjernefysiske plassering og funksjon av SOX2, er det ikke overraskende at transkripsjon er en av de største menyer (fig. 3). Imidlertid har SOX2-assosierte proteiner som er knyttet til mange andre cellulære prosesser. Dette ligner på det funn at Sox2-assosierte proteiner i mus ESC og i mus ESC som gjennomgår differensiering er involvert i et variert utvalg av funksjoner [9], [11]. I disse cellulære sammenhenger, en tilsvarende andel av SOX2-assosierte proteiner som deltok i kategoriene av RNA-prosessering (6% til 9%) og utvikling (10% til 11%). Imidlertid var det flere betydelige forskjeller. Prosentandelen av SOX2-assosierte proteiner som faller inn under DNA-reparasjon kategorien representert 11% i ESC gjennomgår differensiering [9], men bare 1% i DAOY celler. Klassifiseringen for hver SOX2-assosiert protein er gitt i supplerende tabell S5.
Gene ontologi analyse av SOX2 assosierte proteiner identifisert i DAOY MB celler ble utført ved hjelp av Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID). Spesifikke ontologi beskrivelser for SOX2 assosierte proteiner ble gruppert i 14 hovedkategorier.
mudpit er en svært følsom metode som er i stand til å detektere proteiner i prøver som ikke lett oppdages av western blot analyse. Av denne grunn, brukte vi en mer tradisjonell biokjemisk tilnærming og utvalgte proteiner med beskjedne NSAF verdier å validere vår identifikasjon av SOX2-assosierte proteiner. Spesielt MSI2, et protein som finnes bare i våre indusert prøver (Fig. 2A), og USP7, beriket ~ 20 ganger (fig. 2C), ble bekreftet å assosiere med SOX2 gjennom co-immunoprecipitation bruker atom ekstrakter fremstilt fra DAOY celler ( supplerende fig. S1 A). Vi har også bestemt at SOX2 er i stand til å assosiere med MSI2 og USP7 i andre cellulære sammenhenger. I denne forbindelse ble MSI2 og USP7 identifisert som SOX2-assosierte proteiner i et enkelt proteomikk skjerm av SOX2-assosierte proteiner i U87 GB celler (Wilder og Rizzino, upubliserte resultater). I tillegg har vi fastslått at ectopically uttrykt Flag-SOX2 forbinder med endogen USP7 funnet i HEK293T celler (supplerende Fig. S1B). Vi bekreftet også at ectopically uttrykt Flag-MSI2 co-immunpresipitatene ectopically uttrykt SOX2 i HEK293T celler (supplerende Fig. S1C).
Integrering av SOX2-protein Interactomes avslører en rekke vanlige knytte Proteiner
i tillegg til den SOX2 proteomikk skjerm utført i DAOY-celler, har vi nylig gjennomført mudpit analyse for å identifisere SOX2-assosierte proteiner i flere andre celle sammenhenger, blant annet udifferensiert ESC [11] og ESC gjennomgå differensiering [9]. Viktigere, ble de tre SOX2-interactomes identifisert bestemmes ved hjelp av de samme metodene for protein isolasjon og proteomikk analyse, og en tilsvarende spektral falsk funnrate ( 0,4%) ble bestemt i hver uavhengig sammenheng [9], [11]. I hvert tilfelle, Flagg-epitop merket SOX2 og dens tilknyttede proteiner ble isolert ved anvendelse av M2-perler fra nukleære ekstrakter fremstilt av Dounce-homogenisering, etterfulgt av mudpit analyse ved å bruke den samme proteomikk plattform. Derfor sammenlignet vi SOX2-interactomes identifisert i hvert av disse cellulære sammenhenger (supplerende fig. 2, supplerende tabell S6), fordi proteiner som assosierer med SOX2 i flere cellulære sammenhenger er også sannsynlig til å spille viktige roller i oppførselen til hjernen kreftceller. I denne forbindelse, humane MB-celler og mus ESC hadde flere SOX2-assosierte proteiner til felles, til tross for dramatiske forskjeller i cellulær sammenheng. Av 283 proteiner identifisert i SOX2-interactome i DAOY MB celler, 19 forbinder med SOX2 i minst en annen mobil kontekst, inkludert MSI2 og USP9X, og to forbinder med SOX2 i alle tre celle sammenhenger (supplerende Fig. S4, supplerende Tabell S6 ). Nylig har vi vist at Msi2 er nødvendig for selvfornyelse og pluripotency av mus ESC [14] og, mer nylig, har vi fastslått at knockdown av Usp9x i mus ESC vesentlig øker differensiering av ESC (upubliserte resultater). Videre MSI2 og USP9X har vært innblandet i andre kreftformer [16] – [21], men deres roller i hjernesvulster har ikke blitt undersøkt. Derfor utvidet vi vår analyse av SOX2-assosierte proteiner ved å avgjøre om avtagende MSI2 og USP9X uttrykk påvirker oppførselen til hjernen kreftceller.
Musashi-2 er nødvendig for spredning av Brain kreft celler
Tidligere rapporter har vist at MSI2 er essensielt for utviklingen av CML [16] – [18], og den knockdown av et annet familiemedlem, Musashi-1 (MSI1), forstyrrer den levedyktigheten av DAOY MB-celler og GB-celler [28], [29]. For å avgjøre om MSI2 er nødvendig for spredning av DAOY MB celler, ble shRNA konstruerer brukt til å slå ned endogen MSI2. Spesielt lentiviruses som konstitutivt uttrykte shRNA mot MSI2 ble brukt til å infisere DAOY MB celler. To uavhengige shRNA konstruksjoner ble brukt til å knockdown MSI2, og en på forhånd preget ikke-spesifikk shRNA (kryptert) ble anvendt som en kontroll [15], [23]. Etter utvalg av de infiserte celler med puromycin, western blot analyse viste at MSI2 isoformer 1 og 2 ble i det vesentlige slås ned (fig. 4A). Denne reduksjonen i MSI2 ble bekreftet på RNA-nivåer ved RT-qPCR (Supplemental Fig. S3A). I tillegg, når sammenlignet med veksten av DAOY-celler infisert med det forvrengte shRNA lentivirale vektorer, observerte vi en stor reduksjon i vekst når cellene ble infisert med MSI2 shRNA lentivirale vektorer (Fig. 4B). Videre har mikrofotografier tatt 7 dager etter infeksjon viste at celler i hvilke MSI2 hadde blitt slått ned var flatere og større, som minner om post-mitotiske celler, sammenlignet med det omkastede kontroll (Fig. 4C).
(A ) Western blot analyse av MSI2 nivåer i DAOY hele cellen trekker 96 timer etter infeksjon med egge eller MSI2 shRNA lentiviruses. To isoformer ble oppdaget: isoform 1 (MSI2-1) og isoform 2 (MSI2-2). GAPDH ble undersøkt som en lasting kontroll. MSI2 nivåer er kvantifisert, med nivåer som finnes i egge kontroll satt til 1,00. (B) Celleveksten ble undersøkt i triplikat ved MTT-assay 6 dager etter å ha blitt belagt ved 10
4 celler pr brønn i en 12-brønns plate. Dataene som vises er gjennomsnitt i forhold til Scramble kontroll. Feilfelt representerer standardavvik. P-verdier ble bestemt av student t-test og funnet å være 0,01 for både MSI2 shRNA 1 og 2. (C) Mikrofotografier av DAOY MB celler etter infeksjon med enten uspesifikk (kryptert) eller MSI2 målretting (No. 1 , nr 2) shRNA lentiviruses. Celler ble infisert på dag 0, valgt ved hjelp av medium supplert med puromycin på dag 1, og igjen foret friskt medium på dag 2. Cellene ble fotografert på dag 7 etter infeksjon. (D) Western blot analyse av nummen i DAOY MB ekstrakter brukes i Figur 4A.
Foreløpig relativt lite er kjent om rollene til MSI2, men i musemodell av leukemi det antas å ned- regulere protein nummen [16], som har vist seg å regulere både Notch og Wnt signalering [30], [31]. Derfor undersøkte vi om knockdown av MSI2 i DAOY celler påvirker uttrykket av nummen. Vi fastslått at knockdown av MSI2 med shRNA lentiviral vektorer # 1 og # 2 har medført en økning i proteinnivå nummen (fig. 4D). Dermed fører knockdown av MSI2 både en stor reduksjon i veksten av DAOY MB kreftceller og øker uttrykket av nummen.
Vi har også undersøkt konsekvensene av å slå ned MSI2 i GB kreftceller, fordi MSI2 ble også identifisert som en SOX2-assosiert protein i U87 GB celler (Wilder og Rizzino, upubliserte resultater). For dette formål vi først infisert U87 GB tumorceller med de samme MSI2 shRNA lentivirale vektorer som er beskrevet tidligere. Igjen ble en kryptert shRNA anvendt som en kontroll. Tre dager etter infeksjon med lentivirale vektorer, western blot-analyse fastslått at MSI2 isoform 1 og isoform 2 var begge vesentlig redusert (fig. 5A), og reduksjonen i MSI2 ble bekreftet på RNA-nivå ved RT-qPCR (supplerende fig. S3b) . Som i tilfellet av DAOY-celler, U87 GB celler infisert med MSI2 shRNA konstruksjoner viste en markert reduksjon i celleformering (Fig. 5B) og en signifikant økning i cellestørrelse (fig. 5C). For å utvide disse funnene, ble U118 GB celler infisert med MSI2 shRNA lentiviruses. I likhet med DAOY og U87-celler, knockdown av MSI2 i U118-celler resulterte i en reduksjon i MSI2 protein og RNA, en stor reduksjon i cellevekst, og en betydelig økning i cellestørrelse (supplerende fig. S4 og S3C fig.). Tatt sammen, våre data indikerer at MSI2 er nødvendig for å opprettholde overlevelse av DAOY MB-celler, og den proliferative kapasiteten til U87 og U118 GB-celler.
(A) Western blot-analyse av MSI2 nivåer i U87 atom ekstrakter 96 timer etter infeksjon med Egge eller MSI2 shRNA lentiviruses. MSI2 nivåer er kvantifisert, med nivåer som finnes i egge kontroll satt til 1,00. (B) Celleveksten ble undersøkt i triplikat ved MTT-assay 5 dager etter å ha blitt belagt på 1,5 x 10
4 celler pr brønn i en 12-brønns plate. Dataene som vises er gjennomsnitt i forhold til Scramble kontroll. Feilfelt representerer standardavvik. P-verdier ble bestemt av student t-test og funnet å være 0,01 for både MSI2 shRNA 1 og 2. (C) Mikrofotografier av U87 GB celler etter infeksjon med enten uspesifikk (kryptert) eller MSI2 målretting (No. 1 , nr 2) shRNA lentiviruses. Celler ble infisert på dag 0, valgt ved hjelp medium supplert med puromycin på dag 1 og igjen foret friskt medium på dag 3. Celler ble fotografert på dag 6 etter infeksjonen.
knockdown av USP9X Reduserer levedyktigheten til Brain kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP
Vi har også undersøkt om USP9X er nødvendig for overlevelsen av hjernen kreftceller. For dette formålet, benyttet vi shRNA mediert knockdown av USP9X. Mer spesifikt ble tre uavhengige lentiviruses brukt til å avle konstitutivt aktiv shRNA konstruerer mot USP9X transkripsjoner i DAOY MB celler. Som med våre MSI2-knockdown studier ble Egge shRNA brukt som en kontroll. Knockdown av USP9X ble bekreftet ved western blot analyse av både kjernekraft og cytoplasmatiske ekstrakter (Fig. 6A) og verifisert på RNA-nivåer ved RT-qPCR (supplerende Fig. S5a). Selv om det var minimal effekt av banket ned USP9X løpet av de tre første dagene av kultur, observerte vi en stor reduksjon i antall celler som kan feste (data ikke vist). Videre er de få celler fra USP9X knockdown befolkningen som reattached etter subkultur oppviste liten eller ingen spredning (fig. 6, B og C). I tillegg undersøkte vi om knockdown av USP9X påvirker uttrykket av flere av sine kjente mål i DAOY celler. USP9X har blitt rapportert å deubiquitinate et stort antall proteiner, inkludert MCL1 og β-catenin [19], [32] – [35]. Imidlertid knockdown av USP9X synes ikke å forandre ekspresjonen av MCL1 eller β-catenin i de nukleære og cytoplasmiske kamre (fig. 6D).
(A) Western blot-analyse for å bekrefte den knockdown av USP9X i DAOY MB celler etter infeksjon med lentiviruses å innføre konstitutivt aktiv shRNA mot USP9X transkripsjoner. Atom og cytoplasmatiske proteinfraksjoner ble utarbeidet 4 dager etter smitte cellene med lentiviruses. USP9X nivåer er kvantifisert, og nivåene i eggekontrollen er satt til 1,00. (B) Celleveksten ble undersøkt i triplikat ved MTT-assay 6 dager etter å ha blitt belagt ved 10
4 celler pr brønn i en 12-brønns plate. Dataene som vises er gjennomsnitt i forhold til Scramble kontroll. Feilfelt representerer standardavvik. P-verdier ble bestemt av student t-test og funnet å være 0,01 for både USP9X shRNA 1, 2 og 3. (C) Mikrofotografier av DAOY MB celler etter knockdown av USP9X hjelp lentiviral levert shRNA konstruerer mot USP9X transkripsjoner. På dag 0 ble celler infisert med USP9X shRNA lentiviruses. Begynnelsen på dag 1, ble infiserte celler valgt å bruke puromycin i 48 timer.
