Abstract
Resveratrol (RV) er en naturlig del av rødvin og druer som har vist seg å være en potensiell chemopreventive og kreft agent. Imidlertid er de molekylære mekanismene bak RV er mot kreft og chemopreventive effekter ufullstendig forstått. Her viser vi at RV behandling hemmer veksten av klonogene ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler på en doseavhengig måte. Interessant, tumor-suppressive virkning av lavdose RV var ikke assosiert med noen betydelige endringer i ekspresjonen av spaltede PARP og aktivert caspase-3, noe som tyder på at en lav dose RV behandling kan undertrykke tumorcellevekst via en apoptose-uavhengig mekanisme. Senere studier avslører at dosen RV behandling lav induserer en signifikant økning i aldrings-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) farging og forhøyet ekspresjon av p53 og p21 i NSCLC-celler. Videre viser vi at RV-indusert suppresjon av lungecancer-cellevekst er assosiert med en reduksjon i ekspresjon av EF1A. Disse resultatene antyder at RV kan utøve sin anticancer og kjemopreventive effekter gjennom induksjon av for tidlig senescens. Mekanistisk, korrelerer RV-indusert for tidlig alderdom med økt DNA-dobbelttrådbrudd (DSB sin) og reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon i lungekreftceller. Hemming av ROS produksjon av N-acetylcystein (NAC) demper RV-indusert DNA DSB sin og for tidlig alderdom. Videre viser vi at RV behandling markert induserer NAPDH oksidase-5 (Nox5) ekspresjon i både A549 og H460-celler, noe som tyder på at RV kan øke ROS generasjon i lungekreftceller gjennom oppregulering Nox5 uttrykk. Sammen utgjør disse funn viser at dosen RV behandling lav inhiberer lungecancer-cellevekst ved hjelp av en tidligere satt pris mekanisme, nemlig induksjon av for tidlig senescens gjennom ROS-mediert DNA-skade
relasjon:. Luo H, Yang A, Schulte BA , Wargovich MJ, Wang GY (2013) Resveratrol Induserer prematur senescence i lungekreftceller via ROS-mediert DNA Damage. PLoS ONE 8 (3): e60065. doi: 10,1371 /journal.pone.0060065
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 30 november 2012; Godkjent: 20 februar 2013; Publisert: 22 mars 2013
Copyright: © 2013 Luo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH tilskudd CA138313 og HL106451 (www.nih.gov). Dette arbeidet ble også støttet delvis av en American Cancer Society Institutional stipend (# IRG-97-219-08). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesse eksisterer
Innledning
Lungekreft er ansvarlig for flere kreftdødsfall i USA enn den samlede dødelighet av tykk-, bryst og prostata kreft [1]. Selv med de nyere avanserte terapeutiske tilnærminger, er det 5-års total overlevelsesrate mindre enn 16%, og har ikke endret seg nevneverdig over mange tiår [1], [2]. Dette dårlig prognose understreker det presserende behov for utvikling av nye strategier for forebygging og mer effektiv behandling av denne dødelige sykdom. Naturlige produkter (NPS) er mye brukt av amerikanere som komplementære og alternative medikamenter (CAM) for forebygging og behandling av forskjellige humane sykdommer, inkludert kreft [3], [4]. Bruken av NPS som antitumormidler for behandling av kreft hos mennesker er en attraktiv idé fordi de er lett tilgjengelige og oppviser liten eller ingen toksisitet [3], [5] – [7]. Resveratrol (RV) er en av slike NPS og har vist seg å oppvise både anticancer og kjemopreventive potensialer [3], [8] – [10]. Imidlertid er de nøyaktige molekylære mekanismene bak RV chemopreventive og kreft effekter ikke helt forstått. Målet med denne studien var å definere rollen for tidlig alderdom i RV-induserte antitumor effekter i lungekreftceller.
Cellular alderdom er en tilstand av permanent cellesyklus arrest som kan utløses av en rekke påkjenninger inkludert DNA-skade, telomere forkorting og oksidativt stress [11] – [13]. De to hovedkategorier av mobilnettet senescence er replicative alderdom og stress-indusert for tidlig alderdom (SIPS). Replicative senescence ble først beskrevet av Hayflick og Moorhead i humane fibroblaster etter celler gikk omfattende replikasjon som følge av serie kultur passasjer [14]. Deretter ble det funnet at cellene kan også gjennomgå SIPS i respons til DNA-skadende midler slik som ioniserende stråling og anticancer kjemoterapeutika [11] – [13], [15]. Celler gjennomgår SIPS er ikke skilles morfologisk fra replicatively senescent celler og oppviser mange av de samme egenskapene som tilskrives replikative begynnende alderdom, for eksempel økt senescens forbindelse β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet og økt p53 og p21 ekspresjon [11] – [13] , [15] – [17]. Selv om telomerer forkortes ble antatt å være den viktigste årsaken til replikative senescens, kan for tidlig senescens forekomme i en telomerase- og telomerer forkortes-uavhengig mekanisme [18], [19]. Senescens begrenser levetiden og proliferativ kapasitet av celler, og derfor induksjon av aldringsprosessen anses som en viktig mekanisme for kreft forebygging [20] – [22]. Enda viktigere, har voksende bevis vist at terapi-fremkalt senescens er en viktig mekanisme gjennom hvilken mange anticancermidler hemme vekst av tumorceller [11], [12], [23]. Interessant nok har det vist seg at terapi-fremkalt senescens kan oppnås ved mye lavere doser kjemoterapi enn det som kreves for å indusere apoptose, hvilket indikerer at høye doser av anticancermiddelet kan forårsake apoptose, mens lavt nivå behandlinger primært indusere senescens i kreftceller [12] . I forhold til de tradisjonelle apoptose-induserende strategier, kan denne dosen tilnærmingen lav redusere bivirkningene av anticancerterapi og således forbedre livskvaliteten for kreftpasienter. Derfor er det viktig å forstå hvorvidt lav dose RV kan undertrykke lungecancer-cellevekst via induksjon av for tidlig senescens.
RV er en ikke-toksisk naturlig polyfenolforbindelsen finnes i overflod i og druer, Rødvin morbær andre spiselige planter. Nyere kliniske studier har indikert at RV er godt tolerert og relativt trygt for bruk hos mennesker [5] – [7]. RV har vist seg å hemme formeringen av en rekke kreftceller via inaktivering av forskjellige celleoverlevelsesreaksjonsveier inkludert PI3-kinase /AKT sti [24]. RV har også vist seg å oppvise potensiell Kjemopreventivt aktivitet i flere carcinogen-indusert tumormodeller inkludert bryst, tarm, lever, spiserør og tykktarm [3], [25], [26]. Videre har det blitt rapportert at RV behandling hemmer bukspyttkjertelkreft vekst og forbedrer anticancer effekt av gemcitabin eventuelt via undertrykkelse av NF-КB aktivering og nedregulering av ekspresjon av cyclin D1, COX-2, ICAM-1, MMP-9 og survivin i tumorvev [27]. Selv om det tidligere studier har indikert at RV, ved høye doser, kan hemme proliferasjonen av kreftceller ved å indusere apoptose [28] – [31], er en stor utfordring for bruk av denne CAM er at konsentrasjonen av RV er nødvendig for å indusere apoptose i tumorceller
in vitro
er for stor til å oppnå
in vivo
i en klinisk setting [5] – [7], [32]. Gitt at induksjon av senescens krever en mye lavere konsentrasjon av anticancermidler, og således gir færre uønskede bivirkninger [12], søkte vi å undersøke om en lav dose RV behandling kan hemme veksten av kreftceller gjennom induksjon av for tidlig senescens. I den foreliggende undersøkelse, viser vi at dosen RV behandling lav fører til en betydelig økning av senescens-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) farging og forhøyet p53 og p21 ekspresjon i NSCLC-celler, noe som tyder på at den anticancer virkning av RV er skyldes i hovedsak induksjon av senescence i lungekreftceller. Mekanistiske studier viser at RV-indusert senescence er assosiert med økt DNA DSB sin og ROS produksjon i lungekreftceller. Videre våre data viser også at hemming av ROS produksjon av NAC demper RV-indusert DNA DSB sin og for tidlig alderdom. Til sammen disse funnene viser at dosen RV behandling lavt forårsaker for tidlig alderdom i lungekreftceller via ROS-mediert DNA skade, som markerer et betydelig bidrag av alderdom induksjon til RV kreft effekter.
Resultater
RV hemmer veksten av lungekreftceller på en doseavhengig måte
Tidligere studier har indikert at høyere doser av RV behandling kan inhibere proliferasjonen av tumorceller ved å indusere apoptose [28] – [31], men en stor utfordring for apoptose fremkallende strategi er at konsentrasjonen som kreves for å indusere apoptose i tumorceller
in vitro
er ikke tilgjengelig
in vivo product: [5] – [7], [32]. Derfor er det viktig å finne ut om dosen RV behandling lav påvirker veksten av tumorceller. For å oppnå dette, behandlet vi A549 og H460-lungekreftceller med forskjellige lave doser av RV (0-50 uM) for å undersøke om RV behandling har noen innvirkning på kolonidannelse av NSCLC-celler. Klonogene overlevelsesanalyser viste at til og med så lav som 10 uM av RV behandling i betydelig grad kan undertrykke den kolonidannende aktivitet av A549 og H460-celler (fig. 1A, 1B og 1C). Dataene viser også at RV-indusert undertrykkelse av kolonidannelse korrelerer godt med konsentrasjonene av RV, noe som tyder på at RV behandling hemmer veksten av klonogene NSCLC-celler på en doseavhengig måte.
(A) klonogene overlevelsesanalyser viser at antallet av kreftcelle-avledet kolonier avtar med RV dose. (B) Resultatene av klonogene analyser ble normalisert til den klonogene overlevelses av styre A549-celler, og er uttrykt som% av kontroll. (C) Resultatene av klonogene analyser ble normalisert til den klonogene overlevelses av kontroll H460-celler, og er uttrykt som% av kontroll. **,
p
. 0,01 vs. kontroll
Lav dose RV hemmer lungekreft cellevekst via en apoptose-uavhengig mekanisme
Selv om det har vært vist at høyere doser (100-200 pm) av RV behandling indusere apoptose i tumorceller [28] – [31], var det ukjent om lav dose RV undertrykker veksten av lungekreftceller gjennom induksjon av apoptose. Fordi aktivert kaspase-3 og spaltet PARP er godt dokumenterte målinger av apoptose [33], [34], undersøkte vi om dosen RV behandling lav har noen innvirkning på ekspresjon av aktivert kaspase-3 og spaltet PARP i A549 og H460-celler. Som vist i figur 2, Western blotting data viste at lave doser RV behandlingen ikke forårsaket noen betydelige endringer i ekspresjonen av spaltede PARP og aktivert caspase-3 i enten A549 eller H460-celler. I motsetning til dette, camptothecin (CPT) behandling resulterte i en markert økning i spaltede PARP og aktivert caspase-3-ekspresjon i både A549 og H460-celler (fig. 2A og 2B). Disse resultatene antyder sterkt at lavdose RV inhiberer lungecancer-cellevekst ved hjelp av en apoptose-uavhengig mekanisme.
(A) Western blot analyser ble utført for å bestemme ekspresjon av aktivert kaspase-3 og spaltet PARP i A549-celler. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. (B) Western blot analyser ble utført for å bestemme ekspresjon av aktivert kaspase-3 og spaltet PARP i H460-celler. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
rv induserer for tidlig senescens hos lungecancerceller
Det er blitt foreslått at induksjon av for tidlig senescens er en viktig mekanisme ved hvilken ioniserende stråling og mange kjemoterapeutiske midler utøver sine anticancer effekter [11] – [13], [15], [17], [23]. Derfor søkte vi å undersøke om dose RV behandling lav induserer tidlig alderdom i NSCLC celler. Fordi økt SA-β-gal-aktivitet er et veletablert biomarkør av senescens [16], undersøkte vi om dosen RV behandling lav induserer for tidlig senescens i A549 og H460-celler ved SA-β-gal-farging. Som vist i figur 3A, tyder resultatene på at antallet av SA-β-gal-positive celler senescent økes markert i RV-behandlede versus kontroll A549 og H460-celler. Videre er prosentandelen av SA-β-gal-positive celler øker med dosen av RV, noe som tyder på at RV behandling induserer for tidlig senescens i lungekreftceller på en doseavhengig måte (fig. 3B og 3C).
(A) SA-β-gal farging økt med RV doser hos både A549 celler (øvre panel) og H460 celler (nedre panel). (B) Den prosentandelen av SA-β-gal-positive celler i senescent RV-behandlede og kontroll A549 celler er presentert som gjennomsnitt ± SEM. (C) Prosent SA-β-gal-positive celler i senescent RV-behandlede og kontroll H460-celler er presentert som gjennomsnitt ± SEM. (D) Western blot analyser ble utført for å bestemme ekspresjon av p53, p21 og EF1A i A549-celler. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. (E) Western blot analyser ble utført for å bestemme ekspresjon av p53, p21 og EF1A i H460-celler. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. *,
p
0,05 vs. kontroll; **,
p
. 0,001 vs. kontroll
Vi har også undersøkt uttrykket nivåer av p53 og p21, to viktige molekyler involvert i reguleringen av senescence [12], [15], [17], [35], i RV-behandlede NSCLC-celler. Western blotting data viste at uttrykket nivåer av p53 og p21 ble betydelig økt i RV-behandlede celler, sammenlignet med kontroll A549 og H460 celler (fig. 3D og 3E). Disse resultatene tyder på at p53-p21 veien er involvert i RV-indusert for tidlig senescens i lungekreftceller. Interessant, våre data viser også at RV behandling signifikant nedregulerer ekspresjon av EF1A i A549 og H460-celler (fig. 3D og 3E), noe som tyder på at EF1A kan spille en viktig rolle i regulering av RV-indusert for tidlig senescens i NSCLC-celler.
RV behandling fører til DNA-skader og øker ROS produksjon i lungekreftceller
Mange kjemoterapeutika og stråling dreper kreftceller gjennom induksjon av DNA-skade. Fosforylert H2AX (γH2AX) er en robust markør av DNA DSB sin [36]. For å avgjøre om DNA-skader bidrar til RV-indusert kreft effekter, utførte vi γH2AX foci analyser for å undersøke om RV behandling forårsaker DNA DSB sin i lungekreftceller. Som vist i figur 4, våre data viser at RV behandlingen resulterer i en betydelig økning i dannelsen av γH2AX foci i begge A549 og H460-celler (fig. 4A, 4B og 4C). Ettersom dannelsen av γH2AX foki er en viktig surrogat av DNA DSB [36] Disse resultatene viser for første gang at den anticancer virkning av RV skyldes i det minste delvis til RV-indusert DNA-skade i NSCLC-celler.
(A) DNA DSB ble bestemt ved immunfluorescens-mikroskopi γH2AX som tidligere beskrevet (16). Representative Immunofluorescent bilder av γH2AX foci i RV-behandlet A549 og H460 celler blir presentert. (B) Den prosentandelen av γH2AX foci-positive celler i RV-behandlede A549 celler er presentert som gjennomsnitt ± SEM. (C) Prosent γH2AX foci-positive celler i RV-behandlede H460-celler er presentert som gjennomsnitt ± SEM. (D) Nivåene av ROS ble målt ved DCF-DA-farging og flowcytometrisk analyse ved 24 timer etter behandling RV. Nivåene av ROS i RV-behandlede A549-celler er presentert som gangers endring i forhold til nivåene i kontrollcellene. (E) Nivåene av ROS i RV-behandlede H460-celler er presentert som gangers endring i forhold til nivåene i kontrollcellene. *,
p
0,05 vs. kontroll; **,
p
. 0,01 vs. kontroll
Vi og andre har vist at ROS spille en avgjørende rolle som formidler gentoksisk stress indusert DNA skade [37], [ ,,,0],38]. Derfor hypotese vi at RV kan forårsake DNA DSB sin via økt ROS produksjon i NSCLC celler. For å teste denne hypotesen, undersøkte vi om RV behandling har noen innvirkning på ROS produksjon i lungekreftceller. DCF-DA-farging og strømningscytometriske analyser viste at nivåene av ROS ble markert økt i RV-behandlede A549 og H460-celler sammenlignet med den for kontrollceller (fig. 4D og 4E). Disse resultatene antyder at RV kan fremkalle kreft celle lunge for tidlig senescens via ROS-mediert DNA-skade.
NAC demper RV-indusert DNA-skade og for tidlig senescens hos lungecancerceller
Selv om våre data har vist at RV-indusert DNA-skader er assosiert med økt ROS produksjon hos NSCLC-celler (fig. 4), det har ennå ikke bestemt om hemming av ROS produksjon ved hjelp av antioksidanter kan hindre RV-indusert DNA skade og tidlig alderdom. For dette formål vi pre-inkuberes cellene med NAC før RV behandling for å bestemme om NAC kan svekke RV-indusert DNA DSB og for tidlig senescens i lungekreftceller. Som vist i figur 5A, våre data viser at forbehandling med NAC hemmer i betydelig grad dannelsen av RV-indusert γH2AX foci i A549 og H460-celler. Videre SA-β-gal fargingsresultater viser at prosentandelen av RV-indusert premature senescent celler blir vesentlig redusert i NAC-behandlede celler (fig. 5D og 5E). Samlet utgjør disse funnene sterkt støtter hypotesen om at RV induserer kreft celle lunge tidlig alderdom via ROS-mediert DNA-skader.
(A) DNA DSB sin ble bestemt av γH2AX immunfluorescens mikroskopi som tidligere beskrevet (16). Representative Immunofluorescent bilder av γH2AX foci i A549 og H460 celler blir presentert. (B) Hemming av ROS ved NAC (5 mm) reduserer RV (30 mm) indusert γH2AX foci i A549 celler. (C) Hemming av ROS ved NAC (5 mm) reduserer RV (30 mm) indusert γH2AX foci i H460 celler. (D) Hemming av ROS ved NAC demper RV-indusert for tidlig alderdom i A549 celler. (E) Hemming av ROS ved NAC demper RV-indusert for tidlig alderdom i H460 celler. **,
p
0,001 vs. kontroll.
#
p
. 0,01 vs. RV
RV induserer Nox5 uttrykk i lungekreftceller
Neste, vi søkt å finne mekanismene der RV induserer ROS generasjon i kreftceller. Det ble rapportert at økt intracellulær cyklisk AMP (cAMP) kan bidra til mitokondrielle ROS opphopning [39]. Interessant, en fersk studie av Park et al. har vist at RV behandling øker nivået av cAMP i mus C2C12-celler [40]. For å avgjøre om RV endrer cAMP-nivåer og i sin tur induserer ROS generasjon i lungekreftceller, vi har oppdaget cAMP-nivåer i A549 og H460 celler etter annen gjør av RV behandling. EIA Resultatene viser at RV behandling ikke har noen signifikant effekt på cAMP-nivåer i A549-celler (Figur S1A). Mer interessant, dataene viser at RV hemmer nivået av cAMP i H460-celler (Figur S1B). Disse resultatene tyder på at cAMP ikke kan være en sentral aktør i formidling RV-indusert ROS generasjon i lungekreftceller.
NADPH oksidase (Noxs) er en familie av trans enzymer som genererer superoksid og andre ROS [41] . For bedre å forstå hvordan RV induserer ROS generasjon i kreftceller, undersøkte vi om RV behandling har noen innvirkning på uttrykk for Nox1, Nox2, Nox3, Nox4 og Nox5 i NSCLC celler. Sanntids RT-PCR-resultater indikerer at Nox1, 2 og 5 er rikelig uttrykt i både A549 og H460-celler, mens Nox 3 og 4 er knapt synlig i lungekreftceller (figur S2). Overraskende, våre data viser at RV behandling selektivt øker Nox5 uttrykk i både A549 og H460 celler (fig. 6A og 6C), noe som tyder på at RV-indusert ROS generasjon i kreftceller er sannsynlig skyldes økt Nox5 uttrykk. Gitt de viktige rollene antioksidant enzymer som mitokondrie superoxide dismutase (SOD) og thioredoxin (TXN) i moduler intracellulær ROS balanse [42], bestemte vi oss for å finne ut om RV behandling påvirker uttrykket av SOD og TXN i lunge kreftceller. The real-time PCR data viser at RV behandling bare fører til en beskjeden økning (mindre enn to ganger) i SOD2 uttrykk i A549 celler, men har ingen effekt på uttrykk for SOD1, SOD2 og TXN mRNA i H460-celler (fig. 6B og 6D). Sammen utgjør disse data tyder på at RV kan indusere ROS generasjon i kreftceller gjennom opptil regulerende Nox5 uttrykk.
(A) Cellene ble behandlet med 50 mikrometer av RV eller DMSO som kjøretøy kontroll. Tjuefire timer etter RV behandling, ble uttrykket nivåer av Nox1, Nox2, og Nox5 mRNA bestemmes ved hjelp av real-time RT-PCR. (B) Uttrykket nivåer av SOD1, SOD2 og TXN i A549 celler ble bestemt ved real-time RT-PCR. (C) Et uttrykk nivåer av Nox1, Nox2, og Nox5 i H460-celler er presentert som gangers endring (gjennomsnitt ± SEM). (D) Uttrykket nivåer av SOD1, SOD2 og TXN i H460 celler blir presentert. **,
p
. 0,001 vs. kontroll
Diskusjoner
Cellular alderdom er en tilstand av permanent cellesyklus arrest som kan utløses av en rekke av spenninger, inkludert DNA-skader, telomerer forkortes og oksidativt stress. Senescens begrenser levetiden og proliferativ kapasitet av celler, og derfor induksjon av aldringsprosessen anses som en viktig mekanisme for kreft forebygging [20] – [22]. Enda viktigere, er økende bevis vist at terapi-fremkalt senescens er en kritisk virkningsmekanisme for mange kjemoterapeutiske midler og strålebehandling, [11], [12], [15], [17], [23]. Men bidraget fra senescence induksjon til RV kreft og chemopreventive effekter har ikke vært godt belyst. Her gir vi eksperimentelle data som viser at dosen RV behandling lav hemmer veksten av lungekreft celler via en apoptose-uavhengig mekanisme. Resultatene viser at RV kan utøve sin anticancer og kjemopreventive aktiviteter via induksjon av senescens i kreftceller. I samsvar med våre observasjoner, Rusin et al. rapporterte også at RV behandling induserer senescens-lignende fenotype i kreftceller [43]. Dette er en betydelig funn fordi induksjon av senescens, i motsetning til apoptose, krever mye lavere konsentrasjon av RV, noe som tyder RV kan være nyttig klinisk. Videre disse studiene understreker viktigheten av senescence induksjon i formidling RV chemopreventive og kreft effekter.
Det har vært godt etablert at induksjon av DNA-skade er en sentral mekanisme som mange cytostatika inkludert ioniserende stråling dreper kreftceller [13], [15], [38], [44]. Av de forskjellige typer av DNA-skade, DNA DSB er de mest cytotoksiske på grunn av deres store potensial for å forårsake celledød og /eller cellesyklus-stans. Dermed ble en økt kapasitet på DNA-skade reparasjon i tumorceller tenkt å være en viktig bidragsyter til terapi-motstand under kreftbehandling [45]. Interessant nok har det vist seg at mange DNA-skadende midler, slik som ioniserende stråling kan indusere DNA-skade-mediert for tidlig senescens i kreftceller, tyder på at disse terapeutiske midlene kan utøve sin kreft effekter via DNA-skade-mediert for tidlig senescens [13], [ ,,,0],15]. Selv om våre data har vist at RV induserer for tidlig senescens i lungekreftceller på en doseavhengig måte, var stort sett ukjent om DNA-skade er involvert i RV-indusert senescens i tumorceller. Denne studien viste at γH2AX foci, en viktig surrogat av DNA DSB sin, ble markert økt i RV-behandlet NSCLC celler sammenlignet med kontrollceller. Disse data tyder på at DNA-skade-indusert for tidlig senescens kan bidra til den anticancer virkningene av RV. I overensstemmelse med våre observasjoner, ble det funnet at RV kan indusere plasmid DNA pauser i nærvær av Cu (II) og under oksidative betingelser [46]. Disse resultatene støtter hypotesen om at lavdose RV behandling hemmer veksten av lungekreftceller via DNA-skade-indusert for tidlig senescens.
Aktivering av p53-p21 veien ved DNA-skade har blitt vist å være en viktig mekanisme som ligger til grunn SIPS [12], [15], [17], [18]. Her viser vi at RV-indusert for tidlig senescens er forbundet med økt ekspresjon av p53 og p21 i NSCLC-celler, noe som antyder at aktivering av p53-p21 reaksjonsvei kan spille en viktig rolle i modulering av RV-indusert senescens i lungekreftceller. Enda viktigere, det ble også funnet at RV-indusert senescens korrelerer godt med en signifikant reduksjon i EF1A ekspresjon i A549 og H460-celler. Disse nye funn demonstrerer for første gang, blir det nedregulering av EF1A involvert i RV-indusert for tidlig senescens i lungekreftceller. I samsvar med disse observasjonene har en fersk studie antydet at redusert uttrykk for EF1A er en potensiell biomarkør for tidlig alderdom [47]. Imidlertid vil videre studier være nødvendig for å definere den eksakte rolle EF1A i moduler RV-indusert for tidlig alderdom i kreftceller.
Mange cytostatika og ioniserende stråling ødelegge kreftceller i stor grad gjennom generering av ROS [48]. Dessuten økte ROS kan utløse oksydativ DNA-skade og forårsake DNA DSB, og dermed fører til for tidlig senescens [37]. For å finne ut hvilken rolle ROS i RV-indusert for tidlig alderdom i lungekreftceller, vi undersøkte nivåene av ROS i RV-behandlet A549 og H460 celler ved hjelp av DCF-DA flekker og strømningscytometriske analyser. Dataene viser at RV-indusert senescens er assosiert med økt ROS-produksjon og DNA DSB i lungekreftceller, tyder på at RV kan indusere for tidlig senescens i lungekreftceller via ROS-mediert DNA-skade. Det viktige bidrag fra ROS til RV-indusert DNA-skade og for tidlig senescens ble ytterligere bekreftet ved observasjoner at inhibering av ROS produksjon av NAC demper RV-indusert DNA-skade og begynnende alderdom i NSCLC-celler. I samsvar med disse observasjonene, ble en pro-oksidant virkning av RV også observert i U937-leukemiceller og er karakterisert ved uttømming av GSH og en økning i ROS-produksjon [49]. Videre tidligere studier av Hadi og medarbeidere viste også at RV kan øke ROS generasjon og ROS-indusert DNA skade i humane perifere lymfocytter [50], [51]. Sammen utgjør disse funnene viser at lav dose RV hemmer veksten av lungekreft celler via induksjon av senescence gjennom ROS-mediert DNA-skader.
Det er verdt å merke seg at det er bevis for at RV kan fungere som en ROS åtseldyr i normale celler for å beskytte mot ioniserende stråling induserte oksidativt stress og skade vev [52], som tyder på at RV kan ha forskjellige effekter på ROS-produksjon i normal i forhold til kreftceller. Gitt at avvikende redox-systemer blir ofte observert i mange tumorceller [48], [53], [54], er det mulig at RV kan selektivt undertrykke veksten av tumorceller med liten eller ingen toksisitet overfor normale celler på grunn av deres differensial redoks status. Etter avtale med denne hypotesen, våre data viser at RV behandling har ingen signifikant effekt på uttrykk for SOD1, SOD2 og TXN i H460 lungekreftceller, selv om det ble rapportert at RV kan indusere en betydelig (mer enn 6 ganger) økning i SOD2 ekspresjon i normale celler [55]. Enda viktigere, våre studier viser for første gang at RV øker selektivt Nox5 uttrykk hos NSCLC-celler, noe som tyder på at RV kan indusere ROS generasjon i kreftceller via oppregulering Nox5 uttrykk.
Materialer og metoder
reagenser
Resveratrol (Trans-3, 4 «, 5-trihydroxystilnene) og alle andre kjemikalier ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og andre kulturmedia ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Kanin-anti-human p53-antistoff og kanin anti-humant EF1A monoklonalt antistoff ble anskaffet fra Cell Signaling (Danvers, MA). Mus anti-humant p21 monoklonalt antistoff ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology. Monoklonale β-actin antistoff ble kjøpt fra Sigma. En begynnende alderdom-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) farging kit ble kjøpt fra Cell Signaling. Musen anti-fosfor-histon H2AX (γH2AX) monoklonalt antistoff ble kjøpt fra Millipore (Billerica, MA). TRIzol reagent og Super III første-standen syntese system ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). Syklisk AMP (cAMP) EIA kit ble kjøpt fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).
Cellelinjer og kultur
Menneskelig ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer A549 og H460 ble kjøpt fra American Type Culture Collection. A549-celler ble dyrket i DMEM medium inneholdende 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 100 mikrogram /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen). H460-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 100 mikrogram /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen).
klonogene overlevelsesanalyse
klonogene analyser var utført for å bestemme effektene av RV behandling på kolonidannende evne til NSCLC-celler. I korthet, A549 og lungekreft H460-celler ble dyrket ved lav tetthet i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av RV eller DMSO som bærerkontroll i 60 mm skåler i 10 til 12 dager for å tillate formasjonscellekolonier. Kolonier ble fiksert og farget med 0,5% krystallfiolett (Sigma) i metanol i 30 min. Antallet kolonier (≥ 50 celler) ble scoret ved hjelp av et mikroskop.
Senescence-forbundet β-galaktosidase (SA-β-gal) farging
I situ farging av SA-β-gal ble utført ved hjelp av en senescence β-galaktosidase flekker kit (Cell Signaling) som tidligere beskrevet [56].
Western blotting-analyse
A549 og H460-celler ble behandlet med forskjellige doser av RV eller DMSO som kontroll. Totale celleproteiner ble fremstilt ved 24 timer etter behandling ved hjelp av cellelyseringsbuffer (Cell Signaling) supplert med en cocktail av proteinaseinhibitorer (Sigma). Western blotting-analyse ble utført som tidligere beskrevet [56]. Kort sagt ble femti mikrogram av proteinprøver løst på 10% Mini-Protean TGX geler (Bio-Rad) og overført til 0,2 um PVDF-membran (Millipore). Blottene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk i 1-2 timer ved romtemperatur og deretter probet med primære antistoffer og inkubert ved 4 ° C over natten. Etter grundig vasking med TBS-T, ble blottene inkubert med passende HRP-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Proteinbånd ble oppdaget ved hjelp av en ECL Plus Western blotting Detection System (GE Healthcare Life Science).
Immunofluorescent mikroskopisk analyse av γH2AX foci
Cellene ble dyrket på 4-brønn kammer lysbilder over natten og neste dag behandlet med RV eller DMSO (kjøretøykontroll). Ved slutten av ønskede behandlinger ganger, ble cellene fiksert med iskald 4% paraformaldehyd i 10 min og vasket to ganger med PBS. Deretter ble cellene permeabilisert med 0,2% Triton X-100 /PBS på is i 10 min.
