Abstract
I løpet av de siste to tiårene, celleoverflate proteaser som tilhører den type II transmembrane serin protease (TTSP) familie har dukket opp som viktig enzymer i pattedyr degradome, som spiller viktige roller i epitelial biologi, regulering av metabolsk homeostase, og kreft. Menneskelig airway trypsin-lignende protease 5 (HATL5) er en av de få familiemedlemmer som gjenstår uncharacterized. Her viser vi at HATL5 er en katalytisk aktiv serinprotease som er hemmet av to Kunitz typen serinproteaseinhibitorer, hepatocytt-vekstfaktor aktivator inhibitor (HAI) -1 og 2, så vel som av serpinA1. Full-lengde HATL5 er lokalisert på celleoverflaten av dyrkede pattedyrceller som vist ved konfokal mikroskopi. HATL5 viser en forholdsvis begrensede vev uttrykk profil, med både transkripsjon og protein som er tilstede i cervix, øsofagus, og munnhulen. Immunhistokjemisk analyse avslørte et uttrykk mønster hvor HATL5 er lokalisert på celleoverflaten av differensierte epitelceller i den lagdelte skjellepitel av alle tre av disse vev. Interessant er HATL5 betydelig redusert i livmorhalsen, esophageal, og hode og nakke Kreftsvulster i forhold til normalt vev. Analyse av livmorhals og esophageal kreft vev arrays viste at squamous epitelceller mister uttrykk for HATL5 protein ved malign transformasjon
Citation. Miller GS, Zoratti GL, Murray AS, Bergum C, Tanabe LM, List K ( 2014) HATL5: En celle overflaten serin protease forskjellig uttrykt i epiteliale cancere. PLoS ONE 9 (2): e87675. doi: 10,1371 /journal.pone.0087675
Redaktør: Claudia Daniela andl, Vanderbilt University, USA
mottatt: 18 oktober 2013; Godkjent: 28 desember 2013; Publisert: 3. februar 2014
Copyright: © 2014 Miller et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av oppstartsmidler fra Wayne State School of Medicine og Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den type II transmembrane serinproteaser er delt inn i fire fylogenetisk forskjellige underfamilier: luftveiene hos mennesker trypsin-lignende (HAT) /forskjellig uttrykt i plateepitelkarsinom genet (DESC) underfamilien, hepsin /trans protease serin (hepsin /TMPRSS) underfamilie, matriptase underfamilien, og Corin familien. HATL5 tilhører HAT /DESC familien sammen med HAT, DESC1, TMPRSS11A, og HAT-lignende 4 [1] -. HATL5 (HATL-5, HAT-lignende 5) er kodet av TMPRSS11b genet ligger innenfor et enkelt gen klynge som omfatter alle HAT /DESC gener i både mus og mennesker [4]. Alle medlemmer av HAT /DESC underfamilie består av en stamme region med et enkelt kråkebolle sperm protein, enteropeptidase, agrin (SEA) domene, og en C-terminal serin protease domene. Det er en omfattende mengde litteratur som dokumenterer viktige roller for medlemmer av hepsin /TMPRSS, matriptase og Corin underfamilier i fysiologiske og patologiske prosesser. Kritiske roller for disse TTSPs har blitt beskrevet i ulike områder og omfatter epithelial utvikling og homeostase, jern metabolisme, hørsel, fordøyelse, blodtrykket bestemmelser, samt viral infeksjon, betennelse, og onkogenese [3] [5], [6]. Relativt få studier som karakteriserer de biokjemiske egenskaper ved HAT /DESC familien og /eller utforske deres fysiologiske funksjoner har blitt publisert. HAT har blitt rapportert å ha fibrinogenolyttiske aktivitet, for å modulere urokinase-reseptoren, og å aktivere protease aktivert reseptor (PAR) 2 [7] [8], [9] [10], [11]. I tillegg kan HAT uncoat reovirus virioner å fremme infeksjon i cellekultur og spalter i overflaten glykoprotein, hemagglutinin (HA) av influensavirus [12] [13], [14]. Nylig ble en studie ansette genetisk ablasjon av TMPRSS11A og HAT i mus viste at de to proteaser er unnværlig for utvikling, generell helse, og langsiktig overlevelse i fravær av eksterne utfordringer eller flere genetiske underskudd [15].
i denne studien utførte vi en biokjemisk karakterisering og uttrykk analyse av HATL5. Full-lengde cDNA HATL5 dirigerer ekspresjon av et 60 kDa N-glykosylert protein som lokaliserer seg til celleoverflaten av pattedyrceller. Den rensede aktiverte HATL5 serin protease domene hydrolyserer syntetiske peptidsubstrater, og inhiberes av medlemmer av to forskjellige serinproteaseinhibitor familier: den Kunitz-type; HAI-en, HAI-2 og aprotinin, og Serpin familiemedlem; serpinA1. HATL5 protein lokalisering er bemerkelsesverdig lik i de tre ulike vev analysert: cervix, spiserør og munnslimhinnen. Dermed er HATL5 hovedsakelig detektert på overflaten av epitelceller i disse stratifisert skjellepitel. Under carcinogenesen, er uttrykk for celleoverflaten protease i stor grad redusert, og i mange tilfeller umulig å oppdage i plateepitel karsinom celler.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
bruk av menneskelig vev parafin arrays ble godkjent i henhold til institusjonelle retningslinjer ved Wayne State University Institutional Review Board Administration (# 2013-43).
Kloning og ekspresjon av full-lengde menneskelig HATL5
humant esophageal RNA ble oppnådd fra Biochain (Newark, CA). Først cDNA syntese ble utført med Oligo (dT) primere bruker en RETROscript kit i henhold til produsentens instruksjoner (Ambion, Life Technologies, Grand Island, New York). Gene spesifikke primere ble utformet for full-lengde human HATL5 bruker avsatt sekvens for
Homo sapiens
trans protease, serin 11B, mRNA, GenBank # BC126195.1. Primerne 5′- GCCACCATGTAC-AGGCACGGCATATC-3 «og 5′- GAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3» ble anvendt til å amplifisere cDNA ved anvendelse av en Hi-Fi Platinum®Taq polymerase (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, New York) som deretter ble innsatt i pcDNA 3.1 /V5-His TOPO® TA (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) i rammen med en C-terminal HIS-tag og V-5 epitop. Konstruksjonene ble verifisert ved sekvensering (ABI Prism 3730 DNA Analyzer, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). Transfeksjon av HEK293 og COS-7 celler (ATCC, Manassas, Virginia) ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, New York). Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle media (Gibco, Life Technologies, Grand Island, New York) supplert med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). Transfeksjon ble utført med 4,0 mikrogram full lengde HATL5 inneholder plasmid DNA. Celler ble lysert ved bruk av RIPA-buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris /HCl, pH 7,4, 0,1% SDS, 1% NP-40, og protease-inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og ble klarert ved sentrifugering ved 12 000 × g ved 4C °. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med en Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA). Proteinprøver ble separert ved SDS-PAGE ved anvendelse av 4-12% NuPAGE Bis-Tris-geler (Life Technologies, Grand Island, New York) under reduserende betingelser og analysert ved western blotting ved anvendelse av en primær V-5 mus monoklonalt antistoff (Invitrogen, Life Technologies, grand Island, New York) og en geit anti-mus sekundær alkalisk fosfatase-konjugert antistoff (Millipore, Billerica, MA).
Kloning og Expression of human HATL5 serin protease Domain Pro-skjema
human HATL5 serin protease (SP) domene ble klonet inn i plasmidet pSecTag2a (Life Technologies, Grand Island, NY) for ekspresjon og analyse i pattedyrcellekultur. HATL5 serin protease domene-sekvens fra det humane full-lengde HATL5-V5-His-plasmidet ble PCR-amplifisert ved å bruke de følgende primere: 5′-CCAAGGATCCATGTTGTGGGAGACAAGTAGCCAAC-3 «og 5′-CCAAGCGGCCGCGAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3». Det resulterende PCR-fragment ble klonet inn i vektoren pSecTag2a mellom BamHI og Notl steder ved hjelp av standardteknikker. Transfeksjon av CHO-celler (ATCC, Manassas, VA), proteinekstraksjon, og western blot-analyse ble utført som beskrevet ovenfor. En mus monoklonalt anti-Myc antistoff (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) ble brukt for påvisning av western blotting.
Kloning og ekspresjon av HATL5 Active serin protease Domain i
Pichia pastoris
Den menneskelige HATL5 aktiv serin protease domenet ble produsert i gjær ved hjelp av en Pichia Expression Kit (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, New York). For kloning inn i pPIC9 vektor, HATL5 serin protease sekvens fra pcDNA 3.1 V5 /HIS /TOPO menneske HATL5 plasmid ble mutert til å fjerne en XhoI området ved hjelp av Agilent Quick-Change II ™ seterettet mutagenese kit (Agilent Technologies, Inc. i Santa Clara, CA). Primere for mutagenese var: 5′-gccaggtgtctatactcgggtgacttcttatcgcaattgg-3 «og 5′-ccaattgcgataagaagtcacccgagtatagacacctggc-3». Mutagenese resulterte i et enkelt synonymt punktmutasjon, således reprodusere den native aminosyresekvens. Etter mutagenese, ble human HATL5 serin protease domene amplifisert og klonet inn i vektoren pPIC9 ved Xhol og Notl områder, ved bruk av primerne 5′-tctctcgagaaaagaattgtgaatggaaaaagctccc-3 «og 5′-attcgcggccgctcagagtccagtcttgg-3». Kloning ga HATL5 aktivert serinprotease-domene-sekvensen (Ile-Val-Asn) føres inn umiddelbart etter en Leu-Glu-Lys-Arg KEX2-spaltningssete som er kodet av vektoren. Den Leu-Glu-Lys-Arg-Ile-Val-Asn spaltes mellom Arg og Ile av gjæren protease KEX2 som er et transmembran protease beliggende i Golgi, gjengi et utskilt aktivert HATL5 serin protease domene. Uttrykk for matriptase aktiv serin protease domene i
Pichia pastoris
ble utført parallelt som beskrevet [19]. Transformasjon ble utført i TOPP-10-kompetente celler (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) og pPIC9-HATL5 positive kloner ble isolert og amplifisert ved hjelp av standardteknikker. For transformasjon av
Pichia pastoris
, 40 ug pPIC9-human-HATL5, pPIC9-matriptase, pPIC9 tom vektor ble spaltet med Sall og renset ved fenol-kloroform-ekstraksjon. Electroporation linearisert plasmid inn i GS115 gjærstamme (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) ble utført på 1,5 kV bruker 0,2 cm kyvetter (BioRad, Hercules, CA) i en BTX-Transporator Plus (Harvard Apparatus Holliston, MA). Ekspresjon av rekombinante proteaser i det kondisjonerte medium fra de enkelte gjær kloner ble analysert ved SDS-PAGE og western-blotting ved anvendelse av en kanin-anti-TMPRSS11b (Abcam, Cambridge, MA) eller en kanin anti-matriptase antistoff (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) . HATL5 og matriptase proteiner ble renset ved anionbytterkromatografi bruker en HiTrap Q HP kolonne (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) som beskrevet [16].
kromogen Proteinase Analyser
Analysene ble utført i 96-brønners plater i et totalt reaksjonsvolum på 100 ul ved bruk av 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,01% Tween-20, 0.01% BSA for fortynning av alle prøver. 5 nM renset aktivt rekombinant HATL5 eller matriptase serin protease domene ble inkubert ved 37 ° C i 60 minutter med 100 um av det syntetiske peptid L-1720-Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Bachem, Bubendorf, Sveits) i fravær eller nærvær (hemmer og substrat tilsatt samtidig) av HAI-en (60 nM) (R D, Minneapolis, MN), HAI-2 (40 nM) (R D, Minneapolis, MN), aprotinin (2 mikrometer) , leupeptin (20 um), benzamidin (2 mM), eller serpinA1 (60 nM) (alle fra Thermo Scientific, Waltham, MA). Endringer i absorbans ved 405 nm ble overvåket ved hjelp av en Magellan NanoQuant Infinite M200 Pro plateleser (Tecan USA, Inc., Morrisville, NC).
Deglykosylering av HATL5
Proteiner i lysatene eller kondisjonert medium fremstilt som beskrevet ovenfor ble deglykosylert ved hjelp av en enzymatisk Protein Deglykosylering Kit i henhold til produsentens instruksjoner (Sigma, St. Louis, Missouri).
Immunocytochemistry
Cell-overflate bildebehandling ble utført ved hjelp HEK293 eller COS -7 celler transfektert med human full lengde HATL5-V5. Celler ble sådd ut på dekkglass belagt med rotte-type-2 kollagen (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) og tillates å følge og vokse i 36 timer, på hvilket tidspunkt ble mediet fjernet, og cellene ble fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS i 30 min ved romtemperatur. HATL5-V5 ble påvist ved å bruke et monoklonalt anti-V5-antistoff (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) eller et isotype kontroll-antistoff (Sigma, St. Louis, MO) og en sekundær AlexaFlour-568-konjugert geit-anti-mus antistoff (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, New York). Cell farging ble fotografert av konfokalmikroskopi hjelp av en Leica TCS SP2 confocal mikroskop (Leica, Buffalo Grove, Illinois)
Bioinformatikk Analyse
Oncomine microarray database (http:. //www.oncomine. org) [17] ble brukt til å utføre en meta-analyse av uttrykk for menneskelig
TMPRSS11b
over fire studier av transkriptomet i karsinom i cervix, spiserør, og hode og nakke, sammenlignet med normale kontroll vev (tabell S1).
vevsprøver og Immunohistochemistry
«CR802», «ES482», og «T271» cervical, esophageal, og muntlig kreft vev arrays, inkludert normal eller kreft ved normal vev, ble oppnådd fra US Biomaks, Inc. (Rockville, MD).
tissue matriser ble deparaffinized med xylen og hydrert med graderte etanolløsninger. Antigen gjenfinning ble utført ved bruk av citrat-buffer, redusert pH (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Matriser ble blokkert med 2,5% normalt hesteserum (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i PBS, og immunfarget over natten ved 4 ° C med 4 ug /ml kanin-anti-humant TMPRSS11b /HATL5 (Sigma, St. Louis, MO). Som en negativ kontroll, ikke-immun kanin IgG (4 ug /ml) (Millipore, Billerica, MA) ble anvendt. Bundet antistoff ble synliggjort ved bruk av biotin-konjugert anti-kanin (Vector Laboratories, Burlingame, CA) sekundære antistoffer, og et Vectastain ABC-kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Den 3,3′-diaminobenzidin ble anvendt som substrat (Sigma, St. Louis, MO) og matriser ble motfarget med hematoksylin. Alle mikroskopiske bilder ble ervervet på en Zeiss Scope A.1 ved hjelp av digital bildebehandling.
Evaluering av Farging intensiteter og statistisk analyse
Vurdering av flekker intensiteter av spiserøret og prøver cervical vev ble utført av en etterforsker uvitende om prøven identitet. Skår ble tildelt på grunnlag av intensiteten og graden av epitelial farging ved 20x mikroskopiske felt ved hjelp av en vilkårlig skala fra null til tre, hvor 0 = ingen positiv farging i epitelceller detektert, 1 = noen epitelceller farget svakt, 2 = enkelte epitelceller farget moderat eller mesteparten av epitelceller farget svakt, 3 = noen epitelceller farget sterkt eller mesteparten av epitelceller farget moderat. Tosidige χ2 analyse ble anvendt for å bestemme statistisk signifikans av forskjellene i hyppigheten av HATL5 farging mellom gruppene. Statistisk signifikant forskjell i HATL5 fargeintensitet mellom gruppene ble bestemt av den tosidige Mann-U Whitney test.
Resultater
aminosyresekvens og domene struktur av HATL5
Analyse av aminosyre-sekvensen av det antatte humane HATL5 protease viste åtte potensielle N-glykosyleringsseter; fem av dem ligger i den serinprotease-domene (fig. 1A og B). Den katalytiske domenet av mus HATL5 inneholder viktig serin protease katalytiske triaden rester, H
225, D
270, S
366, og underlaget bindende lomme rester, D
360, S
386 og G
388. Den SWG motiv i det katalytiske domenet er bevart i alle medlemmer av HAT /DESC familien og er spådd å bli plassert på toppen av underlaget bindende lomme, posisjonering spaltbare bindingen av underlaget i riktig retning (S
386WG i HATL5). Proteolytisk aktivering av HATL5 er spådd å skje i løpet av et motiv (K
184IVNG) ved krysset mellom pro- og katalytiske domener. Disse funnene tyder på at
TMPRSS11b
genet sannsynlig koder for et funksjonelt serin protease
(A) Aminosyresekvensen til human HATL5 (UniProtKB /Swiss-Prot: Q86T26.3).. Aminosyrerester som koder for transmembrandomenet er understreket. Regionen med homologi til kråkebolle sperm protein, enteropeptidase, agrin (SEA) domener er angitt med en heltrukken linje boks og trypsin-lignende serinprotease domenet er angitt med en stiplet linje boks. Den katalytiske rester Hans
225 (H), Asp
270 (D), og Ser
366 (S), er angitt med firkanter. Potensielle N-glykosyleringsseter er angitt med sirkler. Aktiverings spaltingssetet er indikert med en pil, og de to cysteinrester spådd å danne en disulfid bro som forbinder stammen regionen til den serinprotease-domene ved aktivering spaltning, er angitt med trekanter. (B) Skjematisk representasjon av den forutsagte domenet arkitekturen HATL5. TM = transmembrandomene, SEA = Kråkebolle sperm protein, Enteropeptidase, Agrin domene, N indikerer spådde N-glykosyleringsseter, aktiveringskuttesete er angitt med en pil, og SS representerer disulfide bro som forbinder havet og serin protease domener [31 ].
HATL5 er en 60 kDa Glycosylated protein
For å karakterisere HATL5 protein kodet av
TMRSS11b
genet, ble full-lengde human cDNA generert av Hi-fi PCR ved hjelp av en menneskelig spiserør cDNA bibliotek. CDNA ble sekvensert, bekreftet å være identisk med den forutsagte cDNA-sekvensen, og ble satt inn i en pattedyr-ekspresjonsplasmid som forsynte det uttrykte protein med en V5-His epitop tag ved C- terminus (fig. 2A, øverst). I tillegg ble en pattedyr-ekspresjonsvektor inneholdende pro-formen av serin protease domene, inkludert 15 aminosyrer oppstrøms fra aktiveringssetet, og en C-terminal Myc-kode generert (figur 2A, midten) samt en
Pichia pastoris
vektor for sekresjon av det spaltede aktive form av serin protease domene (figur 2A, nederst). Etter transfeksjon av full-lengde HATL5 vektor i HEK293, COS-7 eller CHO-celler, henholdsvis, cellelysatene ble analysert ved SDS-PAGE og western blot. I alle tre cellelinjer, ble et proteinprodukt på ca. 60 kDa påvist (Fig. 2B). Denne tilsynelatende molekylmasse er betydelig høyere enn den forutsagte molekylvekt på 46 kDa, noe som tyder på at HATL5 er utsatt for post-translasjonelle modifikasjoner. For å undersøke hvorvidt det uttrykte HATL5 kan være post-translasjonelt modifisert ved glykosylering, ble proteinekstrakter fra transfekterte HEK293, COS-7 eller CHO-celler utsatt for enzymatisk deglykosylering før western blot-analyse. Deglykosylering av full-lengde HATL5 førte til fremveksten av en -48 kDa arter som var til stede i ekstrakter fra alle tre cellelinjer (Fig. 2B). Tatt i betraktning at V5-His-tag tilføyer omtrent 5 kDa til det rekombinante protein, er deglykosylert formen av full-lengde HATL5 har en tilsynelatende molekylmasse meget nær den forutsagte molekylvekt. Fem av de åtte mulige N-glykosyleringsseter er plassert i den serinprotease-domene. For å bestemme hvorvidt den serin protease domene av HATL5 er glykosylert, ble den serinprotease-pro-formen utskilt av transfekterte CHO-celler behandlet med deglykosylering enzymer og analysert ved western blotting. Før deglykosylering denne formen hadde en tilsynelatende molekylvekt på 45 kDa (fig. 2C, venstre). Den forutsagte molekylvekt av dette utskilte formen av HATL5 er 30 kDa, inkludert myc-tag. Etter deglykosylering, en reduksjon i den tilsynelatende molekylmasse, til et 30 kDa formen ble ikke observert. En lignende observasjon ble gjort ved deglykosylering av ukodet spaltet aktiv HATL5 serin protease domene utskilt av transfekterte
Pichia pastoris plakater (spådd molekylvekt = 26 kDa) som resulterte i en form med en tilsynelatende molekylvekt på ~28 kDa ( fig. 2C, høyre). Tatt sammen, viser denne analyse at menneskelig HATL5 er et 60-kDa glykoprotein og at en eller flere av de fem mulige
N
-bundne glykosyleringsseter i den serinprotease-domene blir utnyttet.
( A) Skjematisk fremstilling av tre forskjellige rekombinante proteiner HATL5 genereres for denne studien. V5-H = V5-His epitop tag (B) Antall celleprotein lysater fra HEK293, COS-7 eller CHO-celler som uttrykker full-lengde V5-His merket human HATL5. (C) kondisjonert medium fra CHO celler som uttrykker myc-merket HATL5 serin protease domene eller kondisjonert media fra
Pichia pastoris
uttrykker spaltet, aktiv HATL5 serin protease ble analysert. (B og C) Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og analysert ved western blotting ved anvendelse av anti-V5, anti-myc eller anti-HATL5 antistoffer som angitt. Lanes med proteinekstrakter som behandles med Deglykosylering enzymer før SDS-PAGE er indikert (+), og ubehandlede ekstrakter (-). De svarte pilene indikerer posisjonen til glykosylert former for HATL5, og de åpne pilspisser indikerer posisjonen til deglykosylert former.
HATL5 er et katalytisk aktivt Protease
For å undersøke den enzymatiske egenskaper av HATL5, serin protease domene, blant annet aktiverings spaltningssetet og 15 ytterligere aminosyrer oppstrøms fra spaltingssetet, ble uttrykt i CHO-celler (fig. 2) i midten. Den HATL5 proteinet ble utskilt i mediet som en enkeltkjedet pro-enzym. Et tilsvarende opplegg som tidligere anvendt for matriptase-3 førte til et utskilt protein som er i stand til å gjennomgå autoaktivering som vist ved en liten økning i elektroforetisk mobilitet og ved sin ervervet proteolytisk aktivitet [18]. Den utskilte formen av HATL5 ikke synes imidlertid å ha auto-katalytiske egenskaper siden inkubering under forskjellige ulike betingelser (buffer sammensetning, temperatur og tid), gav ikke noe påvisbart bevegelighet skift eller katalytisk aktivitet (data ikke vist). For å uttrykke HATL5 og megle proteolytisk spalting ved aktivering området,
Pichia pastoris
uttrykk systemet ble ansatt utnytte den intracellulære gjær protease, KEX2. KEX2 transmembrane serinprotease representerer subtilisin-lignende pro-protein-konvertase familie med spesifisitet for spalting etter parrede basiske aminosyrer, og er lokalisert på slutten av Golgi rommet. Ved å klone HATL5 serin protease domene inn i det pic9 vektor med det HATL5 aktiv serinprotease-domene-sekvensen (
185IVNG) umiddelbart etter LGKR KEX2-spaltningssete som kodes av vektoren, en ny fusjons spaltningssete ble generert (fig. 2, nedre ). Den LGKRIVNG sekvensen blir spaltet mellom Arg (R) og Ile (I) ved KEX2, gjengi et utskilt aktiv HATL5 serin protease domene. Uttrykk for matriptase aktiv serin protease domene i
Pichia pastoris
ble utført parallelt som beskrevet [19]. Tilstedeværelsen av HATL5 serin protease i kondisjonert medium fra
Pichia pastoris
kloner transfektert med pic9-HATL5 vektoren ble bekreftet ved western blotting ved hjelp av en anti-HATL5 antistoff (Fig. 3A, venstre). Ingen signal ble oppdaget i kondisjonert medium fra kloner transfektert med tom pic9 vektor eller pic9-matriptase vektor. Tilsvarende anti-matriptase antistoff påvises det utskilte matriptase serin protease domene i kondisjonert medium fra celler transfektert med pic9-matriptase vektor (fig. 3A, høyre) og ikke fra kloner transfektert med pic9-HATL5 ekspresjonsvektor eller pic9 vektor uten protease innsats. Den katalytiske aktivitet av HATL5 og matriptase, henholdsvis, ble bekreftet ved hjelp av serin protease kromogene substrat peptidolytic Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Fig. 3B). Kondisjonert medium fra celler transfektert med tom pic9 vektor ble inkludert som en negativ kontroll for å sikre fravær av forstyrrende skilles gjær proteaser.
(A) Betinget medieprøver fra
Pichia pastoris
kloner transfektert med enten ekspresjonsvektoren uten protease innsats (vektor), med HATL5 serin protease domene cDNA (HATL5 # 1 og # 2) eller matriptase serin protease domene cDNA ble analysert ved western-blotting ved anvendelse av en anti-HATL5 antistoff (venstre panel) eller et anti-matriptase antistoff (høyre panel). Posisjonene av HATL5 (åpen pil hode) og matriptase serin protease domene (svart pil hodet) er indikert. (B) Prøver fra det kondisjonerte medium beskrevet i (A) ble inkubert ved 37 ° C i 60 minutter med det syntetiske kromogene peptid Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (100 um), og absorbansen ved 405 nm ble registrert (C) 5 nM renset aktivt rekombinant HATL5 (hvite stolper) eller matriptase (sorte stolper) serin protease domene ble inkubert ved 37 ° C i 60 minutter med det syntetiske kromogene peptid MeOSuc-Glu-Val-Lys-Met-pNA (100 um ) i fravær eller nærvær (inhibitor og substrat tilsettes samtidig) av HAI-1 (60 nM), HAI-2 (40 nM), aprotinin (2 um), leupeptin (20 um), benzamidin (2 mM), eller serpinA1 (60 nM). Enzymaktiviteter for hvert enzym er vist i forbindelse med aktivitet når ingen inhibitor ble tilsatt.
Effekten av forskjellige serinproteaseinhibitorer på den hydrolytiske aktiviteten til det rensede HATL5 serin protease domene til Suc-Ala-Ala- Pro-Arg-pNA ble også analysert, igjen ved hjelp matriptase som en godt karakterisert henvisning TTSP (fig. 3C). HATL5 aktivitet ble redusert ved de generiske lavmolekylære inhibitorer for serin-proteaser, leupeptin og benzamidin. Fullstendig inhibering ble oppnådd med det kuleformede polypeptid, Kunitz typen serinproteaseinhibitor, aprotinin (bovint pankreatisk trypsin-inhibitor). Den makromolekylære Kunitz typen serinproteaseinhibitorer, hepatocytt-vekstfaktor aktivator inhibitor (HAI) -1 og 2, har tidligere blitt vist å hemme flere medlemmer av familien TTSP inkludert matriptase, matriptase-2, HAT, hepsin og TMPRSS13 [20] [21 ], [22] [23] [24] [25] [26] [27]. HAI-1 og HAI-2 inhiberte aktiviteten av HATL5 med 50% og 75%, respektivt. I tillegg ble HATL5 hemmet av et medlem av Serpin super, serpinA1 (α
1-1-antitrypsin).
HATL5 er lokalisert på celleoverflaten av dyrkede celler og i Stratifisert skjellepitel
Analyse av HATL5 proteinsekvens avslørte tilstedeværelsen av et enkelt transmembrandomene, noe som indikerer at HATL5 protein, i likhet med tidligere karakteriserte medlemmer av TTSP familien, kan være plassert på celleoverflaten. For å undersøke subcellulære lokalisering av HATL5 ble HEK293 celler som uttrykker V5-tagget helaftens protease analysert av fluorescerende immunocytochemistry. Nonpermeabilized transfekterte celler farget med en primær anti-V5-antistoff og en AlexaFluor 568-konjugert sekundært antistoff ble analysert ved konfokal fluorescens mikroskopi. Transfekterte HEK293-celler viste en intens rød fluorescerende signal som er begrenset til plasmamembranen (fig. 4A, venstre panel). Når primære antistoffer ble erstattet med ikke-immun IgG, ble ingen påvisbar farging observert (fig. 4A, høyre panel). En lignende membran farging ble observert i et parallelt eksperiment ved bruk av transfekterte COS-7-celler (data ikke vist).
(A) Mikrografer av fluorescerende konfokal analyse som viser celleoverflate-ekspresjon i representative eksempler på HEK293-celler transient transfektert med en menneskelige full-lengde HATL5-V5 uttrykk plasmid. Nonpermeabilized cellene ble inkubert med et anti-V5-antistoff (venstre panel) eller et kontroll ikke-immune antistoff (høyre panel), etterfulgt av inkubering med 568 AlexaFluor merkede sekundære antistoffer og Hoechst farging for å visualisere kjerner (blå; begge paneler). Cellene ble visualisert ved hjelp av konfokal mikroskopi fluorescens ved 543 nm (AlexaFluor 568) og 405 nm eksitasjonsbølgelengdene (Hoechst). Sammenslåtte bilder hentet på to eksitasjonsbølgelengdene vises. Størrelse barer er 100 mikrometer. (B) Ekspresjon av HATL5 (øvre panel) eller GAPDH-melding (nedre panel) ved hjelp av RT-PCR-analyse av mRNA ekstrahert fra hele mus organer. (C) Immunhistokjemisk analyse av HATL5 ekspresjon i normale humane vev. HATL5 protein ble detektert med et kanin-anti HATL5 antistoff i esophageal musoca (C1, D1), cervical slimhinner (E), oral mukosa (tunge) (F) og epiglottis (del av supraglottic larynx) (G). Primære antistoffer ble erstattet med ikke-immun kanin-IgG i seriesnitt av alle prøver, og ingen betydelig farging ble observert (pilspisser i C2, D2 og ikke vist). Sterk farging epitel (pilspisser) blir detektert i apikal, squamous epitelceller i normal spiserøret (C1, D1), normal livmorhalsen (E), og tungen (F) med ingen betydelig farging i den mesenchymale rommet (angitt med stjerne). Ved høy forstørrelse, er HATL5 protein klart lokalisert på celleoverflaten av apikale epitelceller (pil hode i D1). I epiglottis (G) farging observert i squamous suprabasal epitel-celler i tillegg til apikal celler. Epi = normal epitel. Størrelse barer alle paneler; 50 mikrometer.
For å bestemme uttrykket av HATL5 i vev, ble utført RT-PCR-analyse på total RNA hentet fra en serie av voksne mus vev (Fig. 4B). Denne analysen viste at HATL5 viser en relativt begrenset vev uttrykk profil, med mRNA påvist i fire av de 19 vev analysert: spiserør, cervix, tunge og testikler. Et fellestrekk mellom spiserøret, livmorhals, og tungen er at slimhinner av disse vev alle inneholder stratifisert plateepitel. Dette fikk oss til å undersøke fordelingen og cellulær lokalisering av HATL5 protein i disse vev ved immunhistokjemi (IHC). Representative deler av normal esophageal, cervical, og hode og hals (tunge og epiglottis) slimhinnen er vist i figur 4C. Ved hjelp av seriesnitt, ble objektglass probet med et kanin anti-HATL5 protein eller anvendt som negative kontroller hvor det primære antistoff ble erstattet med ikke-immun kanin IgG (fig. 4C og data ikke vist). I alle tre vevstyper en sterk epitelial farging av de apikale squamous celler uten betydelige flekker i submukøse eller mesenchymale avdelinger. HATL5 protein er primært lokalisert på celleoverflatene til de større squamous celler. Denne celleoverflate lokalisering er i overensstemmelse med den forventede fordeling av den forutsagte membran forankret topologien av HATL5. Ingen signifikant farging ble påvist i de små, cuboidal og svært mitotiske celler i basal laget.
Samlet utgjør disse data viser at
TMPRSS11b
genet styrer syntesen av et trans glykoprotein som er
