Abstract
Bakgrunn
Magekreft fortsetter å være en av de dødeligste kreft i verden, og derfor identifisering av nye legemidler rettet mot denne typen kreft er derfor av vesentlig betydning. Hensikten med denne studien var å identifisere og validere en terapeutisk middel som kan forbedre resultatene for mage kreftpasienter i fremtiden.
metodikk /hovedfunnene
Ved hjelp av mikromatriseteknologi, genererte vi et gen uttrykk profilen til menneskelige mage kreft-spesifikke gener fra menneskelige mage kreft vevsprøver. Vi brukte denne profilen i Broad Institute Connectivity kart analyse for å identifisere kandidat terapeutiske forbindelser for magekreft. Vi fant histondeacetylase inhibitor vorinostat som ledelsen sammensatte og dermed en potensiell terapeutisk legemiddel for magekreft. Vorinostat indusert både apoptose og autofagi i mage kreft cellelinjer. Farmakologisk og genetisk hemming av autophagy økte imidlertid den terapeutiske effekt av vorinostat, noe som indikerer at en kombinasjon av vorinostat med Autophagy inhibitorer kan terapeutisk være mer fordelaktig. Videre genuttrykk analyse av magekreft identifisert en samling av gener (
ITGB5, TYMS, MYB, APOC1, CBX5, PLA2G2A, etter og
KIF20A
) hvis uttrykk ble forhøyet i mage svulstvev og downregulated mer enn to ganger ved vorinostat behandling i mage kreft cellelinjer. I kontrast,
SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1, etter og
NQO1
manifestert en omvendt mønster.
Konklusjon /Betydning
Vi viste at analyse av genuttrykk signatur kan representere en ny tilnærming til å oppdage terapeutiske midler for magekreft, som vorinostat. Observasjonen av endret genuttrykk etter vorinostat behandling kan gi holdepunkt for å identifisere den molekylære mekanismen for vorinostat og de pasientene sannsynlig å dra nytte vorinostat behandling
Citation. Claerhout S, Lim JY, Choi W, Park YY, Kim K, Kim SB, et al. (2011) Gene Expression Signatur Analyse Identifiserer Vorinostat som en kandidat terapi for magekreft. PLoS ONE 6 (9): e24662. doi: 10,1371 /journal.pone.0024662
Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, USA
mottatt: 29 mars 2011; Godkjent: 16 august 2011; Publisert: 09.09.2011
Copyright: © 2011 Claerhout et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Tilskudd SC som en Odyssey Fellow ble støttet av Odyssey Program og Theodore N. Law Endowment for Scientific Achievement ved University of Texas MD Anderson Cancer Center. Dette arbeidet ble også støttet av midler fra 2009 Internal Medicine Academic forskningsfond og Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (No. 2010-0024248). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreftdød i verden [1], med en total overlevelse på ca 10 måneder [2] – [4]. Behandling for magekreft kan omfatte kjemoterapi, kirurgi og strålebehandling. Dessverre, nåværende kjemoterapi-baserte behandlinger for avansert magekreft viser skuffende resultater [2] – [4]. Faktisk, komplette remisjoner er sjeldne eller bare vare svært kort tid.
Flere målrettede midler der det gis overlevelses fordeler i andre krefttyper har vært under etterforskning i magekreft. Mens noen tidlige kliniske studier ved bruk av vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor (VEGFR) og epitelial vekstfaktor reseptor (EGFR) -1-hemmere, som cetuximab og bevacizumab, har vist noe aktivitet, er det sjelden en faktisk økte overlevelse for pasientene [5] , [6]. En av årsakene kan være at disse studiene ikke valgte pasienter i henhold til tilstedeværelsen av biomarkører. Nylig Trastuzumab for magekreft (toga) studie bemerket at tillegg av trastuzumab til kjemoterapi førte til en statistisk signifikant forbedring i progresjonsfri overlevelse (PFS) og total overlevelse (OS) av de ca 20% av pasienter med disseminert mage og gastroøsofageal (GE) junction svulster overekspresjon HER2 [7]. Dette understreker behovet for målrettet biologisk behandling og jakten på biomarkører for å velge pasienter for kliniske studier som kan ha nytte overlevelse. Til tross for noen bevis for mulige mål, inkludert HER2 [8], [9], er effekten av disse biologisk målrettet terapi ikke kjent, og det er en mangel på en standard målrettet terapi for magekreft. På grunn av den biologiske heterogenitet av magekreftformer, er det lite sannsynlig at det er en enkelt «magic bullet «kur. Molekylære markører blir derfor viktig i fremtiden å forutsi pasientens utfall og skreddersy behandlinger i henhold til individuell biologi.
I jakten på biomarkører, har vært brukt genuttrykk signaturanalyse i ulike programmer, for eksempel for å belyse den mekanismer for biologiske pathways [10], klassifisere undergrupper av en sykdom [11], forutsi kreft prognose [12] og profilerings genuttrykk som svar på bestemte legemidler [13], [14]. Genuttrykk signatur analyse kan gjøres ved hjelp av The Broad Institute Connectivity Map (https://www.broadinstitute.org/cmap). Connectivity kart som mål å generere et kart som knytter genuttrykksmønster assosiert med sykdom til tilsvarende mønstre som produseres av legemiddelkandidater og genetiske manipulasjoner [15], [16]. Dette gjør det mulig for systemtilnærming forbindelser som skal skjermes mot genom sykdom signaturer, snarere enn et forutvalgt sett av målgener. Narkotika er koblet sammen med sykdommer ved hjelp av avanserte mønstergjenkjenningsmetoder med høy oppløsning og spesifisitet. Selv om det etterlater mange åpne spørsmål, har Connectivity Map vist kan benyttes som genomisk signaturanalyse til å gjenkjenne legemidler med felles mekanismer for handlinger, oppdage ukjente virkningsmekanismer og identifisere eventuelle nye behandlingsformer [15], [16].
Hensikten med denne studien var å identifisere eventuelle nye behandlingsformer for behandling av magekreft. For å gjøre dette, må vi først analysert genomisk underskrift av menneskelig magekreft. Den resulterende magekreft genet signaturen ble deretter brukt
i silico
ved å ansette Tilkobling kart analyse for å identifisere terapeutiske midler som potensielt kan være effektive mot denne typen kreft. Vi ytterligere validert toppen målretting stoffet for sin effekt i mage kreft cellelinjer. Vi fant ut at vorinostat, som et mulig nytt legemiddel, induserte både apoptose og autofagi i mage kreftceller. Sammen denne studien viser at Connectivity kartanalyse kan brukes for identifisering av terapeutiske midler som kan være vellykket i behandlingen av en undergruppe av mage kreft.
Metoder
Analyse av microarray data
for tilkoblings kart analysen har vi brukt microarray data fra 65 mage kreftpasienter, inkludert 65 kreft og 19 normale mage vev, som ble hentet fra vårt tidligere arbeid, Yonsei data [17]. Tumorprøver ble samlet fra magekreftpasienter som gjennomgår gastrektomi som en primær behandling. Vevsprøver ble undersøkt ved patologer på tidspunktet for innsamling og lagres i -80 ° C i vevet bank til starten av forsøket. Total RNA ble ekstrahert fra frisk-frosset vev ved hjelp av en Mirvana RNA isolering merkingskit (Ambion, Inc.). Primær microarray data er tilgjengelig i NCBI Gene Expression Omnibus offentlig database (microarray plattform, GPL6884, microarray data, GSE 13861). En annen genekspresjon profilen er innhentet fra 69 mage vevsprøver, inkludert 38 kreft og 31 ikke kreft stroma, av Stanford Microarray Database (https://smd.stanford.edu, GSE13911), Stanford data. Magekreft-spesifikke gener ble valgt av BRB-ArrayTools versjon 3.6.1 (Biometrisk Forskning Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD). Klasse sammenligning med to utvalgs t-test (betydning 0,001, 10000 tilfeldig permutasjon) identifisert magekreft spesifikke gener og gener som betyr uttrykket intensiteter ble endret med minst to ganger sammenlignet med bety normalt vev genuttrykk ble valgt
.
Tilkobling kart analyse
for å identifisere potensielle legemidler rettet mot magekreft, gense lister over topp 500 opp regulert og toppen 500 ned regulerte gener fra mage kreft-spesifikke gener ble brukt (tabell S1). Connectivity kart Analysen ble gjennomført gjennom webgrensesnitt (https://www.broadinstitute.org/cmap) bruker versjon, bygge 02, som inneholder mer enn 7000 uttrykk profiler som representerer effekten av 1,309 forbindelser på flere dyrkede humane celler [15], [16]. Kartet Connectivity viser funksjonelle forbindelser mellom narkotika, gener og sykdom. Legemidler som produserer sykdomsligne gen signaturer kan bidra til å identifisere veier som representerer potensielle terapeutiske mål for denne sykdommen. Omvendt, legemidler som induserer en «omvendt» signatur, dvs. endringer i genuttrykk i motsatt retning av det som ble observert i sykdomstilstanden, kan representere nye terapeutiske midler. Kandidat midler mot en spesifikk sykdom kan gjenkjennes ved å påføre sykdom spesifikk genekspresjon profilen til Connectivity kart analyse. Vi valgte kandidat narkotika for validering
in vitro
på grunnlag av tilkoblings score, korrelasjon, og P-verdi.
Kjemi og cellekultur
Vorinostat ble innhentet fra Merck og fremstilt som en stamløsning i dimetylsulfoksyd (DMSO). Klorokin og bafilomycin A1 (Sigma) ble oppløst i henholdsvis vann og DMSO. Menneskelige mage kreft cellelinjer AGS, NCI-N87, og KATO-III ble oppnådd fra American Type Culture Collection og ble opprettholdt i henhold til sine anbefalinger. Celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U penicillin, og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i 5% CO
2.
Cellevekst, levedyktighet og cellesyklus assays
i 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analysen ble MTT oppløst i PBS ved 5 mg /ml. Omtrent 5 x 10
3-celler ble sådd ut i 96-brønners plater og tillatt å feste over natten. Dyrkningsmediet ble så byttet ut med ferskt medium som inneholdt de angitte konsentrasjoner av vorinostat eller DMSO. Etter 72 timer ble 20 ul av MTT-løsning tilsatt, og platene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Etter inkubering ble 100 ul DMSO tilsatt for å oppløse formazanet, og absorbansen ble avlest ved 570 nm ved anvendelse av en spektrofotometrisk mikroplateleser (Vmax kinetisk mikroplateleser, Molecular Devices). Forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
For krystallfiolett farging ble cellene behandlet i 12 timer, ble mediet fjernet, og cellene ble vasket med PBS og deretter inkubert i 30 minutter med 0,5% krystallfiolett (i 20% metanol og 80% dobbelt-destillert vann). Cellene ble deretter vasket tre ganger med PBS. Den resterende krystallfiolett ble ekstrahert i eddiksyre i 5 minutter, og absorbansen ble målt ved 595 nm ved anvendelse av en spektrofotometrisk mikroplateleser.
For å bestemme celle-levedyktighet, ble celler inkubert med vorinostat i 72 timer. Adherente celler ble deretter frigjort fra kulturplater ved trypsinering og kombinert med flytende celler, sentrifugert og suspendert i 500 ul av propidiumjodid (PI) -Exclusive løsning (ikke cellemembrangjennomtrengende) i 15 minutter ved 4 ° C. Fargede celler ble målt ved flowcytometri (Beckman Coulter Cytomics FC 500).
For cellesyklusanalyse, ble celler inkubert med vorinostat i 24 timer, oppsamlet og suspendert i 500 ul hypotonisk oppløsning (0,1% natrium-citrat, 0,1% Triton X-100, 100 pg /ml RNase og 50 ug /ml PI) i 15 min ved 4 ° C. PI-fargede celler ble målt ved flowcytometri. Cellesyklus ble analysert ved hjelp av multicycle AV programvare.
RNA isolasjon og microarray eksperimenter
RNA isolering og microarray eksperimenter ble utført i henhold til protokollen som tidligere beskrevet [17]. Total RNA ble ekstrahert fra mage kreft cellelinjer med eller uten vorinostat Behandling med Mirvana RNA isolering kit (Ambion, TX, USA). Integriteten av det store RNA-fraksjonen ble bestemt med en Experion® Bioanalyzer (Bio-Rad, CA, USA) som et surrogat for mRNA kvalitetskontroll. Total RNA ble merket og hybridisert med menneskelig HT12 v.3 uttrykk BeadChips henhold til produsentens protokoller (Illumina, CA, USA). Etter BeadChips ble skannet med en Illumina BeadArray Reader ble microarray data normalisert ved hjelp av quantile normalisering metoden i lineære modeller for mikroarray data pakke i R språkmiljø [18]. Uttrykket nivået av hvert gen ble forvandlet til en log
2 base før videre analyse. Cluster analyse ble gjort med Cluster og Utforsker [19].
Western blot analyse
Celler ble skrapt i medium og spunnet ned, og proteinene ble isolert ved hjelp av lysebuffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA og 10 mM natriumpyrofosfat (pH 7,4)) inneholdende 100 mM NaF, 10% glycerol, 1,5 mM MgCl
2, 1% Triton X-100 og protease-inhibitor (Roche). Ekstraktene ble inkubert på is i 20 min og sentrifugert ned ved 20800 g i 20 min. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å bruke BCA-proteinanalyse-reagens (Pierce). Like mengder av protein fra hver prøve ble separert ved elektroforese gjennom SDS-PAGE og overført til Hybond-C Super membran (Amersham Pharmacia Biotech). Membranene ble blokkert i 1 time ved romtemperatur i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20 og 5% fettfri tørrmelk. Membraner ble inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff fortynnet i 5% fettfri tørrmelk eller 5% BSA i 1 x Tris-bufret saltvann plus 0,1% Tween-20. Antistoffer mot LC3 (Novus Biologicals), aktiv caspase-3 (Epitomics) og p62 (BD Biosciences) ble anvendt. Antistoffer til a-tubulin og beclin-en var fra Cell Signaling Technology; antistoff mot p-aktin var fra Sigma. Membranene ble deretter vasket og inkubert i 1 time ved romtemperatur med peroksydase-konjugert sekundært antistoff (Cell Signaling Technology). Proteinbånd ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence som beskrevet av produsenten (GE Healthcare).
siRNA transfeksjon
siRNA målsekvens for beclin-en, nontargeting siRNA (Risc Free) og Dharmafect en var kjøpt fra Dharmacon. Celler ble sådd i 10-cm retter og transfektert med siRNA 24 timer senere i henhold til produsentens protokoll. Den neste dag ble cellene trypsinisert og sådd ut i 6-cm eller 96-brønners plater for å oppnå den samme transfeksjonseffektiviteten. Protein ekspresjonsnivåer ble bestemt ved western blot-analyse.
Transmisjonselektronmikros
Prøvene ble fiksert med en oppløsning inneholdende 3% glutaraldehyd pluss 2% paraformaldehyd i 0,1 M kakodylatbuffer, pH 7,3, i 1 time. Etter fiksering ble prøvene vasket og behandlet med 0.1% Millipore-filtrert cacodylat buffer garvesyre, postfiksert med 1% bufret osmiumtetroksyd i 30 minutter, og beiset en bloc med 1% Millipore-filtrert uranylacetat. Prøvene ble dehydrert i økende konsentrasjoner av etanol, infiltrert og innstøpt i LX-112 medium. Prøvene ble polymerisert i en 70 ° C ovn i 2 dager. Ultratynne snitt ble kuttet i en Leica ULTRACUT mikrotom (Leica, Deerfield, IL), farget med uranylacetat og føre citrate i en Leica EM Stainer, og undersøkt i en JEM 1010 transmisjonselektronmikroskop (JEOL, USA, Inc., Peabody, MA ) ved en akselererende spenning på 80 kV. Digitale bilder ble oppnådd ved hjelp av AMT Imaging System (avansert mikroskopi teknikker Corp, Danvers, MA).
Resultater
Gene uttrykk signatur av magekreft
Tabell 1 viser egenskapene til pasientene fra Yonsei data [17]. Gastric krefttilfeller ble for det meste ligger i distal magen og stadium III /IV. Ved hjelp av genuttrykk microarray data for disse pasientene, fant vi 3,360 tumorspesifikke gener hvis ekspresjon bety intensiteter ble forandret ved hjelp av minst to-ganger sammenlignet med normalt vev bety genekspresjon (
P
0,001, fig S1 ). Dette settet med 3,360 gener (dvs. magekreft spesifikk signatur) ble brukt til videre
i silico
screening for potensielle terapeutiske legemidler for magekreft.
Tilkobling kart analyse identifiserer potensielle narkotika målretting magekreft
For å identifisere potensielle legemidler rettet mot magekreft, ble magekreft spesifikk signatur brukes som innspill søk i Connectivity Kartet som beskrevet i «Method» -delen. Vi så spesielt for forbindelser som hadde en signatur omvendt korrelert med gastrisk cancer-spesifikk signatur og identifisert flere legemidler som er oppsummert i tabell 2. rangeringen av kandidatmidler ble etablert basert på invers korrelasjonsverdi og p-verdi. Tabell 2 (kolonner 2-4) viser høyest rangert forbindelser fra Yonsei data. Tilkobling kart analyse viste at histondeacetylase (HDAC) hemmere, inkludert vorinostat og trichostatin A representerer potensielle kandidater til å målrette magekreft. Den phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor LY294002 den phenothiazine trifluoperazin og heat shock protein hemmer tanespimycin ble også identifisert som kandidat satsingsmidler for magekreft. Deretter validert vi våre funn ved hjelp av et uavhengig sett av genekspresjon profildata fra Stanford Microarray Database (tabell 2, Stanford data, søyler 5-7). Tilkobling kart analyse av dette datasettet bekreftet vorinostat som de beste rangerte kandidaten. I konklusjonen, Tilkobling kart analyse identifisert vorinostat som en potensiell terapeutisk middel for magekreft.
Vorinostat viser terapeutisk effekt
in vitro
i magekreftcellelinjer
Å evaluere den terapeutiske effekten av vorinostat, vurdert vi veksten av etablerte mage kreft cellelinjer (AGS, KATO-III, og NCI-N87) etter 72 h vorinostat behandling ved hjelp av MTT-analyse. Sammenlignet med ubehandlede celler, vorinostat signifikant hemmet cellelevedyktighet på en doseavhengig måte i alle gastrisk cancer-cellelinjer (figur 1A). Vi bekreftet reduksjon i celleviabilitet ved cellesyklusanalyse av AGS og KATO-III kreftceller. Vi viste at behandling med vorinostat (5 uM) i 24 timer induserte en markert økning i sub-G1 andel av AGS-celler sammenlignet med kontrollen (2,3 ± 0,07% vs. 39,2 ± 0,99%, henholdsvis;
P
P
= 0,044), en indikasjon for cellesyklus arrest. Vi testet ytterligere celleviabilitet ved hjelp av PI-eksklusjon. Vi behandlet AGS og KATO-III celler med fem mikrometer vorinostat i 72 timer og vurderes dem ved flowcytometri (figur 1C). Mengden av døde celler, som har lav forover spredning og høy side scatter, var signifikant økt i AGS-celler (12,4 ± 4,3% vs. 79,4 ± 5,7%), og også i KATO-III celler, sammenlignet med kontrollceller (8,7 ± 0,6% vs. 46,8 ± 2,1%). Vi endelig analysert induksjon av apoptose etter vorinostat behandling i AGS og KATO-III magekreft cellelinjer ved hjelp av immunoblot. Vorinostat økt apoptose, som vurdert av caspase-3-spalting, i AGS-celler og til en mindre grad i KATO-III celler (figur 1D).
(A) MTT-analyser ble utført etter inkubasjon av AGS, KATO- III, og NCI-N87 med de indikerte konsentrasjoner av vorinostat i 72 timer. (B) Endring av cellesyklus ved vorinostat ble undersøkt ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse av PI fargede celler ble behandlet med 5 uM vorinostat i 24 timer. (C) Livskraftig test med PI eksklusiv løsning. AGS og KATO-III celler ble behandlet med 5 mikrometer vorinostat i 72 timer og vurderes av FACS. I representant tomt, ble døde celler manifestert som prikker med lav fremover scatter og høy side scatter. (D) Western blot-analyse av aktiv caspase-3 fra AGS og KATO-III magekreftceller uten eller med 5 uM vorinostat behandling. Cellelysater ble analysert på angitte tidspunkter. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. *,
P
0,05. I søylediagrammet, data representerer gjennomsnittet + SD (standardavvik).
I sammendraget, disse dataene indikerer at vorinostat har antiproliferativ effekt på mage kreft cellelinjer ved å indusere apoptose i AGS celler og G2 /M cellesyklus arrest i KATO-III celler.
Globalt genekspresjonsanalyse av magekreft cellelinjer AGS og KATO-III etter vorinostat behandling
for å analysere effekten av vorinostat på global genekspresjon, AGS og KATO-III magekreftceller ble behandlet med 5 mikrometer vorinostat i 48 timer og microarray analyse ble utført. Unsupervised cluster analyse av microarray data etter vorinostat behandling viste at AGS og KATO-III celler gruppert med samme cellelinje uansett å vorinostat behandling (figur 2A). Fordi autofagi har blitt rapportert å ha en rolle i vorinostat-induserte effekter i andre kreft [20], [21], gjennomførte vi overvåket analyse av autophagy relatert gen set (80 gener og 149 prober; Tabell S2). Vorinostat behandlet magekreftcellelinjer ble gruppert sammen (figur 2B), noe som indikerer at induksjon av autophagy er en viktig egenskap av vorinostat i magekreft linjer.
(A) Unsupervised hierarkisk clustering av genuttrykk data fra AGS og KATO III før og etter 5 uM vorinostat behandling i 48 timer. Gener med et ekspresjonsnivå som har minst 2-ganger forskjell i forhold til medianverdi på tvers av cellelinjer i minst 2 matriser ble valgt for hierarkisk clustering analyse (3.646 gen funksjoner). (B) Overvåket hierarkisk clustering med autofagi relaterte gener (149 prober) av AGS og KATO III etter vorinostat behandling.
Hemming av autofagi forbedrer vorinostat effekt i mage kreftceller
Gitt at autophagy kan ha en rolle i både kreftcelleoverlevelse og cancercelledød etter medikamentbehandling [22], [23], vi evaluert bidraget av denne fremgangsmåten for virkningen av vorinostat på mage cancer cellelinjer ytterligere. Vi funksjonelt evaluert denne prosessen ved immunoblotanalyse av autophagy markør mikrotubul-assosiert protein en lettkjede 3 (LC3). Vorinostat-behandlede KATO-III celler, og i mindre grad AGS-celler, viste en klar opphopning av den hurtigere-migrering lipidert form av LC3 (LC3-II) (figur 3A). Opphopning av LC3-II kan skyldes enten oppregulering av autophagosome dannelse eller blokkering av autophagic nedbrytning av LC3-II [24], [25]. Vi analyserte derfor vorinostat-behandlede celler for p62 nedbrytning, en markør for autophagic fluks [24], og vi har observert en reduksjon i p62 protein nivå i vorinostat behandlede celler sammenlignet med den tid passet ubehandlede kreftceller (figur 3A). I tillegg cotreatment av vorinostat med bafilomycin A1 (BafA1), en hemmer av autophagosome-lysosome fusion, ytterligere økt LC3-II akkumulering (figur 3B), kompatibel med vorinostat induserende autophagic fluks snarere enn å blokkere nedbrytende kapasitet på autophagolysomes. Elektronmikroskopi (EM) er en følsom, kvantitativ og definitive metode for påvisning av autofagi [24]. I samsvar med de vestlige blot data, EM-analyse viste at vorinostat markert økt autophagosome formasjon i AGS celler (Figur 4B og B «) sammenlignet med kontrollceller (Figur 4A og A»).
(A) AGS og KATO -III ble behandlet med 5 mikrometer vorinostat for de angitte tidspunkter. Proteinnivåer av LC3 og p62 ble analysert ved immunblotanalyse. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. P62-nivåene ble målt ved densitometrisk analyse av Western blot og i forhold til actin nivåer. P62 nivåer av ubehandlede AGS og KATOIII celler ble betraktet som 1. (B) AGS-celler ble behandlet i 12 timer med 5 uM vorinostat med eller uten 50 nM bafilomycin A1 (BafA1). Cellelysater ble analysert ved immunblotanalyse for LC3 og aktin.
Etter 12 timers behandling DMSO (A, A «) eller med 5 uM vorinostat (B, B») (venstre paneler, lav forstørrelse, skala bar: 2 mikrometer), ble utført EM analyse. Høy forstørrelse bilder av eske områder med Av skildrer autophagic vakuoler (venstre panel, skala bar: 500 nm, N: nucleus, M: mitokondrier).
For å undersøke om opphopning av autophagosomes beskytter cellene mot cellulært stress utløst av vorinostat, hemmet vi autofagi prosessen ved hjelp av den farmakologiske inhibitor klorokin og små interfererende RNA (siRNA) mot beclin-en. Tilsetning av klorokin til vorinostat behandlede AGS og KATO-III celler resulterte i en doseavhengig reduksjon i levedyktighet (figur 5A). Reduksjonen i levedyktigheten ble bekreftet i KATO-III celler behandlet med beclin-1 siRNA (figur 5B). Sammen tyder dataene på at inhibering av vorinostat-indusert autofagi kan forbedre effektiviteten ved vorinostat behandling av gastrisk kreft celler.
(A) AGS og KATO-III celler ble behandlet med 5 uM vorinostat og forskjellige konsentrasjoner av klorokin (CQ). Celleviabilitet ble vurdert etter 12 timer ved hjelp av krystallfiolett farging og kontroll (Ctr) ble satt til 100%. (B) KATO-III celler ble transfektert med siRNA mot Beclin 1 (siBeclin1) eller med ikke-måls Risc Gratis siRNA eller behandlet med Dharmafect jeg alene (mock). siRNA effektivitet ble bekreftet ved western blot-analyse av Beclin 1 og Risc Fri som en kontroll. α-tubulin ble anvendt for å vise like lasting av proteiner. Levedyktighet ble målt etter 12 timer vorinostat behandling ved hjelp av krystallfiolett farging. Livskraftig av ubehandlet kontroll (CTR) celler ble satt som 100%. *,
P
. 0,05
Vorinostat endrer gen signatur i menneskelige mage kreftceller
For å forstå effektene av vorinostat på genuttrykk i magekreftcelle linjer, gjennomførte vi microarray analyse av vorinostat behandlet AGS og KATO-III magekreftcellelinjer (fig. 2). Vår analyse viste signifikante genomiske forskjeller mellom ubehandlede og vorinostat behandlet mage kreftceller (AGS og KATO-III). Etter vorinostat behandling, ble ekspresjonen av gener 1014 økes og ekspresjon av gener 760 ble redusert i AGS cellelinje. I KATO-III cellelinje, 164 gener var oppe og 191 gener ble nedregulert (to-fold forskjell;
P
0,001). Vorinostat endret vesentlig uttrykket av 140 gener i både AGS og KATO-III cellelinjer (vorinostat bestemt gen signatur). Genene som ble mest endret etter vorinostat behandling ble identifisert som
SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PRPH, NEU1, TXNIP, CCK plakater ( 4-fold up -regulation) og
MUC1, IFITM1, ANKRD37 plakater ( . 4 ganger nedregulering)
Deretter beregnet vi identifisere biomarkører kandidater som kan spå vorinostat følsomhet av menneskelige mage kreftpasienter . Derfor, i kombinasjon vi settet av endrede gener i vorinostat behandlet gastrisk cancer-cellelinjer (vorinostat spesifikt gen signatur), og de to humane magecancer signaturer som genereres fra Yosei og Stanford data ved hjelp av Venn-diagram analyse. Vi har funnet at de relative ekspresjonsnivå av 12 gener ble reversert ved vorinostat behandling (figur 6). Av disse 12 genene, 7 gener sterkt uttrykt i mage kreft vev ble nedregulert (
ITGB5
,
TYMS
,
MYB
,
APOC1
,
CBX5
,
PLA2G2A
,
KIF20A
) og 5 lavt uttrykte gener ble oppregulert etter vorinostat behandling (
SCGB2A1
,
TCN1
,
CFD
,
APLP1
,
NQO1 product: (Tabell 3).
Venn Diagram av gener som er valgt av univariate test (to-utvalg t-test) gener ble valgt for p .. 0.001 mellom sammenlignet gruppene Den røde sirkelen (genet liste A) representerer magekreft spesifikke gener fra Yonsei data Den blå sirkelen (genet liste B) representerer magekreft spesifikke gener fra Stanford data.. den gule sirkelen (genet liste C) representerer vorinostat bestemt gen signatur fra begge AGS og KATO-III cellelinjer (
P
0,001, 2 ganger endring).
diskusjon
Våre resultater tyder på at en global menneskelig magekreft gen signatur kan være nyttig for å finne terapeutiske midler som heller rettet mot genomisk underskrift av magekreft i stedet for å målrette en eller to spesifikke gener. Ved hjelp av Tilkobling kart, fant vi ut at HDAC hemmere, som vorinostat og trichostatin A, hadde en omvendt korrelert gen signatur i forhold til magekreft bestemt gen signatur og kan derfor føre terapeutiske kandidater for magekreft.
In vitro
evaluering av den terapeutiske effekten av vorinostat avdekket at denne terapeutisk legemiddel undertrykte veksten av ulike magekreft cellelinjer. Ved siden av sine antiproliferative effekter, vorinostat også oppregulert autofagi-spesifikke gener. Inhibering av vorinostat-indusert autophagy resulterte i en ytterligere reduksjon av levedyktighet. Videre kombinert analyse av magekreft cellelinjer som behandles med vorinostat og prøver av magekreftpasienter viste at vorinostat forandret uttrykket nivåer av et sett av tolv magekreft spesifikke gener.
Våre funn viste at HDAC hemmere, vorinostat og trichostatin A, var de beste terapeutiske kandidater for magekreft, som er enig med konseptet som HDAC er overuttrykt i mage kreft vev [26]. HDAC-inhibitorer har blitt vist å øke acetylering av histoner, derfor påvirker genekspresjon. Disse hemmere manifest kreft effekter ved å fremkalle den indre og ytre apoptose vei [27], [28], blokkerer tumor angiogenese [29], og hemme intracellulære stressrespons trasé [30]. Fordi HDAC hemmere har globale effekter på genuttrykk, kan de påvirke ennå unrevealed cellulære prosesser [31], [32]. I kliniske settinger, har HDAC hemmere vært mest brukt til hematologisk kreftsykdom, men kliniske studier med solide tumorer er pågående. En fersk undersøkelse, som støtter vår
in vitro
funnene viste terapeutisk effekt av HDAC hemmere på menneskelige magekreft prøver å bruke histoculture medikamentrespons analyse [33]. Imidlertid er det fortsatt å være unrevealed om spesifikke molekylære definerte undergruppene kan forutsi respons eller motstand mot HDAC hemmere.
