Abstract
CLPTM1L antas å være assosiert med lungekreft. Det er imidlertid lite informasjon angående dens ekspresjon og funksjon. Her bruker immunhistokjemi, fant vi at CLPTM1L uttrykket ble markert økt i lungekreft vev i forhold til normalt vev, spesielt i lunge adenokarsinom. CLPTM1L uttrykk ble ikke funnet å være assosiert med etapper, røykestatus, lymfeknutemetastaser, eller T-lymfocytter infiltrasjon, men med differensiering scenen. Vi har funnet CLPTM1L for å bli anriket i den mitokondrielle sammenlignet med plasmamembranproteinekstrakter. CLPTM1L-EGFP transfeksjon viste at molekylet produktet ble uttrykt i cytoplasma og indikerte den mitokondrielle lokalisering farget med mitokondriell markør MitoTracker. CLPTM1L overført lungekreft cellelinje 95-D viste ingen veksthemming eller celle apoptose, men det gjorde showet hemmet følsomhet for cis-diamminedichloroplatinum (II) (cisplatin, CDDP). Knockdown av CLPTM1L av RNAi ikke forstyrre cellevekst, men det gjorde øke celle følsomhet for CDDP og aktivering av caspase-9 og caspase-3/7. Disse data indikerer CLPTM1L er en mitokondrier protein, og at det kan være assosiert med anti-apoptotisk mekanisme som påvirker medikamentresistens i sin tur
relasjon:. Ni Z, Tao K, G Chen Chen Q, Tang J, Luo X, et al. (2012) CLPTM1L Er overexpressed i lungekreft og Associated med apoptose. PLoS ONE 7 (12): e52598. doi: 10,1371 /journal.pone.0052598
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, Tyskland
mottatt: 05.09.2012; Godkjent: 16 november 2012; Publisert: 26.12.2012
Copyright: © 2012 Ni et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Shanghai Science and Technology Committee (No.09JC1412900, No.10411969100), Shanghai Educational Committee (No.10YZ54), Shanghai Putuo District Science and Technology Committee (2010), og innovasjonsprogram for Shanghai Municipal Education Commission (13ZZ096). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Palate trans 1-lignende (CLPTM1L), også kalt
c
isplatin
r
esistance
r
opprømt genet 9 (CRR9), ble identifisert blant gener som er involvert i resistens mot anticancerlegemiddel cisplatin i eggstokkreft celler [1]. CLPTM1L ligger ved 5p15.33 locus nær telomerase revers transkriptase [TERT]. Nyere genetiske studier viste at dette locus er en mottakelighet region for lunge og flere andre krefttyper [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [ ,,,0],10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]. Det synes sannsynlig at naturlige genetiske varianter ville føre til unormal ekspresjon på proteinnivået, og at dette kan påvirke genfunksjon i lungekreft. Flere studier har vist CLPTM1L å være sterkt uttrykt i nyrekreft cellelinje og laryngeal plateepitelkarsinom [17], [18].
At CLPTM1L er så høyt konservert tyder på at det er nok viktig for noen grunnleggende funksjon. Men lite er kjent om hva CLPTM1L og selskapets produkt eller produkter faktisk gjør. Molekylet har imidlertid blitt funnet å være et medikamentresistens faktor [1]. Ekspresjon av CLPTM1L ble funnet å være oppregulert ved alle cisplatin-resistente cellelinjer som ble undersøkt. Overekspresjon av CLPTM1L i en cisplatin-sensitive cellelinjen ble funnet å forårsake apoptose, og CLPTM1L over-ekspresjon ble funnet å ha noen effekt på cisplatin-resistente celler.
Primær lungekreft er den ledende årsak til cancerdødsfall i de fleste industrialiserte land [19]. Den kraftige genetisk sammenheng mellom CLPTM1L og lungekreft inspirerte oss til å ta opp uttrykk og funksjon av dette genet i detalj. I denne studien beskriver vi omfanget av CLPTM1L immunhistokjemisk uttrykk i lungekreft vevsprøver, og vi analysere forholdet mellom deres uttrykk og clinicopathological variabler. Vi også gjennomføre en studie for å bestemme mulige funksjon av dette genet.
Materialer og metoder
Pasient Kjennetegn
Primære vevsprøver ble oppnådd kirurgisk fra 151 lungekreftpasienter (110 menn, alder 39-81, median alder ved diagnose er 67 år, 41 kvinner, alder 36-85, median alder ved diagnose 64 år) som ikke hadde gjennomgått noen preoperativ behandling. Kirurgi ble utført ved Shanghai Changning Central Hospital, Shanghai, Kina, mellom 2003 og 2010. Disse svulstene inkludert 55 tilfeller av adenokarsinom, 63 tilfeller av plateepitelkarsinom, 13 tilfeller av plateepitel-adenokarsinom, 5 tilfeller av småcellet lungekreft og 15 tilfeller av stor-celle lungekreft. Pasientene ble iscenesatt i henhold til de kirurgiske og patologiske funn basert på retningslinjene beskrevet i
amerikanske Joint Committee on Cancer Staging Manuell product: [20]. Tjueto pasienter ble fastslått å være i stadium Ia, 51 i stadium Ib, seks i stadium IIa, 16 i stadium IIb og 56 i stadium IIIa. For alle disse pasientene, registreringer av kirurgi, de in-pasientjournaler, brystet x-ray filmer, hele kroppen computertomografi (CT) filmer og bein skanning filmene ble anmeldt. Sammenkoblede normalt vev prøver ble tatt for å matche prøver. Studien ble godkjent av etikk komité av Putuo Hospital, Shanghai Universitetet i tradisjonell kinesisk medisin og alle pasientene gitt skriftlig informert samtykke.
Cell Line og vedlikehold
humane lungekreftcellelinjer 95-D ble kjøpt fra Institute of Cell Biology (Shanghai, Kina) og vedlikeholdes i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS.
CLPTM1L Expression analyse ved hjelp av real-time kvantitativ PCR
Total RNA ble isolert fra dyrkede celler ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Shanghai, Kina), i henhold til manufactuery protokoll. Første tråd cDNA ble fremstilt ved tilfeldig heksamer primer i henhold til instruksjonene som fulgte med den SuperScriptIII ™ første-strand syntese kit (Invitrogen). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av en Universal Master Mixer (Roche Applied Science, Shanghai, Kina) på en 7300 Real-time PCR System (Applied Biosystems, Shanghai, Kina). Primerne og probene som ble brukt var som følger: forover, 5′- TGCATTACCTGCCCATCCT -3 «; Omvendt, 5’CGCCCCAGTGAGACCTTG -3 «; Probe, 5»-fami- TCATCGACCAGCTCAGCAACCGC -tamra-3 «. GAPDH tjente som en kontroll, F: 5»-CCACTCCTCCACCTTTGAC -3 «, R: 5′- ACCCTGTTGCTGTAGCCA -3′, Probe: 5»-fami- TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC -tamra-3 «. Hver analyse ble utført i tre eksemplarer. PCR-betingelsene anvendt i alle reaksjoner var som følger: 10 min ved 95 ° C, etterfulgt av 40 to-trinns sykluser (95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min). De relative uttrykk nivåer av CLPTM1L genet ble normalisert mot GAPDH og analysert av 2
-ΔΔCt metoden [ΔΔCt = (Ct
CLPTM1L – Ct
GAPDH) prøve – (Ct
CLPTM1L – Ct
GAPDH) kontroll].
Kloning og sekvensering av Menneskelig CLPTM1L
Total RNA ble isolert fra 95-D-celler ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen) og brukt som et templat for førstetråds-cDNA-syntese ved hjelp av en RT-PCR SuperScriptIII ™ første-strand syntese kit (Invitrogen). Den CLPTM1L åpen ramme (1617 bp, GenBank tilgangsnummer NM_030782) ble amplifisert ved PCR fra cDNA generert ved revers transkripsjon av mRNA. Primerne anvendt for å amplifisere CLPTM1L-genet var som følger: F: 5′-GGAAGATCTACCATGTGGAGCGGCCGCAG -3 «; R: 5’AGACGTCGACGTCCGTGTGGGGCGCC -3 «. Den forsterkede Produktet ble renset og klonet inn i en pMD18-T Simple Vector (Takara, Shanghai, Kina). Sammensetningen av plasmidet ble bekreftet ved sekvensering.
Plasmid Konstruksjon og Gene Transfeksjon
CLPTM1L CDS region ble ekstrahert fra pMD18-T- CLPTM1L plasmider ved restriksjonsspaltning og klonet inn i en pEGFP-N3 vektor. Den konstruerte plasmid ble kåret pEGFP-N3-CLPTM1L og det ble brukt bestemme cellulær lokalisering av CLPTM1L. Primere (F: 5′-GGAAGATCTACCATGTGGAGCGGCCGCAG -3’and R: 5′-CCGCTCGAGTCAGTCCGTGTGGGGCGCC-3 «) ble anvendt for å amplifisere den CLPTM1L CDS region for bygging av pcDNA3.1 (+) -CLPTM1L vektor. Det amplifiserte produkt ble renset og spaltet ved hjelp av Bgl II og Xho I. Det ble så klonet inn pcDNA3.1 (+) vektoren spaltet med BamH I og Xho I. Det konstruerte plasmidet ble kalt pcDNA3.1 (+) -CLPTM1L og anvendt for CLPTM1L overekspresjon. 3 × 10
5 95-D-celler ble deretter transient transfektert med enten pEGFP-N3-CLPTM1L eller pEGFP-N3 ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Shanghai, Kina) i 24 timer. Cellene ble deretter høstet for celleproliferasjon eller cisplatin sensitivitetsanalyse.
Fluorescensmikroskopi
For å bestemme subcellulære lokalisering av CLPTM1L-EGFP, cellene ble først transient transfektert med pEGFP-N3-CLPTM1L hjelp Lipofectamine 2000. Førtiåtte åtte~~POS=HEADCOMP timer etter transfeksjon ble cellene inkubert med MitoTracker fargestoff (Invitrogen) i 30 minutter under vekstbetingelser. Etter inkubasjon ble cellene observert ved hjelp av en fluorescens mikroskop.
Immunohistochemistry
resected vevsprøver ble fiksert i formalin, innstøpt i parafin, skåret i 4 mikrometer seriesnitt, og deretter montert på glassplater. Antigen gjenfinning ble utført ved bruk av citrat-buffer (0,01 mmol /L, pH 6. 0) .Etter gjenfinning av antigenet, ble platene vasket tre ganger med PBS og inkubert i 10% normalt geiteserum for å blokkere ikke-spesifikk bakgrunnsfarging. Seksjonene ble deretter over natten inkubert med kanin anti-human CLPTM1L antistoffer (Sigma, Shanghai, Kina) ved 4 ° C. Seksjonene ble vasket tre ganger med PBS, og inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -anti-kanin-IgG (Bio Maixin, FuZhou, Kina) i 30 min. De ble deretter vasket tre ganger med PBS. Seksjonene ble visualisert ved anvendelse av diaminobenzidin oppløsning (DAB). Lysbilder ble evaluert samtidig av to patologer ved hjelp av en tohodet lysmikroskop. De patologer ble ikke informert om hver enkelt pasients kliniske posten. CLPTM1L ekspresjon ble semikvantitativt mottok basert på intensiteten av fargingen og relative antall celler farget. Ufargede vev ble scoret som 0, svak farging, moderat eller sterk farging i 25% av cellene ble scoret som en, ble moderat farging eller sterk farging i 25-50% av celler scoret så to og sterk farging i 50% celler ble scoret som 3.-celler ble utført ved × 400 i minst fem felt i tilfeldig utvalgte kreftområder.
for å studere sammenhengen mellom CLPTM1L og nivået på tIL infiltrasjon, vi valgte feltet med størst mengden av CLPTM1L uttrykk, og telles antall CD45
+ celler per 1000 totalt kjerner.
immunocytochemistry
Expression of CLPTM1L protein ble bestemt ved bruk immunocytochemistry. Dagen før analysen, ble totalt 1 × 10
5 celler sådd ut Millicell EZ Slide (Millipore, Shanghai, Kina). Etter 24 timer inkubering ble cellene fiksert på objektglass ved bruk av 4% paraformaldehyd. Cellene ble permeabilisert 3 ganger i 5 minutter med 0,1% Triton X-100 i PBS og blokkert med blokkeringsbuffer (10% normalt geiteserum, 0,1% Triton X-100) i 30 minutter ved romtemperatur. Etter blokkering, ble cellene vasket med PBS og inkubert over natten ved 4 ° C med kanin-anti-humane CLPTM1L antistoffer (Sigma, Shanghai, Kina). Den følgende dag ble cellene vasket 3 ganger med PBS og inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) -anti-kanin IgG i 30 min. De ble deretter vasket tre ganger med PBS. Seksjonene ble visualisert ved hjelp av diaminobenzidin løsning.
mitokondrie Rensing og Western Bolt analyse
Først 2 × 10
7 95-D-celler ble høstet og mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner ble isolert ved hjelp av en mitokondrieFraksjone Kit (Activemotif, Shanghai, Kina). De mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner ble separert på en 10% SDS-PAGE, og deretter overført til en PVDF-membran. PVDF-membranen ble blokkert med 5% BSA og vasket to ganger med TBST. Membranen ble deretter inkubert med CLPTM1L antistoffer (Abgent, Shanghai, Kina) over natten ved 4 ° C og vasket tre ganger med TBST, fulgt av inkubasjon med anti-kanin-IgG-pepperrot-peroksidase sekundært antistoff (Cellsignal, Shanghai) i 2 timer ved romtemperatur. Til slutt ble immunoreaktive band påvises ved hjelp av ECL-reagens (Millipore).
Bygging av CLPTM1L RNAi Lentivirus
siRNA sekvenser mot menneske CLPTM1L genet (GenBank tiltredelse antall NM_030782) ble designet og syntetisert av Genechem (Genechem, Shanghai, Kina). Blant fire kandidat sirnas uttrykk kassetter, fant vi sans siRNA sekvens (5-CAGTTTCTGGAAGAAGAAGAA-3) for å ha den beste forstyrrende effekt i vår 95-D-infisert cellesystem. SiRNA ble innsatt i pGCSIL-GFP lentiviral vektor. En kontroll siRNA (5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3) ble anvendt som en negativ kontroll. Lentiviruses kodet med siRNA mot CLPTM1L og kontrollen ble fremstilt ved kotransfeksjon av 293T-celler ved bruk av lipofektamin 2000 (Invitrogen) i henhold til standard protokoller. 5 x 10
4 95-D-celler ble infisert med enten CLPTM1L siRNA lentivirus eller negativ kontroll siRNA-vektoren ved en MOI på ca. 100 ° C i 72 timer. Cellene ble deretter byttet til komplett medium. Etter 72 timer kultur, ble cellene høstet for celledeling, cisplatin følsomhet eller caspase-3/7 og caspase-9-analyse.
Cisplatin Sensitivity Analysis and Cell Proliferation analyse
Først 1 × 10
4 celler per brønn ble sådd ut på en 96-brønns plate. Etter 24 timers inkubering, 25 uM, 50 uM og 75 uM cisplatin (Sigma) ble tilsatt og inkubert i 24 timer. Etter 24 timer ble levende cellepopulasjon analysert ved hjelp av Cell Proliferation Reagens WST-1 (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Celleproliferasjon ble vurdert på forskjellige punkter i tid ved hjelp av WST-1.
Analyse av caspase-3/7 og caspase-9 Analyse
Den 95-D-celler infisert med CLPTM1L lentivirus og kontrollere lentivirus ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS. I korthet, en x 10
4-celler ble sådd på en 96-brønns plate og inkubert over natten. Etter 24 timer ble 95-D-celler ble behandlet med 50 uM cisplatin (Sigma) i 24 timer. Etter 24 timer ble 100 ul av Caspase-Glo 3/7 eller Caspase-Glo 9-reagens (Promega, Shanghai) tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur i 2 timer. Etter inkubasjonen ble målt ved anvendelse av luminans TD 20/20 Luminometer (Promega). Hver prøve ble målt i tre eksemplarer.
Statistical Analysis
De assosiasjoner mellom uttrykket av CLPTM1L og clinicopathological variabler ble analysert ved hjelp av Fishers eksakte test, chi-kvadrat tester eller kontinuitet korreksjon chi-kvadrat tester av SPSS16.0 programvare, og relasjonene mellom antall tIL og CLPTM1L ble evaluert med Mann-Whitney test med Instat3.36. For forholdet mellom ulike markører, ble enkel lineær regresjon utført ved hjelp av Statview SE + Graph.
Resultater
1. Ekspresjon av CLPTM1L i Human Lung Cancer
ekspresjon mønster av CLPTM1L molekyler på overflaten av tumorcellene først meget diffus i de fleste tilfeller. Mikroskopisk den CLPTM1L molekylet ble funnet i cytoplasma (fig. 1). I disse prøvene ble infiltrere mastceller funnet å uttrykke CLPTM1L sterkt men lymfocytter var ikke. Av de 151 pasienter som ga prøver, 136 (86,8%) viste CLPTM1L ekspresjon og CLPTM1L ble overuttrykt i tumorvev sammenlignet med tilstøtende vev, noe som var statistisk signifikant forskjellige (p = 0,000, tabell 1). Fordelingen av intensiteten av fargingen i alle prøver er vist i tabell 1. Et forhold mellom intensiteten av fargingen og patologisk klassifikasjon ble notert. Prosentandelen av sterk farging (++ +++ ~) av CLPTM1L ekspresjon i adenokarsinom var høyere enn i plateepitelkreft (p = 0,000, tabell 1). På grunn av den begrensede omfanget av denne studien, kan de positive forhold av stor-celle lungekarsinom og små-celle lungekreft ikke bestemmes entydig. Det relative antall mørkt fargede celler var mye høyere i adenokarsinom prøvene enn i kontrollene. De fleste tilstøtende vev viste enten svak flekker eller ingen i det hele tatt
(A) Normal lungevev (× 200).; (B) Seksjon fra lunge adenokarsinom (× 200); (C) Seksjon fra lunge plateepitelkreft (× 200); (D) Seksjon fra lunge adenokarsinom (× 400).
2. Forholdet mellom Clinicopathologic Kjennetegn og CLPTM1L Expression i lungekreftpasienter
Vi fant CLPTM1L uttrykk var assosiert med graderinger av differensiering (p = 0,046, Tabell 2), ble observert imidlertid ingen signifikant sammenheng mellom CLPTM1L uttrykk nivåer og pasientens alder , kjønn, røykestatus eller TMN stadium i 151 lunge prøvene (tabell 2). Ingen sammenheng ble funnet mellom uttrykket av CLPTM1L og lymfocytter infiltrasjon, som indikerte at uttrykk for CLPTM1L ikke var relatert til immunsuppresjon (Data ikke kjent).
3. Mitokondrie Lokalisering av CLPTM1L
Den nøyaktige cellulær lokalisering av CLPTM1L med hensyn til sine roller i lungekreft progresjon er foreløpig uklart. Undersøkelse av sekvensen av CLPTM1L hjelp MITOPROT (https://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/mitoprot.html) indikerte en 84% sannsynlighet for at CLPTM1L ble eksportert til mitokondriene. For å bestemme plasseringen av CLPTM1L protein, ble mitokondriell og cytosoliske fraksjon av 95-D-celler ble ekstrahert for Western blot-analyse. Som vist på fig. 2A, CLPTM1L protein ble hovedsakelig funnet i den mitokondrielle fraksjon av cellene. For å bekrefte dette, bygget vi en CLPTM1L ekspresjonsvektor ved å fusjonere den EGFP på C endestasjonen CLPTM1L (CLPTM1L-EGFP). Da 95-D-celler ble transient transfektert med CLPTM1L-EGFP vektor og farget med mitokondrie markør MitoTracker. De fluorescerende bilder tydelig angitt mitokondrielle lokalisering av CLPTM1L protein (figur 2B).
(A):. Western blot-analyse for ekspresjon CLPTM1L i hel-celleekstrakt, cytosoliske og mitokondrielle fraksjon av 95-D-celler. (B): 95-D-celler ble transient transfektert med CLPTM1L-EGFP vektor og farget med mitokondrie markør MitoTracker
4.. Effekt av CLPTM1L Overuttrykte i Infiserte 95-D-celler
For å kunne analysere de funksjonelle konsekvensene av forhøyet CLPTM1L uttrykk i lungekreft, ble CLPTM1L overexpressed i 95-D-celler. Overekspresjon ble bekreftet ved hjelp av real-time PCR og immunocytochemistry (Fig. 3A og 3B). Vi fant ikke vekst å være hemmet etter 72 timer med overekspresjon, som bestemmes ved analyse spredning. Celler som overuttrykker CLPTM1L tendens til å være mindre sannsynlighet for å dø når inkubert med 25-75 uM cisplatin, selv om denne forskjellen ikke ble funnet å være statistisk signifikant (Fig. 3C og 3D).
(A) CLPTM1L mRNA nivå ble målt ved bruk av kvantitativ real-time PCR i pcDNA3.1 (+) – CLPTM1L eller pcDNA3.1 (+) plasmid-transfekterte celler. *:
P
0,05 vs kontrollgruppen (p = 0,001). (B) Ekspresjon av CLPTM1L protein ble undersøkt ved å bruke immunocytokjemi. (C) Effekter av CLPTM1L overekspresjon på celleproliferasjon i pcDNA3.1 (+) – CLPTM1L transfekterte celler 95-D-celler i forhold til kontroll 95-D-celler. (D) Overekspresjon av CLPTM1L ikke ble endret kjemosensitivitet til cisplatin i humane lungekreft 95-D-celler transfektert med pcDNA3.1 (+) – CLPTM1L i forhold til kontrollene. Cellene ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av cisplatin i 24 timer.
5. Effekter av CLPTM1L i slått ned 95-D celler infisert av CLPTM1L shRNA Lentivirus
Vi brukte en lentiviral vektor som inneholder shRNA spesifikt mot og stabilt slå ned uttrykket av CLPTM1L i lungekreft 95-D-celler. Sanntids-PCR-analyse viste at CLPTM1L mRNA-ekspresjon i shRNA-CLPTM1L-transfekterte celler var markert lavere enn den for kontroll 95-D-celler (Fig. 4A). Redusert ekspresjon av CLPTM1L-protein ble også bekreftet ved immunocytokjemi (Fig. 4B).
(A) CLPTM1L mRNA nivå etter RNAi behandling ble målt ved bruk av kvantitativ real-time PCR i forskjellige grupper. *: P = 0,000 vs NC kontrollgruppe. (B) Ekspresjon av CLPTM1L protein etter RNAi behandling ble undersøkt ved å bruke immunocytokjemi. (C) Vekst av shRNA-CLPTM1L transfekterte celler 95-D-celler og kontroll-95-D-celler i 72 timer. (D) shRNA-CLPTM1L transfekterte celler 95-D-celler og kontroll-95-D-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av cisplatin i 24 timer. *: P = 0,003 vs NC kontrollgruppe (25 mm) og #: p = 0,006 vs NC kontrollgruppe (50 mm)
For å demonstrere den biologiske aktiviteten til CLPTM1L, vi undersøkt effekten av. redusert CLPTM1L uttrykk på lungekreft cellevekst in vitro. Ved hjelp av en celle proliferasjonsanalyse, har vi funnet at shRNA-CLPTM1L-transfekterte 95-D-celler hadde en vekst lik den til kontrollceller i løpet av en 72 timers periode (fig. 4C). CLPTM1L knockdown påvirket ikke celleproliferasjon.
6. RNAi-mediert knockdown av CLPTM1L Økt kjemosensitivitet til Cisplatin i humane lungekreft 95-D-celler og cisplatin-indusert aktivering av Caspase-9 og Caspase-3/7
CLPTM1L ble først oppdaget i en cisplatin-resistente ovarial tumor cellelinje. Her fastslås vi om redusert CLPTM1L uttrykk kan øke kjemosensitivitet til cisplatin i lungekreftceller. Forskjellige konsentrasjoner av cisplatin ble brukt til å behandle shRNA-CLPTM1L-transfekterte 95-D-celler i 24 timer. Vi har funnet cellevekst å være signifikant hemmet i knockdown-celler etter behandling med cisplatin (fig. 4D). Dette indikerte at CLPTM1L knockdown kan øke kjemosensitivitet til cisplatin i humane lungekreft 95-D-celler.
Mitokondrier er nøkkelen til regulering av apoptose [21], og de spiller en viktig rolle i cisplatin-indusert apoptose. Etter behandling med cisplatin, caspase-9 og caspase-3/7 i mitokondrier ble aktivert. Siden CLPTM1L protein ble funnet å bli eksportert til mitokondriene, vi lurte på om CLPTM1L var assosiert med apoptostic protein. Vi undersøkte deretter aktiveringen av caspase-9 og caspase-3/7 i shRNA-CLPTM1L-transfekterte 95-D-celler og tak 95-D-celler for å bestemme om CLPTM1L var involvert i mitokondrie apoptose pathway. Våre resultater viste at cisplatin-indusert apoptose til å begynne med aktiveringen av caspase-9, etterfulgt av aktivering av kaspase-3/7 i begge celletyper. Videre knockdown av CLPTM1L forårsaket økt aktivering av kaspase-9 og caspase-3/7 (fig. 5). Dette betyr at CLPTM1L knockdown-celler er mer sensitive overfor cisplatin.
shRNA-CLPTM1L transfektert 95-D-celler og kontrollceller ble behandlet med 50 uM cisplatin i 24 timer. Caspase-3/7 og caspase-9 aktivitet ble målt, og resultatene ble fremstilt som gangers økning av aktiviteten av cellene uten cisplatin behandling. *: P = 0,004 vs NC kontrollgruppe (caspase-3/7) og #. P = 0,000 vs NC kontrollgruppe (caspase-9)
Diskusjoner
I håp om å definere patogenesen av CLPTM1L i lungekreft, fokuserte vi på CLPTM1L uttrykk, cellulær lokalisering og funksjonell sammenheng med lungekreft. Vi fant at CLPTM1L ble uttrykt i cancer lungevev, mest intenst i adenokarsinom vev. Western-blot-analyse og CLPTM1L-EGFP transfeksjon både indikerte at molekylet kan være lokalisert i mitokondriene. Den nøyaktige funksjon til molekylet er fremdeles uklar. Vi konstaterte sin tilknytning kjemosensitivitet til cisplatin og aktivering av mitokondrielle apoptotiske sti avhengig av RNAi knock-down teknikken. Så langt vi kjenner til, er dette den første bevis for plassering av molekylet.
Denne studien gitt mer bevis for at CLPTM1L var assosiert med lungekreft [22], som var i overensstemmelse med publisert studie av James et al og The human Protein Atlas-prosjektet [23]. James et al undersøkte uttrykk for CLPTM1L i mRNA nivå og fant CLPTM1L mRNA uttrykk var i gjennomsnitt 2,24 ganger høyere i tumorvev i forhold til tumor-tilstøtende vev [23]. Når det kombineres med James «arbeid, vår observasjon syntes å indikere at de forhøyede CLPTM1L protein nivåer kan skyldes økningen i CLPTM1L mRNA nivåer. I tillegg sammenlignet vi forholdet mellom CLPTM1L uttrykk i lungekreft pasienter med pasientenes clinicopathologic egenskaper. Vi fant CLPTM1L uttrykk var sterkt assosiert med graderinger av differensiering (p = 0,046, Tabell 2), men ble ikke observert noen signifikant sammenheng mellom CLPTM1L uttrykk nivåer og pasientens alder, kjønn, røykestatus eller TMN scenen i 151 lunge prøver. Videre er andelen av sterk farging av CLPTM1L uttrykk i adenokarsinom var høyere enn i plateepitelkreft, selv om James et al ikke fant en forskjell i CLPTM1L uttrykk mellom NSCLC subtyper. Forskjellen mellom resultatene og James «resultatene kan være forårsaket av det antall pasienter. James analysert 22 adenokarsinom og 8 plateepitelkarsinom pasienter mens vi analysert 55 adenokarsinom og 63 plateepitelkarsinom pasienter.
Her er vi bekreftet at CLPTM1L protein ble mer høyt uttrykt i lungekreft, spesielt i adenokarsinom, enn i normal vev, Dette indikerte at den praktiske anvendelsen av genetiske variasjoner av genet ikke var begrenset til bruk som genetiske markører. Forekomsten av lunge adenokarsinom har vært økende markert. Årsaken er allment antatt å involvere luftforurensning og passiv røyking. Imidlertid karsinogenese [19], [24] er komplisert, og den CLPTM1L genet kan også spille en viktig rolle. Genetisk analyse har vist at CLPTM1L er nært knyttet til adenocarcinoma lunge og genetisk variasjon kan føre til unormal genekspresjon, som spiller en viktig rolle i patogenesen av lungekreft.
Proteinet synes å være lokalisert til mitokondriene, så indikert av Western-blot og CLPTM1L-EGFP transfeksjon. Denne konklusjonen understøttes av protein prediksjon. Beregningen av hydrofilisitet indikerer at CLPTM1L protein kan være et transmembranprotein. Ifølge disse data, vi hevdet at dette proteinet var et transmembranprotein som ligger på mitokondrier membranen.
Den eksakte funksjonen til CLPTM1L er fortsatt ukjent. James et al viste at CLPTM1L hadde en apoptotisk rolle nedstrøms DNA-skade og gjennom regulering av Bcl-xL uttrykk [23]. I denne studien, kan vi ikke fastslå den eksakte biologiske endringer knyttet CLPTM1L overekspresjon og banke ned i lunge kreft cellelinjer. I motsetning til resultatet av forrige rapport [1], gjorde overekspresjon av CLPTM1L i 95-D lungecellelinje ikke indusere apoptose og cellene har en tendens til å være mindre kjemosensitiv til cisplatin [1]. Forskjellen kan ha blitt forårsaket av ekspresjonsvektorer, som kan ha forårsaket forskjellige produkter: CLPTM1L-His for denne studien og CLPTM1L-GFP for forrige undersøkelse. RNAi-mediert knockdown av CLPTM1L økt kjemosensitivitet til cisplatin i humane lungekreft 95-D-celler og cisplatin-indusert aktivering av caspase-9 og caspase-3/7. Økt aktivering av kaspase-9 og caspase-3/7, er forbundet med økt aktivering av mitokondriell apoptose pathway. Vi har likevel funnet at mastcellene høyt uttrykte proteinet. Det er allment akseptert at mastcellene er forbundet med kreft, de forbedre tumor angiogenese og gjengi fremgang dårligere [25]. Ifølge disse data, forutsa vi at proteinet kan være assosiert med anti-apoptotisk mekanisme som påvirkes medikamentresistens. Videre analyser er nødvendig for å bekrefte denne spådommen.
De spesifikke roller CLPTM1L i lungekreftceller fortjener videre undersøkelser. Det er mulig at CLPTM1L kan være viktig for å opprettholde cellulær stabilitet, og at et tap av funksjon kan resultere i økt kjemosensitivitet til cisplatin.
