Abstract
DNA metylering spiller en viktig rolle i kreftutvikling og reversibilitet av denne epigenetisk modifikasjon gjør det til et potensielt terapeutisk mål. Hittil har DNA metyltransferase hemmere (DNMTi) ikke vist klinisk effekt hos prostatakreft, med en av de største hindringene være manglende evne til å overvåke narkotika aktivitet under rettssaken. Gitt den høye frekvensen og spesifisitet av
GSTP1
DNA metylering i prostatakreft, undersøkte vi om
GSTP1
er en nyttig markør for DNMTi behandlingseffekten. LNCaP prostatakreftceller ble behandlet med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-CDR), enten med en enkelt høy dose (5-20 uM), hver annen dag (0,1-10 uM) eller daglig (0,005 til 2,5 mikrometer). En daglig behandlingsregime med 5-aza-CDR var optimal, med sterk undertrykkelse av celleproliferasjon oppnås med doser på 0,05 pM eller høyere (p 0,0001) og induksjon av celledød fra 0,5 um (p 0,0001). I motsetning til dette, behandling med en enkelt høy dose på 20 uM 5-aza-CDR hemmet celleproliferasjon, men var ikke i stand til å indusere celledød. Demetylering av
GSTP1
ble observert med doser på 5-aza-CDR som forårsaket betydelig undertrykkelse av celleproliferasjon (≥0.05 mm). Re-uttrykk for GSTP1 protein ble kun observert ved doser på 5-aza-CDR (≥0.5 mm) forbundet med induksjon av celledød. Behandling av LNCaP-celler med en mer stabil DNMTi, Zebularine kreves minst 100 ganger høyere dose (≥50 uM) for å hemme proliferasjon og var mindre potent til å indusere celledød, noe som tilsvarte en mangel på GSTP1 protein re-ekspresjon. Vi har vist at
GSTP1
DNA metylering og protein uttrykk status er korrelert med DNMTi behandlingsrespons i prostatakreftceller. Siden
GSTP1
er metylert i nesten alle prostatakreft, våre resultater garanterer sin testing som en markør for epigenetisk terapi respons i fremtidige kliniske studier. Vi konkluderer med at DNA-metylering og protein uttrykk status for
GSTP1
er gode indikatorer på DNMTi effekt
Citation. Chiam K, Centenera MM, Butler LM, Tilley WD, Bianco-MIOTTO T ( 2011) GSTP1 DNA Metylering og Expression Status er et tegn på 5-aza-2′-Deoxycytidine Effekt i human prostata kreft celler. PLoS ONE 6 (9): e25634. doi: 10,1371 /journal.pone.0025634
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 7 mars 2011; Godkjent: 08.09.2011; Publisert: 28.09.2011
Copyright: © 2011 Chiam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Health and Medical Research Council (627185, WDT, LMB, TBM), US Department of Defense (W81XWH-04-1-0017, WDT, LMB), Kreft Australia /Prostate Cancer Foundation of Australia ( 627229, LMB, WDT), Prostate Cancer Foundation of Australia Utstyr Grant (EG0809, WDT, LMB, TBM), W. Bruce Hall Cancer Council of SA Stipendiat (TBM), og en Cancer Council SA Seniorstipendiat (LMB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de vanligste diagnosen mannlige kreft i vestlige land. Nåværende behandlingsformer for klinisk lokalisert sykdom inkluderer kirurgisk fjerning av prostatakjertel (prostatektomi) og /eller strålebehandling med eller uten androgen deprivasjon terapi (ADT). Siden oppdagelsen i 1940, er det prostatakreft avhengig av de mannlige kjønnshormoner [1], først kastrerings og etterfølgende ulike former for ADT, enten alene eller i kombinasjon med androgen reseptor (AR) antagonister, har vært den viktigste terapi for metastatisk sykdom. Etter en innledende varierende varighet av tumor regresjon, mest metastatisk prostatakreft utvikle seg til en «kastrering-resistent» scenen som ikke responderer på ADT. Foreløpig er det begrenset behandlingstilbud tilgjengelig for kastrering resistent prostatakreft og dermed er det et stort behov for å utvikle nye behandlingsformer.
Det er godt etablert at epigenetiske forandringer er vanlige hendelser i kreftutvikling, blant annet prostatakreft, som kan føre til avvikende ekspresjon av kritiske gener så som tumor-suppressorer og onkogener. I motsetning til DNA mutasjoner, epigenetiske forandringer er kjemisk reversible ved midler kjent som epigenetiske hemmere og er derfor potensielle terapeutiske mål. Eksempler på epigenetiske inhibitorer som har vist suksess som terapeutiske midler innbefatter DNA-metyltransferase-inhibitorer (DNMTi), 5-aza-cytidin (5-aza-CR eller VIDAZA) og dens mer potent analog 5-aza-2′-deoksycytidin (5- aza-CDR eller Decitabine). 5-aza-CR og 5-aza-CDR er nukleosid DNMTi utviklet først som kjemoterapeutika som for tiden blir brukt til behandling av myelodysplastisk syndrom (MDS) [2]. De demethylating handling av 5-aza-CR og 5-aza-CDR er avhengige av deres evne til å innlemme i replikere DNA og kovalent binde til DNMT1 enzymet på en irreversibel måte, noe som fører til DNMT1 proteindegradering [2], [3]. Som DNMT1 er nødvendig for å opprettholde DNA metylering under replikering, senere medfører nedbrytning av DNMT1 i et tap av DNA metylering.
Aberrant uttrykk for epigenetiske modifisere enzymer involvert i reguleringen av DNA metylering har blitt observert i alle faser av prostatakreft progresjon [4], [5], [6]. Globale nivåer av 5-metylcytosin og epigenetiske endre enzymer involvert i DNA metylering (dvs. DNMTs) forutsi sannsynligheten for sykdomsutvikling i prostatakreft. Dette funn tyder på at DNA-metylering kan være viktig i utviklingen av prostatakreft og derfor DNMTi bør betraktes som en potensiell behandlingsalternativ [7], [8], [9]. Mens
in vitro
eksperimenter og dyremodeller har vist at 5-aza-CDR har anti-tumor aktivitet i en rekke kreftformer, inkludert prostata kreft [10], [11], [12], [13], [14 ], har kliniske studier med 5-aza-CDR for behandling av solide svulster ikke vært vellykket på grunn av legemiddelrelaterte bivirkninger som myelosuppresjon, kvalme og oppkast [15], [16], [17]. I tillegg til toksisitet spørsmål, effektiviteten av levering og opptak av 5-aza-CDR til tumorvev, det er usikkerhet om den optimale doseplan for bestemte krefttyper [18]. Hittil har bare en liten fase II studien med 5-aza-CDR i prostatakreft blitt publisert, om lag ti år siden [16]. Mens det er pågående kliniske studier for 5-aza-CDR i ulike solide svulster, ingen av disse studiene er kreftspesifikke heller ikke de har prostatakreft (National Institutes of Health, USA, clinicaltrials.gov).
In vitro
studier som undersøker effekten av 5-aza-CDR i prostatakreft cellelinjer (se tabell S1) har brukt ulike behandlingsregimer og ulike definisjoner for lav og høy 5-aza-CDR doser, noe som gjør det vanskelig å sammenligne mellom studier og definere optimal behandling regime, inkludert doseplan for prostatakreft. Overraskende, svært få av
in vitro
studier (tabell S1 A) har undersøkt effekten av 5-aza-CDR på spredning og overlevelse av prostata kreft celler, men snarere har undersøkt effekten av 5-aza- CDR på genuttrykk for å identifisere kandidat epigenetiske regulerte gener (tabell S1B).
Hensikten med denne studien var å undersøke doseavhengige effekter av 5-aza-CDR i prostatakreftceller med sikte på å gir grunnlag for å utvikle en optimal 5-aza-CDR behandling regime for prostatakreft. Vi har også undersøkt den relative toksisitet av 5-aza-CDR og Zebularine i LNCaP prostatakreftceller. Zebularine er en cytidin-analog som har lignende funksjoner til 5-aza-CDR som en demethylating middel, men er mindre giftige og har en mer stabil halveringstid (~508 timer ved 37 ° C, pH 7) enn 5-aza-CDR ( 12 timer ved 37 ° C, pH 7) [19], [20]. Identifisering av en god markør for DNMTi effekt for kliniske forsøk, omtrent som målingen av serum PSA-nivåer for å overvåke effekten av ADT [21], ville ha potensial til å hjelpe til klinisk behandling av prostata kreftpasienter behandlet med epigenetiske terapier. For å undersøke effekten av 5-aza-CDR og Zebularine i prostatakreftceller, undersøkte vi DNA metylering og uttrykk status for glutation-S-transferase P1 (
GSTP1
) genet.
GSTP1
er hypermethylated i nesten alle menneskelige prostata kreft og dens promoter DNA metylering nivå er i stand til å skille mellom benign prostatahyperplasi og ulike grader av prostata adenokarsinom [6], [22], [23], [24] [25]. Mens dagens studier har fokusert på å bruke
GSTP1
som en potensiell markør for tidlig deteksjon av prostatakreft, foreslår vi at vurderingen av DNA metylering av
GSTP1
promoter-regionen, samt uttrykk for GSTP1 , har potensial til å være et nyttig verktøy for å bestemme DNMTi effekt på prostatakreft.
Materialer og metoder
Måling av celleviabilitet
LNCaP og PC3 menneskelige prostata carcinoma celler ( American Type Culture Collection, ATCC) ble holdt i RPMI 1640 supplert med 5% eller 10% føtalt bovint serum (FBS). 5-aza-CDR og Zebularine (Sigma, A3656 og Z4775) ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) og Hanks bufret saltoppløsning henholdsvis. For enkelt og hver annen dag behandling med 5-aza-CDR, ble cellene sådd ut i triplikat i 24-brønners plater i en tetthet på 2,5 x 10
4 celler per brønn i 1 ml RPMI-medium. For 5-aza-CDR daglig behandling og Zebularine behandling ble cellene sådd ut i triplikat i 12-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
4 celler per brønn i 1 ml RPMI-medium. Cellene ble latt bli koblet til 241h eller 48 timer, når celle konfluens var nådd, og så inkubert med medium inneholdende 5-aza-CDR ved konsentrasjoner på 0-20 uM eller Zebularine ved konsentrasjoner på 50-1000 pM. For etterfølgende eller flere behandlinger, ble frisk 5-aza-CDR eller Zebularine fortynnet i medium tilsatt til cellene. Media som inneholder de respektive agenter ble tilberedes fra 10 mm 5-aza-CDR og 70 mm Zebularine aksjer før hver behandling. Cellene ble trypsinert og telt ved bruk av et hemocytometer på de angitte tidspunkter etter behandlingsstart og celle levedyktighet vurderes av trypan blått fargestoff utelukkelse som tidligere beskrevet [26]. Data er uttrykt som gjennomsnittet +/- SE av triplikatbrønner og er representative for minst to uavhengige eksperimenter.
Immunoblotting
LNCaP-celler ble sådd ut i 6-brønns plater ved en densitet på 2 x 10
4 celler per brønn i 2 ml RPMI-medium inneholdende 10% FBS. Cellene fikk feste seg i 24 timer før mediet erstattet med medium inneholdende behandlinger. Celler ble lysert ved tilsetning av radioimmunopresipitasjonsanalyse analyselyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100) inneholdende mini-komp proteasehemmere pellets (Roche). Lysater (15-30 ug) ble underkastet elektroforese ved 5% eller 12% polyakrylamidgeler, overført til nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences), og blokkert i 5% ikke-fettholdig tørrmelk i TBS inneholdende 0,05% Tween 20 over natten. Immundeteksjon ble utført med det spesifikke primære antistoff fortynnet i 1% ikke-fettholdig tørrmelk i TBS inneholdende 0,05% Tween 20. GSTP1 antistoff (Chemicon, AB8902) ble anvendt ved en fortynning på 1:5000 og inkubering over natten ved 4 ° C. HSP90-antistoff (Santa Cruz Biotechnology) ble benyttet ved en fortynning på 1:1000 og 30 minutters inkubering ved romtemperatur. Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-sekundært antistoff (DAKO, E0432) ble anvendt ved en fortynning på 1:2000 og 30 minutters inkubering ved romtemperatur. Resultatene ble visualisert på Hyper (GE Healthcare) med forbedret chemiluminescence deteksjon (GE Healthcare).
DNA metylering analyse
Etter celle levedyktighet vurdering, de resterende LNCaP celler ble samlet inn for genomisk DNA ekstraksjon ved hjelp av TES (10 mM Tris-HCl ved pH 8, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA) buffer, proteinase K og 20% SDS som tidligere beskrevet [27]. DNA (1-2 mikrogram per prøve) var sulfitt modifisert med MethylEasy ™ DNA bisulfitt Modification Kit (menneskets genetiske signaturer Pty Ltd) i henhold til produsentens protokoll. Et totalt volum på 25 ul eller 50 ul PCR-reaksjonsblanding ble gjort med 3-5 pl av bisulfitt modifiserte DNA og 2,5 enheter DNA-polymerase HotstarTaq (Qiagen).
GSTP1
Metylering Spesifikke Polymerase kjedereaksjon (MSP) [28] og kombinert Bisulfite restriksjonsanalyse (COBRA) [29] primere ble kjøpt fra GeneWorks (South Australia, Australia).
GSTP1
MSP Primersekvensene var som tidligere beskrevet [24] og alle primersekvensene anvendt i denne studien er gitt i figur S1. De annealing temperaturer for de respektive primere var: 40 sykluser ved 64,3 ° C for metylert
GSTP1
MSP primere; 45 sykluser ved 61,6 ° C i unmethylated
GSTP1
MSP primere; 45 sykluser ved 56,8 ° C for
GSTP1
COBRA primere. PCR-produkter fra
GSTP1
COBRA analyser ble kuttet med restriksjonsenzymene BstUI og HhaI (New England Biolabs). PCR-produkter ble visualisert ved agarosegel electropheresis med AlphaImager 2200 gel dokumentasjonssystem (San Leandro).
Statistisk analyse
En vei variansanalyse (ANOVA) med en post-hoc Dunnet multippel sammenligningstest ble anvendt for å sammenligne cellenes levedyktighet mellom behandlingene og bilen kontroll når en enkelt tids-punktet ble vurdert. Toveis ANOVA med en post-hoc Bonferroni test ble brukt for å sammenligne celleviabilitet mellom behandlinger og bilen kontroll når flere tidspunkter ble vurdert. Analyser ble utført med GraphPad Prism 5-programvaren (GraphPad Software, Inc., CA USA) og statistisk signifikans ble satt til p. 0,05 (tosidig)
Resultater
Daglig 5- aza-CDR behandling er nødvendig for å indusere optimal hemming av spredning og induksjon av celledød i LNCaP prostatakreftceller
for å undersøke effekten av ulike 5-aza-CDR behandlingsplaner, utførte vi celleproliferasjon og levedyktighet analyser på LNCaP prostatakreftceller og sammen følgende: en enkelt behandling, alternative dag behandlinger og daglige behandlinger. Når sammenlignet med kontrollen (bærer), en enkelt behandling av 5-aza-CDR effektivt undertrykkes LNCaP prostatacancer celleproliferasjon ved alle konsentrasjoner som brukes (5-20 pM) (figur 1A, Dag 4: p 0,001 til 5 uM og p 0,0001 for 10, 20 um, dag 6: p 0,0001 for alle doser), men ikke induserer betydelig celledød 6 dager etter behandling (figur 1B). Når 5-aza-CDR ble tilsatt hver annen dag (alternativ dagers behandling), lavere doser av 5-aza-CDR (0,1, 0,5 og 2,5 uM) sammenlignet med doser brukt i enkelt behandlingsskjemaet resulterte i en signifikant doseavhengig inhibering av celleproliferasjon sammenlignet med vehikkelbehandlede LNCaP-celler (figur 1C, dag 4 og 6: p 0,0001 for alle doser). Kun doser av 5-aza-CDR av 2,5 uM eller større induserte signifikant celledød når sammenlignet med bærerbehandlede celler (figur 1D, Dag 6: p 0,001 til 2,5 uM og p 0,0001 til 10 uM). I kontrast til daglig behandling av 5-aza-CDR oppnådd betydelig hemming av proliferasjon ved lavere konsentrasjoner (0,05 mm) (figur 2A, Dag 6: p 0,05 for 0,05 mikrometer, p 0,001 for alle doser 0,5 mikrometer eller mer, Dag 8 : p 0,05 for 0,01 mikrometer og p 0,001 for alle doser 0,05 mikrometer eller større) og økt celledød i LNCaP celler (figur 2B, Dag 8: p 0,001 for doser 0,5 mikrometer eller større) sammenlignet med tilsvarende doser gitt hver andre dag. Doseavhengig hemming av proliferasjon ble oppnådd med 5-aza-CDR daglige doser på 0,05 pM eller større resulterer i en 62% reduksjon i celletallet sammenlignet med bærerbehandlede celler og fullstendig inhibering av proliferasjon ved doser på 0,5 pM eller høyere (figur 2A og 2E, p 0,0001). Ved doser som forårsaket fullstendig inhibering av proliferasjon, var det også en signifikant økning i celledød, på ca. 3-fold, når sammenlignet med vehikkel-kontroll (figur 2B og 2F, s 0,0001).
LNCaP prostata kreftceller (2,5 x 10
4 celler per brønn i 24-brønners plater) ble behandlet med økende doser av 5-aza-CDR (5-20 uM) administrert (A-B) én gang på dag 0 eller (C- D) med økende doser av 5-aza-CDR (0,1-10 mm) fylles annenhver dag for opptil 6 dager. (A) og (C) ble cellene tellet med jevne mellomrom ved hjelp av et hemocytometer, og antallet levedyktige celler ble bestemt ved trypan blå eksklusjon fargestoff. (B) og (D) antallet av døde celler er uttrykt som en prosentandel av det totale antall celler tellet. Data ved hver tids-punkt representerer gjennomsnittet +/- SE av triplikate brønner. * To-veis ANOVA: p 0,0001 for (A), (C) og (D) (10 uM); p. 0,001 for (D) (2,5 mm) i forhold til kjøretøykontroll (kjt) på siste dag av behandling
(A-B) LNCaP og (C-D) PC3 prostatakreftceller (1 x 10
4 celler per brønn i 12-brønners plater) ble behandlet med økende doser av 5-aza-CDR (0,005 til 2,5 uM) fylles daglig i opptil 8 dager. (A) og (C) ble cellene tellet med jevne mellomrom ved hjelp av et hemocytometer, og antallet levedyktige celler ble bestemt ved trypan blå eksklusjon fargestoff. (B) og (D) antallet av døde celler er uttrykt som en prosentandel av det totale antall celler tellet. (E) og (F) relativ cellelevedyktighet følgende 6 eller 8 dager etter behandling med 5-aza-CDR ble presentert som prosent levedyktige celler sammenlignet med bærerkontroll (Veh) og relativ celledød som folden av prosent av døde celler sammenlignet med kjt kontroll. Data ved hver tids-punkt representerer gjennomsnittet +/- SE av triplikate brønner fra minst to eksperimenter. * To-veis ANOVA: p 0,05 for (A) (0,01 mm); p 0,001 for (A) (0,05 til 2,5 uM), (B) og (D) (0,5 pM); p 0,0001 for (C) og (D) (1, 2,5 mm) i forhold til kjøretøykontroll (kjt) på siste dag av behandling
Effekter av 5-aza-CDR på prostatakreft. celleviabilitet er uavhengig av AR
for å finne ut om effekten av 5-aza-CDR i LNCaP cellene var avhengig av en funksjonell AR, en daglig behandling tidsplan, ble også utført i PC3 celler, som mangler et funksjonelt AR. Ved behandling med 5-aza-CDR i doser på 0,005 til 2,5 uM, var det en tilsvarende dose-avhengig hemming av proliferasjon og induksjon av celledød i PC3-celler som det var i LNCaP-celler (figur 2A-D). Mens en omtrentlig tre gangers induksjon av celledød ble observert med 0,5 uM 5-aza-CDR i begge cellelinjer (figur 2f), i PC3-celler, lavere doser av 5-aza-CDR (0,005 uM og 0,01 uM) resulterte i en signifikant reduksjon i celletall (p 0,0001, figur 2E), og dette skjedde på et tidligere tidspunkt-punkt (4 dager) sammenlignet med LNCaP-celler (6 dager) ble behandlet identisk (figur 2A og 2C). Siden 5-aza-CDR er avhengig av delende celler for inkorporering for å fremkalle dets virkninger, forskjellen i doblingstid mellom de 2 cellelinjene, omtrent 24 timer i PC3-celler sammenlignet med 48 timer i LNCaP-celler, kan forklare den økede styrken av fem -aza-CDR på PC3 celle levedyktighet. Androgen-uavhengig inhibering av proliferasjon og induksjon av celledød ved 5-aza-CDR i prostatakreftceller ble ytterligere bekreftet ved cellelevedyktigheten analyser utført i LNCaP-celler dyrket i steroid-utarmet medium (figur S2).
forlengede 5-aza-CDR behandlingsresultater i lignende celledød uavhengig av behandlingsregimet
for ytterligere å karakterisere forskjellene mellom de alternative dag og daglig behandling regime, den høyeste alternativ dagers behandling (10 mm) og høyeste daglige behandling (2,5 uM) ble sammenlignet i en lengre vekstkurve (figur 3). LNCaP prostata kreft celler ble behandlet med kjøretøy kontroll eller 5-aza-CDR fylles annenhver dag eller daglig, som ovenfor. Celleviabilitet og celledød ble bestemt etter 6 dagers behandling. Ett sett med celler og deretter fortsatte å motta 5-aza-CDR fylles annenhver dag eller hver dag inntil dag 12 (betegnet som 10 uM-12d eller 2,5 uM-12d, figur 3), mens det andre settet av celler mottatte media inneholdende bærerkontrollen ( betegnet som 10 uM-6d eller 2,5 uM-6d, figur 3). Etter 6 dagers behandling, både den alternative dagen og daglig behandlingsregimer indusert veksthemming sammenlignet med bærerkontroll, men bare den daglige behandling resulterte i celledød (figur 3). Som kontrollcellene hadde nådd sammenflytning av dag 6, ble disse cellene utelatt for resten av forsøket. Ved fortsatt behandling enten regime mengden av celledød fortsatte å øke etter 12 dager, og nådde 61,4% for den alternative dagers behandling og 68,6% for daglig behandling. Interessant, celler som bare mottok behandling i 6 dager viste ekvivalente nivåer av celledød til de som mottok behandling i 12 dager (figur 3).
(A) og (C) LNCaP prostatakreftceller (2,5 x 10
4 celler per brønn i 24-brønners plater) ble behandlet med 10 uM 5-aza-CDR eller bærerkontroll, etterfylles på alternative dager. (B) og (D) LNCaP prostatakreftceller (1 x 10
4 celler per brønn i 12-brønners plater) ble behandlet med 2,5 uM 5-aza-CDR eller bærerkontroll, etterfylles daglig. Etter 6 dager med behandling, kontroll-celler ble stanset og de gjenværende cellene enten fortsatte å motta 5-aza-CDR (10 pM-12d eller 2,5 uM-12d, henholdsvis) eller mottas friskt medium inneholdende bærer (10 pM-6d eller 2,5 pM -6d). (A) og (C) celler ble tellet på dag 6, 8 og 12 ved anvendelse av et hemocytometer, og antallet levedyktige celler ble bestemt ved trypan blå eksklusjon fargestoff. (B) og (D) antallet av døde celler er uttrykt som en prosentandel av det totale antall celler tellet.
GSTP1
promotor-DNA-metylering status og protein re-ekspresjon som markører av 5-aza-CDR effekt
for å undersøke hvordan de anti-proliferative effekter av 5-aza-CDR forholde seg til sin demethylating aktivitet, ble MSP utført for å vurdere DNA metylering status for
GSTP1
promoter (Figur 4A). Hypermethylated
GSTP1
promoter DNA var til stede i LNCaP celler behandlet med kjøretøy kontroll. I kontrast, unmethylated
GSTP1
promoter DNA ble påvist i LNCaP celler behandlet daglig med 0,05 mikrometer eller større 5-aza-CDR, men helt demetylert
GSTP1
promoter DNA ble ikke observert med selv de høyeste konsentrasjonen av 5-aza-CDR. Demetylering av
GSTP1
promoter av 5-aza-CDR ved doser store enn eller lik 0,05 pM falt sammen med muligheten av 5-aza-CDR i det vesentlige å inhibere celleformering på følgende konsentrasjoner (Figur 2A-B) .
DNA og proteiner ble hentet fra LNCaP celler behandlet med økende doser av 5-aza-CDR (0,005 til 2,5 mm). Celler ble behandlet daglig, og DNA og protein høstet etter 6 dager med behandling. (A) MSP ble utført på sulfitt-modifiserte DNA med primere rettet mot sulfitt-modifiserte metylert
GSTP1
promoter eller unmethylated
GSTP1
promoter. (B-C) den relative metylering status for GSTP1 promoter følgende 5-aza-CDR behandling ble videre undersøkt ved Cobra hjelp av to restriksjonsenzymer, BstUI og HhaI. MDA-MB-231 brystcancerceller ble benyttet som en kontroll for unmethylated
GSTP1
promoter. (D) Immunoblot ble utført for å analysere GSTP1 proteinekspresjon. Påvisning av HSP90 ble brukt som en lasting kontroll.
For ytterligere å undersøke den relative DNA metylering status for
GSTP1
promoter i 5-aza-CDR behandlet LNCaP celler, COBRA var utføres ved å bruke BstUI og HhaI restriksjonsenzymer (figur 4B-C). Den unmethylated
GSTP1
promoter stede i MDA-MB-231 brystkreftceller ble ikke fordøyd av BstUI eller HhaI (figur 4B). I samsvar med MSP resultater, metylert
GSTP1
promoteren ble påvist i kjøretøyet behandlede (kontroll) og 5-aza-CDR behandlede LNCaP-celler i doser på 0,005 til 0,5 uM. Betydelig
GSTP1
promotor-DNA-demetylering ble bare sett i respons til 0,5 uM 5-aza-CDR, som er den laveste 5-aza-CDR dose som er tilstrekkelig til å indusere fullstendig inhibering av LNCaP celleproliferasjon og celledød demonstrert i celleviabilitet analyser (figur 2A-B). Disse funnene antyder at effekten av 0,5 uM 5-aza-CDR er på grunn av sin evne til å indusere større DNA-demetylering av
GSTP1
sammenlignet med lavere doser.
Jo større demethylating effekt på 0,5 pM sammenlignet med 0,05 mikrometer 5-aza-CDR korresponderer med GSTP1 protein re-uttrykk observert ved 0,5 mikrometer 5-aza-CDR eller høyere (figur 4D). I samsvar med dette, de fem-aza-CDR doser som fører til re-uttrykk for GSTP1 protein også indusere betydelig celledød i LNCaP celler (figur 2B og 2F).
Zebularine hemmer spredning av prostata kreft celler, men har begrensede effekter på celledød
LNCaP-celler ble behandlet med Zebularine (0-1000 uM; høyeste dose som ble brukt i tidligere studier [30]), mens PC3-celler ble behandlet med Zebularine doser opp til 400 uM. Zebularine ble gitt på dag 0 og påfylt igjen midtveis i behandlingsperioden. Zebularine forårsaket en doseavhengig inhibering av proliferasjon i begge LNCaP og PC3 prostatakreftceller (figur 5A og 5C, s 0.0001), som tyder på at Zebularine har en lignende AR-uavhengig vekst inhiberende virkningsmekanisme på prostata kreftceller som 5-aza -CdR. En betydelig reduksjon i antallet levedyktige celler ble observert med 100 til 200 uM Zebularine, og fullstendig hemming av celleproliferasjon ble observert ved 400 uM eller større både i LNCaP og PC3-celler (Figur 5A og 5C, p 0,0001). Mens Zebularine unnlatt å indusere celledød til enhver dose i LNCaP celler (figur 5B), ble betydelig celledød indusert av 400 mikrometer Zebularine i PC3 celler (figur 5D, p = 0,0004).
(AB) LNCaP og (C-D) PC3 prostatakreftceller (1 x 10
4 celler per brønn i 12-brønners plater) ble behandlet med økende doser av Zebularine (0-400 pM, opp til 1000 uM for LNCaP-celler) påfylt på en gang dag 4 i en periode på 6 dager for PC3-celler, og 8 dager for LNCaP-celler. (A) og (C) ble cellene tellet med jevne mellomrom ved hjelp av et hemocytometer og cellelevedyktigheten ble bedømt ved Trypan blått fargestoff utelukkelse. (B) og (D) antallet av døde celler er uttrykt som en prosentandel av det totale antall celler tellet. Data ved hver tids-punkt representerer gjennomsnittet +/- SE av triplikate brønner. * Enveis ANOVA; p 0,0001 for (A) og (C); p = 0,0004 for (D) i forhold til kjøretøykontroll (kjt).
Zebularine har svakere demethylating handlinger på
GSTP1
arrangøren i forhold til 5-aza-CDR
for å undersøke demethylating aktivitet Zebularine, ble MSP utført for å undersøke DNA metylering status for
GSTP1
promoter i LNCaP celler (Figur 6A). Etter 8 dager med behandling, metylert
GSTP1
var til stede i bilen kontroll og alt Zebularine behandlet prøver (0-400 mm), mens demetylering av
GSTP1
promoter manglet doseavhengigheten (Figur 6A). Når den relative DNA metylering status for
GSTP1
promoter-regionen i disse Zebularine-behandlede LNCaP celler ble sammenlignet med COBRA hjelp BstUI og HhaI restriksjonsenzymdigestion, ingen unmethylated
GSTP1
er registrert (Figur 6B ). De svake og inkonsistente demethylating handlinger Zebularine på LNCaP celler ble også reflektert i mangel på GSTP1 protein nytt uttrykk etter 8 dagers behandling (figur 6C).
DNA og proteiner ble hentet fra LNCaP celler etter 8 dager av behandling med økende doser av Zebularine (0-400 uM). (A) DNA var sulfitt-modifiserte og MSP ble utført med primere rettet mot sulfitt-modifiserte metylert
GSTP1
eller unmethylated
GSTP1
. (B) Den relative DNA metylering status for
GSTP1
arrangøren følgende Zebularine behandling ble vurdert ved COBRA bruke to restriksjonsenzymer, BstUI eller HhaI. (C) Immunoblot ble utført for å analysere GSTP1 protein ekspresjon i LNCaP-celler etter 8 dagers behandling Zebularine. Proteiner ble ekstrahert fra LNCaP-celler ble behandlet med økende doser av Zebularine (0-400 uM). PC3 celler uttrykker endogen GSTP1 protein og ble brukt som positiv kontroll.
Diskusjoner
Mens DNMTi 5-aza-CDR er effektiv i behandling av hematologiske tilstander, kliniske studier i solid svulster og i prostata cancer har vist begrenset eller ingen effekt. Svikt i tidligere kliniske studier i solide tumorer har blitt tilskrevet upassende doseringer, som fører til toksisitet relaterte bivirkninger. Delvis er dette på grunn av en dårlig forståelse av de mekanistiske handlingene til 5-aza-CDR i solide tumorer. I denne studien viser vi at 5-aza-CDR, i en dose på 0,5 uM gitt daglig, fullstendig hemmet celleproliferasjon og celledød i prostatakreftceller, og er forbundet med demetylering av de
GSTP1
promoter og re-uttrykk for GSTP1 protein. Disse funnene antyder at en daglig dose lav-5-aza-CDR behandlingsregime kan være mer effektiv enn en mindre hyppig eller enkelt høy-doseringsregime for kontroll av prostatacancer-cellevekst. Vi har også vist at en daglig dose lav-5-aza-CDR behandlingsregime er mer effektiv enn en bruk av mer stabil DNMTi, Zebularine. Viktigst, gir vi bevis for at den økte styrken av 5-aza-CDR i forhold til Zebularine i prostatakreftceller er nært relatert til dets demethylating aktivitet og identifisert
GSTP1
som et potensielt nyttig biomarkør for å vurdere DNMTi effekt i prostata kreft.
Flere studier har vist at 5-aza-CDR reduserer celleproliferasjon og induserer re-uttrykket av spesifikke gener i ulike kreftformer (Tabell S1). Forskjellige krefttyper svare på 5-aza-CDR forskjellig, men et stort utvalg av 5-aza-CDR doser og behandlingsregimer er blitt anvendt i tidligere studier, og endepunktene og analyse var forskjellig i de forskjellige undersøkelser. Ni publiserte studier har undersøkt effekten av 5-aza-CDR på levedyktighet av prostatakreft-cellelinjer (tabell S1A) [10], [11], [31], [32], [33], [34], [ ,,,0],35], [36], [37]. Sammenligninger mellom disse studiene er vanskelig på grunn av grunner nevnt ovenfor. For eksempel, Walton et al [11] rapporterte ca. 30% inhibering av celleproliferasjon sammenlignet med vehikkel-kontroll i LNCaP prostatakreftceller etter behandling med 8,8 pM 5-aza-CDR, mens Pulukuri et al [10] rapporterte 70% inhibering av celleproliferasjon sammenlignet med vehikkel-kontroll i det samme cellelinje med en høy dose av 10 uM 5-aza-CDR behandling.
