Abstract
CD133 (prominin-1), en 5-transmembran-glykoprotein, er nylig blitt ansett å være en viktig markør som representerer delsettet populasjon av kreft stilk-lignende celler. Heri vi rapporterer isolering av CD133-positive celler (LC-CD133
+) og CD133-negative celler (LC-CD133
-) fra vevsprøver av ti pasienter med ikke-småcellet lungekreft (LC) og fem LC cellelinjer. LC-CD133
+ viste høyere Oct-4 uttrykk med evnen til å fornye seg selv, og kan representere et reservoar med proliferativ potensial for å generere lungekreftceller. Videre LC-CD133
+, i motsetning til LC-CD133
-, svært co-uttrykte flere multiresistent markør ABCG2 og viste betydelig motstand mot kjemoterapi (dvs. cisplatin, etoposid, doksorubicin, og paclitaxel) og strålebehandling. Behandlingen av oktober-4 siRNA med lentiviral vektor kan spesifikt blokkere evnen til LC-CD133
+ for å danne kuler og kan videre legge til rette for LC-CD133
+ til å differensiere i LC-CD133
-. I tillegg knock-down av oktober-4 uttrykk i LC-CD133
+ i betydelig grad kan hemme evnene til tumorinvasjon og kolonidannelse, og øke apoptotiske aktiviteter caspase 3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Til slutt,
in vitro Hotell og
in vivo
studiene videre bekrefte at behandlingseffekten av kjemoradioterapi for LC-CD133
+ kan forbedres ved behandling av oktober-4 siRNA. I konklusjonen, viste vi at oktober-4 uttrykk spiller en avgjørende rolle i å opprettholde selvfornyende, kreft stilk-aktig, og chemoradioresistant egenskapene til LC-CD133
+. Fremtidig forskning er garantert om oppregulert uttrykk for oktober-4 i LC-CD133
+ og ondartet lungekreft
Citation. Chen YC, Hsu HS, Chen YW, Tsai TH, hvordan CK, Wang CY, et al. (2008) oktober-4 Expression Vedlikeholdt Cancer Stem-lignende egenskaper i Lung Cancer-avledet CD133-positive celler. PLoS ONE 3 (7): e2637. doi: 10,1371 /journal.pone.0002637
Redaktør: Ming Du, Washington University, USA
mottatt: 17 mars 2008; Akseptert: 8. juni 2008, Publisert: 09.07.2008
Copyright: © 2008 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av forskningsmidler fra National Science Council (NSC-96-3111-B-075-001-My3, 95-2314-B-075-055-MY2, 96-2628-B-010-006-My3, 96 -2314-B-075-024), Taipei Veterans General Hospital (V96C1-151, V96E1-004, V96ER2-016, V96E2-010), Joint Prosjekter av UTVGH (VGHUST96-P1-07), Yen-Tjing-Ling Medical Foundation, Taipei City Hospital (96001-62-014, 96001-62-018, 96002-62-092), og National Yang Ming University (Kunnskapsdepartementet, Aim for Top Universitetet Plan), Taiwan.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall i industrialiserte land [1], [ ,,,0],2]. Strålebehandling og kjemoterapi spille viktige og avgjørende roller i klinisk kreftbehandling anti-lunge for å oppnå forlenget pasientoverlevelse [3], [4]. Imidlertid er en høy strykprosent og lave median overlevelse hos pasienter som gjennomgår kjemoradioterapi med tilbakevendende, umedgjørlig lungekreft [5]. For å forbedre pasientens overlevelse, undersøkelse for å belyse mekanismen av tumorigenesis av lungekreft er nødvendig [5]. Nyere data har vist at svulster inneholder en liten subpopulasjon av celler, dvs. kreft stilk-lignende celler (cscs) eller kreft-initiering celler (CIC), som oppviser et selvfornyende kapasitet og er ansvarlig for tumor vedlikehold og metastase [6] . Stamceller er blitt isolert ved deres evne til å effluks Hoechst 33342 fargestoff, og er referert til som «side populasjonen (SP)» [7]. Ho og kolleger isolert og karakterisert SP-celler fra seks humane lungecancercellelinjer, og viste at en forhøyet ekspresjon av ABCG2 så vel som andre ATP-bindende kassett transportører var positivt korrelert med resistens mot flere kjemoterapeutiske medikamenter [8]. I tillegg Gutova og kolleger har renset uPAR-positive cscs fra tre lunge kreft cellelinjer. Disse uPAR-positive celler co-uttrykkes med CD44 og MDR1, og hadde muligheten til å fremme fremskreden kreft og chemoresistance [9].
CD133 (prominin-1), en 5-trans glykoprotein, ble først anerkjent i CD34
+ progenitor populasjoner fra voksen blod, benmarg, og føtale leverceller [10]. Nylig CD133 har vært ansett som en viktig markør for å representere den delen befolkningen i cscs i leukemi, hjernesvulster, retinoblastom, nyresvulster, bukspyttkjertelsvulster, tykktarmskreft, prostatakreft karsinom, og leverkreft [11] – [19]. Basert på funnene immunhistokjemiske, Hilbe og kolleger antydet at CD133-positive (CD133
+) progenitor-celler spiller en rolle i utviklingen av tumorvaskulatur i pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [20]. Flere nylig, en godt designet studie av Eramo og kolleger viste at lungekreft inneholder en befolkning på CD133
+ cscs i stand til å fornye seg selv og generere et ubegrenset avkom av ikke-tumorigene celler. Disse CD133
+ celler er også resistente mot konvensjonell kjemoterapi [21]. Men genet reguleringsmekanismer i å opprettholde selvfornyelse og multiresistent eiendommer i antatte kreft stilk-lignende celler av lungesvulster er fortsatt uklart.
Oct-4, et medlem av familien av POU-domene transkripsjonsfaktorer, uttrykkes i pluripotente embryonale stamceller (ES) og kjønnsceller [22] – [23]. Oktober-4 mRNA er normalt finnes i totipotente og pluripotente stamceller pregastrulation embryoer [24]. Slå ut
Oct-4
-genet i mus forårsaker tidlig dødelighet på grunn av mangel på ICM formasjon, noe som indikerer at Oct-4 har en kritisk funksjon for selvfornyelse av ES-celler [25]. Oktober-4 aktiverer transkripsjon via octamer motiver, og Oct-fire bindingsseter er funnet i ulike gener, inkludert
fgf fire plakater (fibroblast vekstfaktor 4) og
PDGF
α
r product: (blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor α) [26], [27]. Dette tyder på at oktober-4 fungerer som en hovedbryter under differensiering ved å regulere pluripotente potensialer av stamceller, og oktober-4 spiller en sentral rolle i pattedyr utvikling [24], [25].
I denne studien, CD133-positive celler (LC-CD133
+) og CD133-negative celler (LC-CD133
-) ble isolert fra vevsprøver av lungekreft (LC) pasienter og LC cellelinjer. Disse LC-CD133
+ celler besatt både egenskapene til stilk-lignende celler og ondartede svulster. Våre data videre vist at oktober-4 uttrykk i LC-CD133
+ er involvert i tumor malignitet av lungekrefttilfellene og utstillinger ildfaste egenskaper for kjemoradioterapi i kreft stilk-lignende celler. Disse resultatene antydet at uttrykket av oktober-4 spiller en avgjørende rolle i å opprettholde kreft stilk-lignende og chemoradioresistant eiendommer i lungekreft-avledet CD133
+ celler.
Materialer og metoder
isolering av CD133
+ Cell Subset
Denne forskningen har fulgt prinsippene i Helsinkideklarasjonen og alle prøvene ble oppnådd etter pasienter gitt informert samtykke. Studien ble godkjent av Institutional etikkomiteen /Institutional Review Board of Taipei Veterans General Hospital. De dissosierte celler fra prøvene av ikke-småcellet lungekreft pasienter (tabell 1) og lungekreft (LC) cellelinjer ble merket med 1 ml CD133 /l micromagnetic perler per 1 million celler ved hjelp av CD133 celle isolasjonskit (Miltenyi Biotech , Auburn, CA). CD133
+ celler ble dyrket i et medium bestående av serum-fritt DMEM /F12 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), N2-supplement (R . D Systems) [28]
celleviabilitet Bestemmes av kolorimetrisk analyse
Den isolerte CD133
+ og CD133
– celler ble dyrket i et 96-brønn cellekultur klynge (Corning Costar, Acton, MA) ved en tetthet på 3 x 10
3 celler /brønn med 100 ul kulturmedium. På bestemte tidspunkter i løpet av dyrking ble mediet kassert og erstattet med et likt volum (100 ul) av friskt medium inneholdende 0,2 mg /ml av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl ) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS, Promega, Madison, WI) og 0,038 mg /ml fenazin metosulfat (PMS, Promega) og inkubert i ytterligere 1,5 timer i 37 ° C, 5% CO
2. Celleviabilitet proporsjonal med optisk densitet (OD) ble målt ved kolorimetrisk analyse i form av mitokondrier aktivitet for å omdanne tetrazoliumsalt til et farget formazanprodukt oppløselig i mediet. OD-verdiene ble målt på bølgelengde på 490 nm med en 1420 multilabel teller VICTOR fra Wallace (PerkinElmer Wallac, Turku, Finland).
Sanntids Reverse Transcription-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR)
for sanntids RT-PCR-analyse, er den totale RNA fra celler som ble ekstrahert ved hjelp av RNA
lett kit (Qiagen, Valencia, CA). I korthet, den totale RNA (1 pg) av hver prøve ble reverstranskribert i 20 pl ved anvendelse av 0,5 ug av oligo dT og 200 enheter Superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). Amplifikasjonen ble utført i et totalvolum på 20 pl inneholdende 0,5 uM av hver primer, 4 mM MgCl
2, 2 ul LightCycler Faststart DNA Master SYBR grønn I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) og 2 ul 1: 10 utvannet cDNA. Kvantifiseringen av de ukjente prøver ble utført ved LightCycler Relativ kvantifisering Software, versjon 3.3 (Roche Diagnostics). I hvert forsøk ble det GAPDH husholdningsgenet amplifisert som en referansestandard. GAPDH primere ble utformet: GAPDH (f): GCCAAAAGGGTCATCATC (nt 448-465, GenBank tiltredelse no NM_002046.), GAPDH (r): ATGACCTTGCCCACA GCCTT (nt 745-765), Oct-4a (f): CGCAAGCCCTCATTTCAC (nt 5- 22, GenBank tiltredelse no NM_002701), Oct-4a (r):. CATCACCTCCACCACCTG (nt 98-115, GenBank tiltredelse no NM_002701).. PCR-reaksjoner ble fremstilt i duplikat og oppvarmet til 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 10 sekunder, annealing ved 55 ° C i 5 sekunder, og forlengelse ved 72 ° C i 20 sekunder. Alle PCR-reaksjoner ble utført i duplikat. Standardkurver (sykkelterskelverdier versus mal konsentrasjon) ble utarbeidet for hvert mål gen og for den endogene referanse (GAPDH) i hver prøve.
immunfluorescens farging for Stem Cell Markers
En avidin-biotin komplekset metode ble anvendt for immunofluorescens farging i den differensierte sfæroide og neuronal-lignende celle. I korte trekk ble celler sådd ut på poly-L-ornitin-belagte dekkglass og fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 til 20 minutter ved romtemperatur, og deretter ble vasket to ganger (10 minutter hver) med 1 x PBS. Celler ble permeabilisert med 0,1% Triton X-100 /PBS i 10 minutter ved romtemperatur, og deretter to ganger (10 minutter hver) med 1 x PBS. Cellene ble deretter blokkert med blokkeringsløsning i 30 minutter, og ble inkubert med primære antistoffer (okt-4, Chemicon, Temecula, CA) i 1 time ved romtemperatur. Vi deretter vasket cellene tre ganger (10 minutter hver) med 1 x PBS. Immunoreaktive signaler ble påvist med en blanding av biotinylert kanin-antimuse-IgG og Fluorsave (Calbiochem, San Diego, CA). Celler ble ytterligere undersøkt med fluorescein-isotiocyanat (FITC) -tagged sekundære antistoffer. Fluorescens bilder ble visualisert med et fluorescens mikroskop. Å kvantitativt analysere fluorescens-intensitet, vi registrert bilde med en invertert fluorescens mikroskop utstyrt med et CCD-kamera. Prosentandelen av signal fluorescens per fotograf felt ble analysert ved bildebehandling (Image Pro-Plus, MediaCybernetics, Inc., Silver Spring, MD).
FACS Analyse
For celleoverflaten markør identifikasjon en enkelt celle suspensjon av sixth- til åttende-passasje celler fra trypsinert kuler ble farget med anti-CD133, CD117 (c-Kit), eller ABCG2 og videregående fluorescein (FITC) -eller fysoerytrin (PE) -koblet antistoffer (Dako, Carpinteria). Cellene ble fiksert med 2% paraformaldehyde og ble analysert med en BD FACSCalibur apparat (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ).
strålebehandling for celleviabilitet analyse
gammastråling ( ioniserende stråling, IR) ble levert av en Theratronic kobolt enhet T-1000 (Theratronic International, Inc., Ottawa, Canada) ved en dose på 1.1Gy /min (SSD = 57.5cm). For å evaluere celleformeringshastigheten vi sås cellene i 24-brønners plater ved en tetthet på 2 x 10
4 celler /brønn. Celler ble sådd ut 24 timer etter IR- og da de ble analysert ved metyletyl tiazol tetrazolium-måling (MTT måle, Sigma-Aldrich, St. Louis, MN). Mengden av MTT formazon produkt ble bestemt ved anvendelse av en mikroplateavleser og absorbansen ble målt ved 560 nm (SpectraMax 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
kjemoterapeutiske midler
cisplatin, etoposid (VP16), og paclitaxel ble oppnådd fra Sigma-Aldrich og ble oppløst i DMSO (Sigma-Aldrich) ved 100 mM stamløsning.
in vitro Cell
Invasion Analyse og Soft Agar Colony assay
24-brønns plate Transwell system med en 8-um porestørrelse polykarbonat filtermembran (Corning Costar, Corning, NY) ble anvendt. Filtermembranen ble belagt med Matrigel (BD Biosciences, San Diego) fortynnet med serumfritt medium og inkubert over natten ved 37 ° C. Cellesuspensjonene ble podet til det øvre rom av Transwell kammeret ved celletetthet på 1 x 10
5 i 100 ul serumfritt medium. Etter 24 timer ble mediet fjernet og filteret membranen ble fiksert med 4% formalin i 1 time. Den motsatte overflate av filtermembranen som vender mot det nedre kammer ble farget med Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) i 3 minutter, og de migrerte celler ble så visualisert under et invertert mikroskop. Protokollen av myk agar-kolonianalyse er beskrevet som følger. Hver brønn (35 mm) av en seks-brønners kulturskål ble belagt med 2 ml bunnagar blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,6% (w /v) agar). Etter at bunnlaget størknet, 2 ml toppagar-medium blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,3% (w /v) agar) inneholdende 2 x 10
4 celler ble tilsatt, og retter var inkubert ved 37 ° C i 4 uker. Platene ble farget med 0,5 ml 0,005% krystallfiolett i 1 time og deretter en dissekere mikroskop ble brukt til å telle antall kolonier [29].
Lentiviral-mediert RNAi
pLVRNAi vektor og pCDH-MCS1-EF1-copGFP vektor ble kjøpt fra Biosettia Inc. (Biosettia, San Diego, California). Fremgangsmåten for kloning av dobbeltkjedet shRNA-sekvens er beskrevet i produsentens protokoll. SiRNA oligonukleotid 5′-CCGGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCGAGTACAGTGC AGTGAAGTGAGGGTTTTT-3 «rettet mot menneskelig oktober-4 (NM_002701, nt 1035-1055) ble syntetisert og klonet inn pLVRNAi å generere en lentiviral uttrykk vektor. Den Oct-4-cDNA ble amplifisert og renset ved hjelp av RT-PCR og klonet inn i en pCDH-MCS1-EF1-copGFP vektor. Lentiviral produksjonen ble utført ved transfeksjon av 293T celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (LF2000, Invitrogen). Supernatanter ble samlet 48 timer etter transfeksjon, og deretter ble filtrert; de virale titere ble deretter bestemt ved FACS ved 48 timer etter transduksjon. Subkonfluente celler ble infisert med lentivirus ved en multiplisitet av infeksjon av 5 i nærvær av 8 lg /ml polybrene (Sigma-Aldrich).
in vivo
Analyse av tumorvekst og metastase
Alle prosedyrer som involverer dyr var i samsvar med de institusjonelle dyrevelferd retningslinjer Taipei Veterans General Hospital. 1000, 3000, og 10
4-celler ble injisert inn i halevenen til SCID-mus og /eller nakne mus (BALB /c-stamme) som hver alderen 8 uker. In vivo GFP avbildning ble visualisert og målt ved en opplysende enhet (LT-9500 Illumatool TLS utstyrt med eksitasjon opplysende kilde [470 nm] og filterplaten [515 nm]). Den tumorstørrelse ble målt med målepunkter, og tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen (lengde x bredde
2) /2. Den integrert optisk tetthet av grønn fluorescens intensitet ble fanget og deretter analysert ved Image Pro-plus programvare [29].
Statistical Analysis
Statistiske Package for samfunnsvitenskap (versjon 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) ble anvendt for statistisk analyse. Den uavhengige Student
t
-test eller ANOVA ble brukt til å sammenligne kontinuerlige variabler mellom grupper, mens χ
2 test ble benyttet for sammenligning av dikotome variabler. Kaplan-Meier estimatet ble brukt for overlevelsesanalyse, og log-rank test ble brukt til å sammenligne den kumulative overlevelse i de forskjellige pasientgrupper. Nivået av statistisk signifikans ble satt til 0,05 for alle tester.
Resultater
Isolering og karakterisering av Lung Cancer-avledet CD133-positive celler
Bruk av magnetiske kuler metoden, vi isolerte CD133
+ celler (fig. 1A) fra vevsprøver fra ti ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter (tabell 1) og fem lungekreft (LC) cellelinjer (tabell S1). Den høye prosentandel (97%) av CD133
+ (LC-CD133
+) delmengde ble isolert i LC vev og foreldre LC-cellelinje (Fig. 1A). Det har blitt rapportert at kreft stilk-liknende celler kan dyrkes i suspensjon for å generere flytende sfæroide lignende legemer (SB) under serumfritt medium med bFGF EGF [30]. Vi fant at LC-CD133
+ isolert fra disse ti pasienter (tabell 1) og fem LC cellelinjer (tabell S1) kan dannes SB i DF-12 serumfritt medium med bFGF og EGF (figur 1B;. No. 1 [PLC] og No.2 [LLC]). (Fig. 1D) Videre er evnen til å danne SB (Fig. 1C) og formeringshastigheten i LC-CD133
+ var betydelig høyere enn den i LC-CD133
– (p 0,05). I tillegg til å bestemme
in vivo
tumorigent aktivitet av LC-CD133
+ og LC-CD133
-, injisert vi respektive mengder 1000, 3000, og 10
4 celler inn hale årer av SCID-mus. Resultatene viste at 10
4 LC-CD133
– induserte ikke tumordannelsen men 3000 LC-CD133
+ fra lungekreft vev av ti pasienter og fem LC cellelinjer i xenotransplanted mus kan alle generere synlige tumorer 4 uker etter injeksjon (tabell 1 og tabell S1).
(A) ved hjelp av en magnetisk vulst metode, vi sortert CD133
+ -celler fra vevsprøver fra pasienter med lungecancer (LC), og kjennetegnes dem ved FACS analyse. (B) LC-CD133
+ sortert fra to pasienter med No.1 (PLC-CD133
+) og No.2 (LLC-CD133
+) ble dyrket i bFGF og EGF med DMEM serum- fritt medium. (C) Evaluering av formasjons evnene til sfæroide lignende legemer (SB) fra LC-CD133
+ og LC-CD133
– under serumfritt medium med bFGF EGF. (D) De vekstkurver av LC-CD133
+ og LC-CD133
– ble målt ved hemocytometer. Bar: 100 mikrometer. Data som vises her er middelverdien ± SD av tre forsøk.
Økt ABCG2 Expression og Invasive Evne til LC-CD133
+
In Vitro
Å karakterisere vår isolert LC-CD133
+, FACS-analyse ble brukt for å påvise ekspresjonsprofilen av celler overflatemarkører. Som vist i figur 2A, de fleste av isolerte LC-CD133
+ ble farget med høyere uttrykk nivåer av CD133, CD117 (c-Kit), og ABCG2 sammenlignet med LC-CD133
-. Dette resultat viste at isolerte LC-CD133
+ var nesten ABCG2-positive celler (Fig. 2B). For ytterligere å vurdere forbedring av tumorigenitet av LC-CD133
+, vi undersøkte
in vitro
Matrigel-kombinert Transwell invasjon og myke agar kolonidannelse analyser. Sammenlignet med LC-CD133
-, LC-CD133
+ avledet fra NSCLC pasienter No.1 (PLC) og nr 2 (LLC) viste høyere invasjon aktivitet gjennom Matrigel Transwell invasjonen assay (
p
0,001 fig. 2C). Tilsvarende foci dannelsen evne til LC-CD133
+ fra PLC (No.1) og LLC (No.2) ble forbedret sammenlignet med LC-CD133
– fra disse to pasienter (
p
0,001, fig. 2D)
(A) og (B) Et uttrykk nivåer av CD133, CD117 (c-Kit), og ABCG2 ble analysert ved hjelp av FACS-analyse i LC-CD133
+ og LC-CD133
-. Egenskapene (C) migrasjon /invasjon og (D) svulsten foci (soft agar koloni) formasjonen i LC-CD133
+ ble betydelig økt sammenlignet med LC-CD133
– (*
p
0,001). Data som vises her er middelverdien ± SD av tre forsøk.
Økt
In Vivo
Tumor-restaurering og proliferativ Evne i LC-CD133
+
Vi evaluerte videre
in vivo
tumor-restaurering og proliferativ evne LC-CD133
+ og LC-CD133
– ved xenotransplanted tumorigenicity analyse (fig. 3A). Fire uker etter 10
4-celler ble injisert inn i halevenen av SCID-mus, en betydelig økning i flere knuter på tumordannelse på lungeoverflaten ble notert i LC-CD133
+ -. Injiserte gruppen (fig 3A4 3A7), men ikke i den LC-CD133
– gruppe (figur 3A1).. ble observert diffuse infiltrasjoner av LC-CD133
+ fra lungeparenkym til alveolar hulrom (fig. 3A5, 3A6 og 3A8). Den histologisk undersøkelse viste at fremtredende neovascularization og trombedannelse ble påvist i lunge parenchyma av LC-CD133
+ – injisert SCID mus (Fig 3A9.). I motsetning til dette ble ingen signifikant tumor foci eller neovaskulær formasjon funnet i lungene til LC-CD133
– injisert SCID-mus (figurene 3A2 piler: normal cellekonstruksjon av lunge. A4-6: LC-CD133
+; piler: svulstdannelse. A7-9: LC-CD133
+; piler: neovascularity og trombose. Bar: 200 mikrometer. (B)
in vivo
tumor-restaurering og proliferativ evne 10
4 LC-CD133
+, 10
5 LC-CD133
– og 5 × 10
5 totalt antall tumor celler fra pasient nr 1, 2, 4 og 7 ble undersøkt med xenotransplanted tumorgenisitet analyse. (C) Et svulst repopulation evne til LC-CD133
+ ble studert hos transplanterte SCID-mus. Uttrykket nivåer av CD133 ble bestemt ved FACS analyse fra primær LC-CD133
+, andre svulst, og tredje svulst. Data som vises her er middelverdien ± SD av tre eksperimenter
Forbedret kjemo- og Radiation-motstand i LC-CD133
+
Vi har evaluert for multi (cellegift). – resistente evner av LC-CD133
+ og LC-CD133
-. Vi testet videre fire vanlige kjemoterapeutika, inkludert cisplatin, VP16 (etoposid), doxorubicin, paclitaxel. Sammenlignet med LC-CD133
-, LC-CD133
+ er betydelig motstandsdyktig mot de fire testede kjemoterapeutika (
p
0,01; fig 4A.). For ytterligere å bestemme stråling effekt på forekomsten av tumorvekst, brukte vi en ioniserende stråling (IR) dose 0-10 Gy å behandle både LC-CD133
+ og LC-CD133
-. Som vist på fig. 3B, etter IR behandling, overlevelse og antall LC-CD133
+ var betydelig høyere enn de av LC-CD133
– (
p
0,01). Vi har videre funnet at LC-CD133
+ -celler har en høyere grad av radioresistance (
p
0,01, Fig. 4B). Videre undersøkte vi den kombinerte behandlingseffekten av radiochemotherapy i LC-CD133
+. Eksperimenter ble utført med cisplatin (10 uM) alene, VP-16 (10 pM) alene, eller kombinert cisplatin og VP-16 på IR (2 Gy) -behandlet LC-CD133
+. Som vist i figur 3C, er dataene viste at celleoverlevelsesraten i IR-behandlede LC-CD133
+ ikke ble signifikant redusert ved IR-behandling i kombinasjon med cisplatin, med eller uten VP-16 (
p
0,05). Tvert imot, celleoverlevelse signifikant redusert etter kjemoterapi med cisplatin i kombinasjon med VP-16 i IR-behandlede LC-CD133
– (
p
0,01; figur 4C.). Disse resultatene tyder på at LC-CD133
+ kan spille en viktig rolle i svulsten evne til å motstå stråling og kjemoterapi.
(A) Begge 10000 LC-CD133
+ og LC-CD133
– ble sådd i en 96-brønners plate og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin, VP-16, doksorubicin, og paklitaxel i 24 timer i 10% FBS /DMEM /F-12 medium. Overlevelsesgraden ble bestemt ved MTT-assay. (B) For å bestemme strålings effekt på tumorvekstraten, en ioniserende stråling (IR) dose 0-10 Gy ble brukt til å behandle LC-CD133
+ og LC-CD133
-. *
p
0,01: LC-CD133
+ lignet med LC-CD133
-. (C) Den kombinerte behandlingseffekten av radiochemotherapy i LC-CD133
+ og LC-CD133
– ble evaluert videre. De fire protokoller-stråling (2 Gy) bare, stråling med cisplatin (10 mm), stråling med VP-16 (10 mm), og stråling med paclitaxel (10 nM)-var brukt. *
p
0,01. Data som vises her er middelverdien ± SD av tre forsøk.
Rollen til oktober-4 Expression i LC-CD133
+
Microarray Resultatene antydet at uttrykket nivået av oktober -4 selvfornyelse og stemness genet i LC-CD133
+ var signifikant oppregulert enn i LC-CD133
-. For å validere dette funnet, undersøkte vi uttrykk for oktober-4 både transcriptionally og translatorisk. Mengden av oktober-4 transkripsjon og protein av isolerte LC-CD133
+ (Pasienter No.1 [PLC] og No.2 [LLC]) signifikant økt sammenlignet med de av LC-CD133
– ved real -time RT-PCR og Western blotting-analyse (fig. 5A og 5B). For å undersøke om oktober-4 uttrykk spiller en rolle i å opprettholde selvfornyelse eller kreft stamceller-lignende egenskaper i LC-CD133
+, brukte vi siRNA metoden med lentiviral vektor for knockdown av oktober-4 uttrykk i LC-CD133
+. Vi fant det viktig at behandlingen av oktober-4 siRNA i LC-CD133
+ i betydelig grad kan påvirke mulighetene til sfæroide lignende organer (SB) dannelse (
p
0,001 Fig. 5C ). Etter 7 dager i oktober-4 siRNA behandling, kan SB av LC-CD133
+ ikke opprettholde flytende kuler, men differensiert i vedlagte epitelceller lignende celler (Fig. 5C). I kontrast, gjorde behandlingen av rykke kontroll siRNA ikke påvirke SB formasjonen evne i LC-CD133
+ (Fig. 5C). SB av LC-CD133
+ endogent uttrykt sterke positive signaler for oktober-4 og CD133 (Fig. 5D). Videre er de immunofluorescerende resultater viste at både CD133 og Oct-4 uttrykk i LC-CD133
+ ble signifikant blokkert etter 7 dagers Oct-4 siRNA behandling (fig. 5D). Autorisert servicesenter analysen bekreftet at mengden av CD133 ble dramatisk redusert i okt-4 siRNA-behandlede LC-CD133
+ og prosenter av LC-CD133
– ble betydelig økt i LC-CD133
+ etter 7 dager av oktober-4 siRNA behandling (
p
0,001 fig. 5E). Disse data antydet at oktober-4 kan opprettholde egenskapene til primitive stamceller og hemme tendensen for differensiering i LC-CD133
+.
(A) Mengden av okt-4 transkripsjoner av isolerte LC- CD133
+ signifikant økt sammenlignet med de av LC-CD133
– ved real-time RT-PCR-analyser. (B) Western Blott data viste at proteinnivåer Oct-4 i LC-CD133
+ isolert fra PLC og LLC ble også signifikant oppregulert sammenlignet med de for LC-CD133
-. (C) Proteinet uttrykk for oktober-4 i LC-CD133
+ ble effektivt blokkert av oktober-4 siRNA. Behandling av oktober-4 siRNA i LC-CD133
+ kan hindre mulighetene til SB formasjon og videre legge til rette for SB til å differensiere i vedlagte epitel-lignende celler. Bar: 100 mikrometer. (D) Ved å bruke immunofluorescerende farging viste vi at proteinet uttrykket nivåer av både Okt-4 og CD133 i LC-CD133
+ ble signifikant redusert etter Oct-4 siRNA behandling. Bar: 30 mikrometer. (E) Andelen av LC-CD133
– ble betydelig økt i oktober-4 siRNA-behandlede LC-CD133
+ ved FACS analyse. *
p
0,001. Data som vises her er middelverdien ± SD av tre forsøk.
Forbedret Chemoradiotherapeutic Følsomhet og apoptose aktivitet i LC-CD133
+ Behandlet av oktober-4 siRNA
For å videre studier rollen til oktober-4 i tumor malignitet av LC-CD133
+
in vitro
ble migrasjon /invasiv og myk agar koloni analysen brukes. Resultatene viste at evnene til
in vitro
vandrende invasjon og kolonidannelse i LC-CD133
+ behandlet av oktober-4 siRNA ble betydelig redusert sammenlignet med ikke-behandlede LC-CD133
+ eller LC-CD133
+ behandlet med scramble-siRNA (kontroll;
p
0,001 fig. 6A). Videre behandlingseffekten av kjemoradioterapi for LC-CD133
+ gruppe kan bli betydelig forbedret ved behandling av oktober-4 siRNA sammenlignet med ikke-behandlede LC-CD133
+ eller LC-CD133
+ behandlet av scramble-siRNA (fig 6B;.
p
0,001). I tillegg fant vi at apoptotiske aktiviteter annexin V (Fig 6C.) Og caspase 3 (Fig 6D;. Øvre del) ble raskt og effektivt indusert i LC-CD133
+ behandlet av oktober-4 siRNA etter 72 timer . I samsvar med resultatet av celle overlevelse og behandlingseffekter i oktober-4 siRNA-behandlede LC-CD133
+ (Fig. 6B), Western blot data videre vist at mengder aktivert (spaltet) form av PARP var konsekvent forhøyet i LC-CD133
+ behandlet ved Oct-4 siRNA med IR alene eller i kombinasjon med kjemoterapi (figur 6D;. nedre del). Dermed knockdown av oktober-4 uttrykk i LC-CD133
+ effektivt kan forbedre chemoradiosensitivities og apoptotiske aktiviteter som svar på IR og kjemoterapi, noe som tyder på at oktober-4 kan være en viktig faktor gjør at LC-CD133
+ for å motstå
