Abstract
Hyaluronan bundet protein 1 (HAPLN1) som har vist seg å være sterkt uttrykt i ondartet pleural mesotheliomas (MPM), ble påvist i serum ved bruk av en elektrokjemisk overflate-pregemetode. Først ble deteksjonsfremgangsmåten optimaliseres ved bruk av bovint serumalbumin (BSA) som en modell protein for å etterligne de optimale betingelser som kreves for å prege den tilsvarende molekylvekt protein HAPLN1. BSA ble trykt på gull elektroden med hydroksyl avsluttet alkanthioler, som dannet en selv-montert monolayer (SAM) rundt BSA. Analytten (BSA) ble deretter vasket bort og dens avtrykk (tom hulrom med form-hukommelse) ble anvendt for påvisning av BSA i en oppløsning, ved bruk av elektrokjemisk åpen-krets potensiell metode, nemlig potensiometri. Faktorer som anses for å optimalisere betingelsene omfatter inkubasjonstid, proteinkonsentrasjon, deteksjonsgrense og størrelse av elektrode. Matrise assistert laserdesorpsjon ionisering-flukttid massespektrometri (MALDI-TOF MS) ble benyttet for å bekrefte selektiviteten av avtrykk. Med de oppnådde imprinting styringsparametere, ble HAPLN1 trykt i to eksemplarer og påvisning av piggete HAPLN1 ble vellykket gjennomført i serum
Citation. Mathur A, Blais S, Goparaju CMV, Neubert T, Pass H, Levon K ( 2013) Utvikling av en Biosensor for deteksjon av Pleural Mesothelioma Cancer Biomarker Bruke Surface Imprinting. PLoS ONE 8 (3): e57681. doi: 10,1371 /journal.pone.0057681
Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA
mottatt: Mai 10, 2012; Godkjent: 28 januar 2013; Publisert: 13 mars 2013
Copyright: © 2013 Mathur et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien har vært finansiert av en hær stipend (W911NF-09-1-0499) for Potentiomeric påvisning av patogener. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En mulig kur for kreft ville være mer sannsynlig hvis sykdommen kan oppdages tidlig for å optimalisere den terapeutiske prosedyrer. Ekstracellulære matriks (ECM) har sin betydning ikke bare for den fysiske støtte av forskjellige celler, men også i celle-celleinteraksjoner, cellesignalisering og cellereparasjonsprosesser. Derfor ECM proteiner i seg selv utgjøre en potensiell overvåking mål som gjenspeiler den pågående endringene. Hvis endringene forekomme på grunn av tilstedeværelsen av en sykdom slik som kreft, vil påvisning av disse endringene være en presumptiv avsløring av kreft før noen symptomer. Som et eksempel, heparanase enzym [1], er en endo-ß-glucoronidase, er et multifunksjonelt enzym som påvirker viktige trinn i utviklingen av en rekke typer av kreftformer slik som gastrisk [2], ikke-liten lunge [3], øsofageal [4] , hode og nakke [5], bryst [6] og bukspyttkjertel [7] kreftformer som eksempler.
heparanase kløyver enzymatisk heparin sulfat og med serinproteinaser og metalloproteinaser spiller en avgjørende rolle i den ekstracellulære matrise ombygging forbundet både med in situ tumorer vekst og den metastatis messige invasjon av kreftceller. Den enzymatisk inaktiv form av heparanase har vist seg å påvirke cellesignalisering, og dermed øke cancer vekst med oppregulering av flere gener uttrykk [8]. Kommersielle biomarkører for overvåking av asbest-indusert mesothelioma aktivitet er mesothelin og løselig mesothelin relatert peptid (SMRP). Osteopontin (OPN) og CA125 Tilsvarende har de vært knyttet til kreft-linked heparanase aktivitet i tillegg til hyaluronan, TRA og ferritin. De ECM ombygging hendelser kan sikkert være et mål for diagnostisering av de tidlige stadier av kreft invasjon [9] samt mål for anti-kreft behandlinger. Hyaluronsyre (hyaluronan, hyaluronat, HA) er en lineær, meget høy molekylvekt glykosaminoglykan, er en av de mest tallrike ECM-proteiner. HA har vist seg å eksistere i høye nivåer i kolorektal, epitelovarialcancer og bryst kreft [10] – [12] og også tumorvekst-inhibering er blitt dokumentert når HA bindingsmotiver har blitt påvirket [13]. HA overekspresjon er i stor grad avhengig av CD44, slik at regulering av blærekreft vekst, invasjon og angiogenese ble påvist å forekomme gjennom CD44 ved HA-syntase-1-ekspresjon [14]. Som HA ekspresjon synes å være tydelig forhøyet ved forekomsten av kreft er det ikke overraskende at Ivanova et al har vist at også HAPLN1 protein, noe som bidrar til å linke proteoglykaner til et HA kjerne, er blitt vist å være forhøyet i kreftceller.
Ondartet pleural mesothelioma er en sjelden kreft forårsaket av eksponering for asbest, som har en dårlig prognose. Brusk kobling protein HAPLN1 blir studert som en kandidat biomarkør, funnet å være overuttrykt i mesothelioma trinn 1 sammen med et sterkt uttrykt kreft biomarkør osteopontin (OPN1) som befinner seg i det samme gen set [15]. Immunoanalyser er vanligvis brukes for påvisning av kreft biomarkører som de viser overlegen selektivitet, men kan være tidkrevende og kostbart. De biologiske funksjoner av markører som heparanase understreke viktigheten av å utforme kostnadseffektive metoder som lar tidlig påvisning av slike biomarkører i serum og vev både for diagnostiske og prognostiske formål samt for overvåking kreftbehandling.
Også påvisning av meget lav konsentrasjon av slike biomarkører med ELISA tester er vanskelig. Det er derfor et stort behov for utvikling av ny teknologi, som er rask og veldig følsom å detektere lave konsentrasjoner av biomarkører. Tidlig diagnose vil gi mer tid for behandling av kreft, noe som er avgjørende for å redde et liv. Molekylære trykt polymerer blir vurdert som en passende erstatning for antistoffbaserte systemer som biosensorer, på grunn av bedre stabilitet og gjenbruk av bio-anerkjennelse overflater [16]. Biosensorer er sammensatt av to komponenter, bio-reseptor element og signaltransduksjon komponent. En bio-reseptor overflate laget med molekylære trykt polymerer ville være to størrelsesordener billigere deretter antistoffer. Som prisen på hydroksylerte alkantiol polymer ville koste ca $ 0,2-0,6 mg
-1 forhold til antistoffer, som varierer avhengig av målet. Antistoffer som genereres for målretting menneskelig HAPLN1 protein ville koste ca $ 900 $ 1000 mg
1. Selv med lav tetthet av slike antistoffer på immunoaffinitetskolonnerensing kassetter har høyere pris enn molekylære trykt polymerer, koster mellom $ 10 til $ 100 mg-en. Høye prisen på HAPLN1 antistoffer øke kostnadene for HAPLN1 ELISA-sett kommersielt tilgjengelige til $ 10 /test. Mens en trykt gull belagt sensorbrikken (1 cm x 1 cm) ville koste ca $ 1.2 /test og kan brukes flere ganger for flere analyser i motsetning til antistoffer, som ikke kan gjenbrukes.
I vår studie har vi som mål å utvikle et verktøy for tidlig deteksjon av biomarkører. Målet proteinmolekyler co-adsorberes på overflaten av gullelektroden med tiolene og de sammen danner et godt pakket monolaget. Fjerning av proteinmolekylene fra SAM-skjema avtrykks hulrom og den funksjonelle hydroksylgruppe hode gruppe av tiolene gir spesifisitet til hulrommet. Komplementaritet i størrelse, form og hydrofobisitet gir affinitet mot det samme molekyl, som er blitt trykt.
påtrykt elektroden blir så brukt til å analysere malen i bufferen ved hjelp av potensiometri. Som det ladede proteinmolekylet i buffer binder seg til hulrommene den forandrer potensialet av følerelektrode. Syntese av forlaget overflate er enkel og krever ingen kostbar teknologi for fremstilling. Det er en gammel, men lovende teknologi, som har utviklet med de utfordringer det har møtt i det siste.
I 1930 en sovjetisk vitenskapsmann MV Polyakov vist at silikagel fremstilt i nærvær av et oppløsningsmiddel additiv viste foretrukne bindende til det samme løsningsmiddel [17]. Linus Pauling og Frank Dickey publisert i 1949 at silika viser spesifisitet for fargestoffer trykt på overflaten [18]. Major gjennombrudd i molekylær imprinting fant sted i 1972 da Gunter Wulff forberedt molekylære trykt organiske polymerer ved hjelp av kovalente binding tilnærming, som kan skille mellom enantiomerer av glyserinsyre [19]. Wulff et al. brukt en tilnærming, som ble mest kjent for molekylær imprinting studier i løpet av 70-tallet til en annen teori ble introdusert i 1981 av Mosbach og kolleger. De skapte molekylære avtrykk basert på ikke-kovalent binding med malen [20]. Det var enkelheten i denne tilnærmingen som utløste en eksplosjon i 90-årene med molekylære imprinting polymerer. Vi har benyttet ikke-kovalent binding tilnærming innføres ved Wulff et al. stempel HAPLN1 biomarkør ved hjelp av funksjonelle hydroksylgrupper på tiol som danner svake interaksjoner med protein og en godt utstyrt mold rundt det samme. Dette gir mer spesifisitet til hulrommet, og dermed gjøre fjerningen av HAPLN1 fra hulrommet enklere. Forlaget Betingelsene ble optimalisert for potensiometri ved bruk av BSA (66 kDa) protein (figur 1), på grunn av sin likhet i størrelse med HAPLN1 kreft biomarkør (65 kDa). Vi testet spesifisiteten av trykt hulrom, ved hjelp av MALDI-TOF, ved å utføre tester for å vise at en forholdsvis mindre protein Myoglobin (17 kDa) ikke binder seg til BSA forlag.
(A-C) Innsetting av protein i SAM. (D) Wash. (E-F) Binding av BSA analytten protein, hemoglobin som en ikke-spesifikk kontroll.
Materialer og metoder
Prinsipp for potensiometrisk deteksjon
i vår teknologi, har vi brukt potensiometri for påvisning av target analytt HAPLN1. Et potensiometer måler potensialforskjellen mellom en referanse-elektrode (Ag /AgCl) og arbeidselektroden. Analytten bindes til bioreceptor overflate på arbeidselektrode i en bufferløsning, som resulterer i en endring i potensialforskjell mellom de to elektroder. Denne endringen blir så målt av systemet. Mindre biomacromolecular ioner ikke fører til en spenning som de forblir i likevekt med elektrolytten.
De sterke spenningen respons resultatene fra macroions bindende via omfattende makromolekylære hydrogenbinding rundt forlaget på arbeidselektrode (gull belagt silisium chip ), en stor biomacromolecule rekombinant HAPLN1, setter sammen 65 kDa-protein med størrelse tioler, som danner en organisert, tett SAM rundt analytten. Tioler har tendens til å selv montere på gulloverflaten som svovelgruppen på bakparten av tioler danner en svovel-metallbindingen med gull [21]. Organisert SAM er en viktig «tetningsmasse «mot interferrents og nålehull for parasittiske strøm. Makromolekylet blir deretter vasket fra overflaten, noe som resulterer i dannelse av hulrom. Den trykt elektroden fungerer som bioreceptor element av biosensoren. Således påtrykt elektroden arbeider med samme prinsippene som kommersielt ioneselektive elektroder, som har en spesifikk ionofor til å gjenkjenne analytten ion. Vi viser at potensiometri kan brukes med god følsomhet og selektivitet for å påvise mål-kreft biomarkør i bufferoppløsning, og i piggete serum. Oppnådd med denne teknikken elektrokjemiske reaksjon er på grunn av potensialet forandring etter binding av malen proteinet. Endringen i potensialet blir målt i forhold til en referanse Ag /AgCl-elektrode [22], [23].
Materialer som kreves for elektrokjemisk måling
bovin serum albumin (BSA) fra bovint blod ( Mv = 66,3 K), myoglobin fra equine skjelettmuskel (Mw = 17,6 K), 11-merkapto-1-undekanol (97%) (tiol), absolutt etanol, metanol, isopropanol og ble innkjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Menneskelig HAPLN1 (64.68 kDa) full-lengde ORF (AAH57808, 1-354 A.A.) rekombinant protein med GST-tag ved N-terminal ble kjøpt fra Abnova Corporation (Walnut, California) og lagret ved -80 ° C. Alle proteiner og kjemikalier ble anvendt som mottatt. To typer elektroder ble brukt som sensing elektrode: gull (50 nm) frese belagt silisium wafer (1 cm x 2 cm) og gullelektroder (2 mm
2) kjøpt fra Basi (West Lafayette, IN). Den potensiometriske målinger ble tatt opp i 10 ml 1 x PBS i 20 mL hetteglass, som er utstyrt med en magnetrører. Når fortynnet til en konsentrasjon 1X, 10 X fosfat-bufret saltvannsløsning fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO), hvilket ga en fosfatbufferkonsentrasjon på 0,01 M og en natriumklorid-konsentrasjon på 0,154 M med pH 7,4. De to-elektrodesystem besto av en Ag /AgCl som referanseelektroden og silikonbelagt gull chip gull elektroden som arbeidselektrode. Potensialene av arbeidselektrode mot referanseelektrode ble målt med en Accumet AR15 potensiometer kjøpt fra Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) og EMF 16 kanaler Elektro Interface kjøpt fra Lawson Labs (Malverin, PA)
Materialer som kreves for MALDI TOF
Gold sikteplate ble kjøpt fra Bruker Daltonics (Rica, MA). TA-oppløsning (0,1% trifluoreddiksyre /acetonitril, 02:01, vol:vol) og Sinapinic syre ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) for matrisen forberedelse for å immobilisere proteinbundet på overflaten av skyteskiven . Bruker Autoflex MALDI-TOF kjøpt fra Bruker Daltonics (Billerica, MA) ble anvendt for å bestemme spesifisiteten av proteinbinding til respektive avtrykk på overflaten av skyteskiven. Kjemisk resistent formbar PTFE (Teflon) Tape ble kjøpt fra CS Hyde selskap (Lake Villa, IL). Nitrogengass ble levert av Presto-O-Sales and Services (LIC, New York).
BSA Sensor Fabrication
De silisiumbrikker ble renset ved ultralydbehandling i de-ionisert vann, metanol og isopropanol. Silisium chips ble tillatt å tørke over natten, og deretter frese belagt med gull. De gullbelagt Flisen ble deretter vasket med deionisert vann og tørket med ren nitrogengass. Tilsvargullelektroder ble renset med 0,1 og 0,05 mikron aluminiumoksyd og deretter ultralydbehandlet med de-ionisert vann for å fjerne eventuelle bundede aluminapartikler. Siden proteinene denatureres i ikke-vandig løsning og tioler viser dårlig løselighet i vandige løsnings Proteinene ble løst opp i de-ionisert vann, mens tioler ble oppløst i absolutt etanol. At det går blandede løsninger av 19:01 og 18:02 (water: etanol) med endelig tiol konsentrasjon på 0,1 mm og 0,2 mm ble utarbeidet i rene glassbeholdere og forhold studert for å oppnå god oppløselighet av tioler og unngå protein nedbør. Gullet belagte elektrode blir så dyppet inne i den blandede løsning for å danne den sammensatte selv monolag av protein og tiol. Topprommet av beholderen er fylt med inert nitrogengass og dekket med parafilm. Inkubasjonstid av brikken i den blandede oppløsningen ble variert for en bedre trykt overflate. Gullet brikken blir deretter grundig skyllet med deionisert vann for å fjerne det bundne protein. Også forskjellige proteinkonsentrasjon på 30 ug /ml, 10 ng /ml og 1 ng /ml ble brukt til å danne avtrykk og bindings resultatene ble sammenlignet. Elektrodene utarbeidet ble så brukt til å sjekke binding respons med variable BSA konsentrasjoner i bufferløsning.
Utarbeidelse av forlagene på MALDI-TOF sikteplate
Bortsett fra overflaten inneholder 384 brønner, resten av gull sikteplate (8 cmx12.5 cm) ble dekket med reaktivt Teflon tape. Gullet måloverflaten ble renset med etanol og de-ionisert vann. Styrt strøm av inert nitrogengass ble brukt til å tørke måloverflaten. Løsning A ble fremstilt med en 19:01 blanding av 16,17 mg Myoglobin (dvs. 1,7 pM) i 540 ml deionisert vann og 0,22 g 11-merkapto-1-undekanol (dvs. 2 mM) i 540 ml absolutt etanol. Denne oppløsning ble dannet for å skape myoglobin avtrykk på den ene halvdelen av gull sikteplate. Løsning B inneholdt 19:01 forholdet blanding (water: etanol) av 16,17 g bovint serumalbumin (dvs. 0,432 uM) ble oppløst i 540 ml deionisert vann og 0,22 g 11 mercapto1-undekanol (dvs. 2 mM) i 540 ml absolutt etanol. Denne løsningen ble fremstilt for å lage BSA avtrykk på den andre halvparten av gull sikteplate. Halvparten av Au platen ble neddykket i oppløsning A i 12 timer til co-absorbere proteinet og tiol, hvoretter den ble tørket med ren nitrogengass. Tilsvarende den andre halvparten av gull måleplaten er nedsenket i oppløsning B i 12 timer og tørket med ren nitrogengass. Protein og tiol-konsentrasjoner ble holdt samme som benyttet for innprenting på gullelektroden for potensiometri. Hulrom som er komplementære med templatet proteinene ble skapt i den monolaget ved å fjerne proteinmolekylene gjennom repeterende skylling med deionisert vann. Oppløsning C ble fremstilt med en ekvimolar blanding av 1 ng /ml BSA og myoglobin i 540 ml avionisert vann. Denne oppløsning ble dannet for å assay-protein å binde seg til to forskjellige typer av hulrom på gull sikteplate overflate. Brønner på målet overflaten ble delt inn i fire kvadranter (figur 2) og brønner i rad I (1-24) til P (1-24) ble dyppet i 10-15 minutter i løsning C. Overflaten ble skylt forsiktig og lov til å tørke ved hjelp av nitrogengass. Deretter ble 1 ul SA matrise tilsettes til målet og fikk tørke. Vel i rad A (1-24) til H (1-24) ble brukt til kontrollstudier. Målet Platen ble deretter brukt for MALDI- TOF analyse.
Kolonner (1-12) for myoglobin og kolonner (13-24) for BSA imprinting nettsteder. Rader I til P ble nedsenket i analytten løsning C som inneholder både analyse proteiner.
HAPLN1 Sensor Fabrication
HAPLN1 protein er over uttrykt i de fleste mesotheliomas og dermed blir vurdert som en potensiell biomarkør for kreft gjenkjenning. I en ren glassbeholder 20 ug HAPLN1 (64,68 kDa) protein ble oppløst i 10 ml deionisert vann (dvs. 0,03 uM) og 4 mg 11-merkapto-1-undekanol ble oppløst i 10 ml etanol (dvs. 0,1 mM) . En blandet løsning blir dannet ved oppløsning av begge løsningene i forholdet 19:01 (water: etanol), slik at sluttkonsentrasjonen av tiol i løsningen blir 0,1 mM. Tre gull-elektroder A, B og C ble dyppet i løsningen i 12 timer og deretter elektrodene ble skyllet grundig med deionisert vann for å fjerne bundet protein på overflaten.
Sensor respons på HAPLN1 tilsatt serumprøver
HAPLN1-påtrykt elektrodene ble også anvendt for potensiometrisk respons til kreft biomarkør tilsatt i serum. Den 100 nM forrådsløsning på 01:08 serum og buffer-forholdet ble fremstilt ved å fortynne 100 pl humant serum med 650 ul av 1 x PBS-oppløsning og med 250 ul av den kommersielle 102 mikrogram /ml HAPLN1 oppløsning (dvs. en total på 25,5 ug HAPLN1). Den HAPLN1 Konsentrasjonen i stamløsningen ble deretter 6,5 ug /ml (100 nM). 10 pl av oppløsningen ble anvendt til titrering i 10 ml PBS-buffer, og den høyeste konsentrasjonen av protein er 10
-9 M. Gjenværende standarder ble fremstilt ved å opprettholde den samme fortynningshastigheten (01:08) av serum i buffer men analytt konsentrasjonen ble redusert ti ganger med serie en 6,5 mikrogram /ml (100 nm) standard piggete løsning.
Resultater
optimalisering av parametere for BSA Sensor
BSA proteinmolekyler var trykt med hydroksyl-ende alkanthioler på gulloverflaten. Ettersom tioler danner en organisert monolag med tid på gulloverflate var det viktig å studere inkubasjonstiden av gullbelagt silisiumbrikke inne protein-tiol-løsning for å oppnå stabile forlag. I dette forsøket ble BSA-konsentrasjonen i den blandede oppløsningen var 30 ug /ml og figur 3a viser virkningen av inkubasjonstid på stabiliteten av avtrykkene. Tre elektroder ble fremstilt ved å holde flisen inne i løsning i 2, 6 og 12 timer. Den blandede oppløsningen i dette forsøk hadde et forhold på 18:02 (water: etanol) med 0,2 mM 11 mercapto1-undekanol. Alle målinger ble utført i fosfatbuffer saltvann (pH 7,4) i en 10 ml oppløsning. En logaritmisk økning i potensialet ble observert med økende konsentrasjon BSA i buffer bare med elektroden, som ble inkubert i opp til 12 timer. Resultatene indikerte at mer stabile avtrykk ble dannet når brikken ble holdt i oppløsningen i 12 timer. Eksperimenter ble så utført for å optimalisere forholdene for å oppnå stabile protein forlag. Den potensiometriske reaksjon ble undersøkt ved å variere konsentrasjonen av BSA trykt på elektroden for å danne hulrommene. I dette eksperimentet ble to elektroder ble fremstilt under anvendelse av to forskjellige konsentrasjoner av 30 ug /ml og 1 ng /ml BSA i blandede løsninger av protein og tiol.
A. Effekt av nedsenking tid på 2 timer (___), 6 timer (…) og 12 timer (—). B. Effekt av proteinkonsentrasjon på 30 ug /ml (▴, x) og 2 ng /mL (◊, △). C. Effekt av proteinkonsentrasjon på 10 ng /ml (□) og 1 ng /mL (▴) og kontrollene SAM bare (x, ◊).
Disse blandede oppløsninger ble fremstilt med en 19 :1 ratio (water: etanol) med en endelig konsentrasjon på 0,1 mM 11-merkapto-1-undekanol. Inkubasjonstiden ble holdt på 12 timer, da det ble vist å understøtte dannelsen av de mest stabile forlag.
Som vist i figur 3b, en logaritmisk økning av endringen i potensial foregår med økning i proteinkonsentrasjonen . Responsen av elektroden fremstilt med 30 pg /ml proteinkonsentrasjon prege er mye høyere sammenlignet med den andre elektrode fremstilt med en lavere proteinkonsentrasjon prege. Dette viser at antall hulrom som dannes på overflaten øker etter hvert som mer protein er adsorbert på overflaten. Det isoelektriske punkt for et protein er definert som den pH ved hvilken nettoladning på et proteiner overflate er null. Siden BSA-molekyler har et isoelektrisk punkt på 4,7 at de har en netto negativ ladning i en bufferoppløsning med pH 7,4. Som mer ladede molekyler bindes til elektrodeoverflaten det fører til en drastisk endring i potensial. Resultatene ble med hell gjentatt for bekreftelse. Figur 3b viser også et høyere potensial forandring med en 19:01 (water: etanol) forhold sammenlignet med et 18:02 forhold fra figur 3a. Dette resultatet indikerer at flere hulrom er formet som tiol-konsentrasjonen i oppløsningen reduseres. For å nedskalere prosessen og fremstille flere følsomme elektroder, lave imprinting konsentrasjoner på 1 ng /ml og 10 ng /ml ble valgt basert på tidligere forsøksdata. Eksperimenter ble utført med gullelektroden av mye mindre overflateareal (2 mm
2). Arbeidselektroden ble fremstilt i en 19:01 (water: etanol) forhold med en endelig konsentrasjon på 0,1 mM 11-merkapto-1-undekanol. Som vist i figur 3c elektroden viser en god binding respons på 15-20 mV med meget lave konsentrasjoner av BSA i forhold til en lav bindings respons på 2-4 mV observert med preparerte kontroll elektroder som bare har SAM på deres overflate.
Validation ved hjelp av MALDI-TOF
i dette eksperimentet ble 1 pl av matrisen ble plassert på toppen av hver brønn av trykt MALDI plate og fikk tørke. MALDI plate analyse programvare med en algoritme for å samle inn data med en skanning hastighet på 2000 laser skudd /s for hvert sted i en brønn ble valgt. Siden halvparten av 384 brønner på MALDI plate ble merket BSA og den andre halvparten med myoglobin-protein, ble tilfeldig fem brønner valgt fra myoglobin påtrykt brønner og tilsvarende fem ble valgt fra BSA trykt brønner, å analysere proteinet bundet til hulrommene. Som vist i figur 4, er tre-tegns symbol m /z i x-aksen som brukes i massespektroskopi for å betegne dimensjonsløs størrelse, dannet ved å dividere massen av et ion i enhetlig atommasseenhet av sin ladning nummer.
A. Myoglobin trykt brønner og B. BSA påtrykt brønner.
Y-aksen viser signalintensiteten, men i stedet for å bruke tellinger per sekund (eps), er det vanlig prosedyre å relatere intensiteten til relative overflod med en bruk hvis en intern standard. Som vist i figur 4a myoglobin som har en molekylvekt på 17 kDa ble observert å være bundet til bare myoglobin trykt brønner som en topp vises ved 17 kDa for hver brønn, og ingen myoglobin ble observert i BSA-hulrom som vist i figur 4b. BSA ble observert å være av for stor molekylvekt under disse ionizations forhold.
HAPLN1 Sensor
Etter at BSA studier for å optimalisere de vilkår som kreves for imprinting biomacromolecules, trykt HAPLN1 elektroder ble fabrikkert for lav konsentrasjon påvisning av biomarkør. Tre trykt elektroder ble undersøkt for å bekrefte responsen etter deteksjon. To uavhengige eksperimenter viser en drastisk 25 mV endring i potensialet ved svært lave konsentrasjoner av HAPLN1 10
-12 M som HAPLN1 ble titrert inn i bufferoppløsning (figur 5a). Som en kontroll, ble også titrert BSA under de samme betingelser viser en meget lav potensiell reaksjon ved høye BSA-konsentrasjoner. Forsøket ble deretter utført i serum med en piggete HAPLN1 konsentrasjon. Figur 5b viser at trykt elektroden har en høy drift i serum, men viser en bemerkelsesverdig potensiell endring på 10
-9 M konsentrasjon av HAPLN1 i serum.
A. HAPLN1 binding til HAPLN1 forlagene (to uavhengige eksperimenter), kontroll BSA respons på HAPNL1 forlag. B. Spiked HAPLN1 analytt serum løsning HAPLN1 forlag.
Diskusjoner
påvisning av kreft biomarkører med en lav pris og enkel å bruke metoden er viktig for kontinuerlig overvåking av flere markører. HAPLN1 er et eksempel av økende betydning i felt som for eksempel Nelson et al [24] har nylig utført en transkriptomet analyse på blod vaskulær (BEC) og lymfatiske endotelceller (LEC) og det klyngeanalysen viste tydelig differensial genuttrykk av Wien og LMUene . HAPLN1 ble nest høyeste uttrykt gen i LMU og som svulster ta nytte av disse metastatiske potensielle forsterkende molekyler kan observeres høy HAPLN1 uttrykk føre til nye terapeutiske behandlinger for metastasering av kreft til lymfeknuter. To-dimensjonal molekylær imprinting teknologi har blitt brukt til å innprente og oppdage små molekyler [25] – [29] som peptider, men imprinting makromolekyler forble en utfordrende oppgave. Biologiske makromolekyler som proteiner har høy molekylvekt og derfor sin store størrelse hindrer adsorpsjon på overflaten og fjerning fra ferdig avtrykk [30] – [33]
Det store antall bindingssteder og funksjonell. grupper på proteinet overflaten kan øke problemer knyttet til ikke-spesifikk binding med molekylært trykt proteiner (MIPS) som fører til dårlig selektivitet [34]. Derfor er det viktig å optimalisere alle de nødvendige parametere og betingelser for å opprettholde stabiliteten av slike store konstruksjoner gjennom hele prosessen med pregning. Vi valgte BSA protein (65 kDa) for optimalisering av prosessen på grunn av sin tilsvarende størrelse til kreft biomarkør kandidat HAPLN1. På figur 3a og figur 3b mer stabile avtrykk er dannet med 12 timers inkubasjonstid og en økning i respons oppstår når flere målmolekyler er trykt på 30 ug /ml sammenlignet med 1 ng /ml konsentrasjon. Lignende forhold ble brukt av Wang et al [35] for å vise hvordan avtrykk dannet med forskjellig størrelse proteiner er meget spesifikke for deres respektive avtrykk elektrode ved hjelp av potensiometrisk deteksjon. MALDI TOF teknikken har blitt brukt som en ny fremgangsmåte i vårt arbeid for å bekrefte spesifisiteten på forlaget området, også vist ved potensiometrisk deteksjon. Figur 4 viser myoglobin proteiner binde spesifikt til sine trykt hulrom og ikke til BSA hulrom. Vi tror at siden myoglobin proteiner er mye mindre i størrelse (17 kDa) i forhold til BSA, ville myoglobin ikke passe i BSA formen og følgelig ikke å binde seg til større BSA hulrom. Resultater av BSA spesifisitet kunne ikke bekreftes med MALDI-TOF grunn av den dårlige følsomhet av utstyret mot proteinene av høymolekylvekt. Vi har brukt potensiometrisk deteksjon for optimalisering av hulrom med BSA og for påvisning av HAPLN1 i buffer og piggete serum. Resultatene i Figur 5a viser 25 mV reaksjon av HAPLN1 til HAPLN1 trykt elektrode sammenlignet med lav respons ved BSA protein i buffer og lignende resultater ble oppnådd i piggete serum. Selv om vi viser den oppnådde potensiometriske responsen er spesifikke for proteinet trykt og er et resultat av proteinbinding, er en klar forståelse for tiden mangler for den elektrokjemiske signalet (potensiell endring) indusert av protein adsorpsjon. Flere mekanismer har blitt foreslått blant annet av Thompson et al. Han foreslår faktorer som kan bidra til å endre seg i arbeidsfunksjon [36] av gull når proteinet binder seg til gulloverflate og således viser hvordan endring i arbeidsfunksjon resulterer i forandring av overflatepotensial. I fremtidige eksperimenter planlegger vi å sjekke spesifisitet HAPLN1 proteinbinding til forlaget hulrom ved overflate plasma resonans teknologi (SPR), og også videre for å få kliniske data for validering.
Konklusjoner
Våre data viser bruk av SAM danner vannløselige hydroksylerte alkanethiols å innprente biomacromolecules. BSA ble vist å være en effektiv modell protein for å optimalisere styreparametere slik som proteinkonsentrasjon, forhold av de molekylære komponenter, og inkubasjonstiden av brikken for å nedskalere prosessen med prege for påvisning av lave konsentrasjoner av proteiner. Molecular Imprinting basert biosensor ble vellykket bygget for å gjenkjenne ondartet pleural mesothelioma kreft biomarkør HAPLN1 og demonstrert høy følsomhet ved å detektere lave konsentrasjoner av biomarkør i serum /bufferløsning. Sensoren viste en deteksjonsgrense på picomolar konsentrasjoner med en responstid på 2-5 minutter. Den lave kostnaden for sensoren er basert på mangelen av dyre monoklonale antistoffer, ytterligere merking molekyler og på enkelhet av den åpne krets potensialmåling med et potensiometer, som også er meget enkelt å bruke (i likhet med pH-meter).
