Abstract
Det er vel etablert at tarmfloraen har en sentral rolle i patogenesen av Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt ( UC) kollektivt referert til som inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Epidemiologiske studier har gitt sterke bevis for at IBD pasienter bjørn økt risiko for utvikling av tykk- og endetarmskreft (CRC). Det gjenstår imidlertid virkningen av bakterieflora på utviklingen av kolitt-assosiert kreft (CAC) i stor grad ukjent. I denne studien har vi etablert en ny modell av CAC hjelp azoxymethane (AOM) -exposed, conventionalized-
Il10
– /-
mus og har utforsket bidraget fra vertstarmfloraen og MyD88 aliserte til utvikling av CAC. Vi viser at 8/13 (62%) av AOM-
Il10
– /-
mus utviklet tumorer sammenlignet med bare 3/15 (20%) av AOM- villtype (WT) mus . Conventionalized AOM-
Il10
– /-
musene spontan kolitt og kolorektal karsinom mens AOM-WT mus var kolitt fritt og utviklet bare sjelden adenomer. Viktigere, tumor multiplisitet direkte korrelert med tilstedeværelse av kolitt.
Il10
– /-
mus mono-forbundet med mildt colitogenic bakterien
Bacteroides vulgatus
vises betydelig redusert kolitt og kolorektal tumorer mangfold sammenlignet med
Il10
– /-
mus. Bakteriefritt AOM-behandlet
Il10
– /-
mus viste normal tykktarm histologi og var blottet for svulster.
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus behandlet med AOM vises redusert uttrykk for
Il12p40 Hotell og
TNFa
mRNA og viste ingen tegn til tumorutvikling. Vi presenterer den første direkte demonstrasjon av at manipulering av tarmfloraen endrer utviklingen av CAC. TLR /MyD88 veien er viktig for microbiota-indusert utvikling av CAC. I motsetning til funn ved bruk av det AOM /DSS-modell, viser vi at alvorlighetsgraden av kronisk kolitt korrelerer direkte til tykktarmskreftutvikling og at bakterie-indusert betennelser stasjoner progresjon fra adenom til invasivt karsinom
Citation. Uronis JM, MÜHLBAUER M, Herfarth HH, Rubinas TC, Jones GS, Jobin C (2009) Modulation av tarmfloraen Endrer kolitt-Associated tykktarmskreft følsomhet. PLoS ONE 4 (6): e6026. doi: 10,1371 /journal.pone.0006026
Redaktør: Stefan Bereswill, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Tyskland
mottatt: May 19, 2009; Godkjent: 30 mai 2009; Publisert: 24 juni 2009
Copyright: © 2009 Uronis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (NIH): ROI DK 47700 og RO1 DK 73338 (C. Jobin) og Gastroenterology forskerutdanning gi NIH 5 T32 DK007737 (J. Uronis) og ved NIH P30 DK034987 (Senter for Gastrointestinal Biology og sykdom). Gnotobiotiske og bakteriefritt arbeidet ble støttet av NIH Grant: P40RR018603. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
muligheten til å montere en betennelsesreaksjon etter skade eller eksponering for fremmede organismer er avgjørende for verten homeostase og overlevelse. Imidlertid er en vedvarende økt immunrespons, slik som den som ble observert i kroniske inflammatoriske lidelser alvorlig svekker vertsorganfunksjon, til slutt resulterer i sykdom [1]. En stor risiko forbundet med kronisk betennelse øker sannsynligheten for kreft utvikling [2] – [4]. Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC) kollektivt betegnet inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er kvintessensen eksempel der kronisk betennelse betyr økt kreftrisiko [2]. Den samlede forekomsten av tykktarmskreft i IBD pasienter varierer fra 7,6% til 18,4%, 30 år etter diagnose [5] – [8]. Videre epidemiologiske data tyder på at varigheten og alvorlighetsgraden av kronisk kolitt representere betydelige risikofaktorer for kolitt-assosiert tarmkreft (CAC) [9] – [11]. Selv om etiologien av IBD er ikke klarlagt, dyremodellbaserte studier indikerer at vertstarmfloraen utløser en immunrespons som er nødvendig for utbruddet av sykdommen [12] – [15]. Denne ukontrollerte immunrespons representerer sannsynligvis en feil i ett eller flere immunsupprimerende mekanismer er ment å tilveiebringe toleranse til verten tarmfloraen, noe som resulterer i overproduksjon av proinflammatoriske mediatorer [12], [16]
Begrepet av et balansert immundempende reaksjon rettet mot å regulere microbiota kan best illustreres i interleukin-10 knock-out (
Il10
– /-
) mus. Disse mus, som oppviser en intoleranse overfor sine tarmfloraen utvikler spontan kolitt som et resultat av mikrobielle-indusert aktivering av T-celler [17] – [19].
human colon i havnen så mange som 36 000 bakteriearter som beløper til over 100000000000000 aerobe og anaerobe bakterier [20], [21]. Som et produkt av vår co-evolusjon med bakterier, har et kommunikasjonssystem utviklet som tillater oss å regulere hverandre, og dermed opprettholde intestinal homeostase [21]. En vesentlig rolle i den krysstale som oppstår mellom den humane tarmen og dens hjemmehørende mikrobiota utføres ved medfødte bakterielle sensorer som er kjent som mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS) [21]. To hovedklasser av PRRS er blitt vist å regulere kommunikasjon mellom tarmepitelet og den bakterieflora. Toll-lignende reseptorer (TLR) og Nod-lignende reseptorer (NLRs) tjene til å varsle verten til tilstedeværelsen av bakterier i ekstracellulære og intracellulære mellomrom henholdsvis [22], [23]. Bruke azoxymethane (AOM) /DSS modell av CAC, Fukata og medarbeidere viste at TLR4 deltar i utviklingen av tykktarmskreft [24]. Selv interessant, har denne studien ikke er direkte adressert virkningen av bakterieflora i CAC utvikling. I tillegg vises AOM /DSS modell av CAC å vise en dissosiasjon mellom alvorlighetsgraden av tarmbetennelse og kreftutvikling. Åpenbart er ytterligere etterforskning av virkningen av bakterier på utvikling av CAC nødvendig.
I denne studien benyttet vi bakterie-fri og gnotobiotiske teknologi for å modulere innhold av tarmfloraen for å bestemme den direkte effekten av bakterier på utvikling av CAC. Vi viser at AOM-behandlet
Il10
– /-
mus utvikler CAC i nærvær av colitogenic bakterier mens bakterie-fri mus forbli sykdomsfri. Tilstedeværelsen av kolitt korrelerer direkte med svulst mangfold og fungerer som en formidler av tykk- og endetarmskreft. I tillegg AOM-behandlet
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus klarte å utvikle kolorektal tumorer, noe som indikerer at bakteriell signalering gjennom TLR /MyD88 system er nødvendig for utvikling av CAC
Resultater
. bakteriell-mediert kolitt øker colorectal tumorigenesis
for å undersøke hvilken rolle bakteriell-mediert kolitt i utbruddet av tykktarmskreftutvikling, conventionalized WT og
Il10
– /-
mus ble gitt en diett av AOM og overvåkes
in vivo
for tegn på kolitt og tumor utvikling av koloskopi på definerte intervaller (fig. 1). Etter 16 uker, WT mus viste ingen tegn på makroskopisk betennelse og vises en semi-gjennomsiktig slimhinnene med veldefinerte vaskularisering forbundet med en sunn kolon (Fig. 2A, venstre panel). I kontrast,
Il10
– /-
mus viste slimhinne fortykkelse og tap av tilsynelatende blodkar forbundet med makroskopiske tarmbetennelse (figur 2A, midtre panelet.). Makroskopiske lesjoner som er kompatible med svulster ble observert i conventionalized
Il10
– /-
mus ved uke 16 (figur 2A, panel høyre.). For ytterligere å studere disse lesjonene ble utført histologisk analyse av colonic vev på WT og
Il10
– /-
mus. Vi bekreftet at de makroskopiske lesjoner observert hos
Il10
– /-
mus var svulster som utvikles i betent tykktarm. Som vist på fig. 2B, AOM-behandlede
Il10
– /-
mus viste en dramatisk økning i tumorpene og multiplisitet sammenlignet med WT mus. I vår studie, 8/13 (62%) av
Il10
– /-
musene colontumorer sammenlignet med kun 3/15 (20%) av WT mus. Videre tumor multiplisitet var 5 ganger høyere i
Il10
– /- mus
med et gjennomsnitt på 1- sammenlignet med bare 0,2 tumorer i WT mus (figur 2B.) (P = 0,034). Av notatet, tumor utvikling i
Il10
– /-
mus ble assosiert med økt tarmbetennelse som bestemmes av histologisk analyse (figur 2C.) (P 0,0001). Kolon uttrykk for
IL12p40 Hotell og
TNFa
mRNA ble signifikant forhøyet i
Il10
– /-.
– Sammenlignet med WT mus (Fig. 2C)
bakteriefrie mus ble overført til SPF vilkår og lov til å akklimatisere seg i 5 uker. Mus fikk AOM injeksjoner en gang i uken i 6 uker (svarte pilspisser). Utvikling av kolitt og tumordannelse ble overvåket ved koloskopi fra uke 4 til 18 etter overføring fra bakterie fri til SPF vilkår (hvite pilspisser). Mus ble ofret mellom 18 og 20 uker og vev bearbeidet for histologisk og mRNA uttrykk analyse.
A. Representative eksempler på WT (venstre panel) og
Il10
– /-
kolon (midten og høyre panel) fra AOM-behandlede mus 16 uker etter overføring til SPF forhold. B. Tumor pene og mangfold i WT og
Il10
– /-
mus (venstre og høyre panel) (p = 0,034). C. WT og
Il10
– /-
tykktarm betennelse score, distal kolon
Il12p40 Hotell og
TNFa
mRNA nivåer etter 18-20 uker under SPF forhold (p = 0,026).
for ytterligere å undersøke sammenhengen mellom bakteriell-indusert kolitt og utvikling av svulster, utførte vi lineær regresjonsanalyse, sammenligner histologiske betennelse poengsum mot svulst nummer. Pearson korrelasjonsanalyse viste en sterk positiv sammenheng mellom betennelse og tykktarmskreftutvikling (p = 0,0028). Disse dataene antyder at kronisk kolitt øker utviklingen av tidlige transformasjon hendelser initiert av AOM, kanskje gjennom å etablere et mikromiljøet mer støttende av celleproliferasjon.
Kronisk kolitt øker AOM-indusert tykktarmstumorprogresjon
Vurderer den dramatiske økningen i mottakelighet for tykktarmskreftutvikling, hypotese vi at mus med kronisk kolitt kan også demonstrere økt mottakelighet for avansert tumorprogresjon. Histologisk evaluering ble utført og svulster ble klassifisert som enten lav eller høy grad av dysplasi eller som invasiv carcinoma. Sju av åtte (88%) av tumorbærende AOM /
Il10
– /-
musene høyverdig eller invasiv carcinoma mens ingen av de 3 svulster ble observert i WT mus viste bevis på avansert histologisk stadium ( fig. 3A). Representative eksempler på tykktarms tumorhistologi observert i AOM-behandlet WT og
Il10
– /-
mus er vist i figur 3B. Disse dataene antyder at kronisk kolitt ikke bare disponerer for økt mottakelighet for FDV-indusert tykktarmskreftutvikling, men også forbedrer svulstene onkogene potensial, og dermed fremme progresjon til mer avanserte stadier.
A. Prosent av tumorbærende WT og
Il10
– /-
mus med høyverdig eller invasivt karsinom (øvre panel). Representant lavgradig adenom observert i WT mus (i midten panel). Representant invasivt karsinom observert i
Il10
– /-.
Mus (nedre panel)
NFkB aktivitet og cellulær proliferasjon i svulster fra
Il10
– /-
mus
NFkB signalering spiller en avgjørende rolle i å fremme bakteriell-indusert kolitt i
Il10
– /-
mus [25], [26]. For å bekrefte tilstedeværelse av aktiverte Rel A (NFkB) -signaling i AOM /
Il10
– /-
modell av CAC, vurdert vi uttrykket /lokalisering av fosforylert RELA (S276) i
Il10
– /-
kolon vev ved immunhistokjemi (IHC). Kolon fra
Il10
– /-
mus viste rikelig fosforylerte RELA positive infiltrere immunceller (fig 4A.). Videre ble det observert tilstedeværelsen av mange fosforylerte RELA positiv immune- og intestinale epitelceller i adenomer fra
Il10
– /-.
Mus (Fig. 4B)
A. Fosforylert-Rel En farging av normal
Il10
– /-
kolon vev. B. Utvidelse av Rel En positiv immun infiltrere i A. C. Fosforylert Rel En farging i
Il10
– /-
adenom. D. Utvidelse av adenom i CE Rabbit IgG negativ kontroll.
På grunn av sin rolle i å fremme celle spredning og overlevelse, vi evaluert fordelingen av Ki67 positive celler i aktivt betente og neoplastiske regioner av kolon isolert fra AOM /
Il10
– /-
mus. Nuclear Ki67 farging ble stort sett begrenset til krypten baser i WT mus (Fig. 5A). I motsetning til dette kolon mukosa fra betent
Il10
– /-
mus viste områder med økt proliferasjon som strekker seg i noen tilfeller kan hele krypten lengde (figur 5A.). I tillegg kolorektale adenomer høstet fra
Il10
– /-
mus viste øket konsekvent sin Ki67 farging sammenlignet med normal slimhinne (figur 5B.). Denne forbedrede spredning er forenlig med økt akkumulering av kjernekraft CTNNB1 i adenomatøse vev fra
Il-10
– /-
mus (Fig. 5C). Samlet utgjør disse data tyder på at økt inflammatorisk og proliferativ tilstand observert i sammenheng med
Il10
– /-
mus kolon kombinert med AOM-indusert aktivering av Wnt /CTNNB1 sti fører til en økt tilbøyelighet for tykktarmstumordannelse og progresjon.
A. Ki67 positive celler er begrenset til krypten baser i normal WT kolon. Normale kolon fra
Il10
– /-
mus utviser langstrakte krypter med utvidet Ki67 positive farging. B. Representant adenom fra
Il10
– /-
mus viser økt Ki67 positive farging (venstre panel). Kanin IgG negativ kontroll (høyre panel). C.
Il10
– /-
adenom viser positiv CTNNB1 farging
Germ gratis
Il10
-. /-
Mus mono-tilknyttet
Bacteroides vulgatus
skjerm redusert kolitt og tykktarmskreftutvikling sammenlignet med
Il10
– /-
SPF mus
for å avgrense ytterligere rollen av bakterier i å fremme utviklingen av CAC, vi mono-forbundet bakterie-fri WT og
Il10
– /-
mus med
Bacteroides vulgatus product: (.
B vulgatus
), en tarmbakterie, som er blitt rapportert tidligere å indusere bare mild kolitt i
Il10
– /-
modell av IBD [18]. Histologisk Evalueringen viste at
Il10
– /-
mus kolonisert med
B. vulgatus
utviklet moderat kolitt (gjennomsnittlig poengsum = 1,6) sammenlignet med WT mus (gjennomsnittlig poengsum = 0,36) (fig. 6A). Disse verdiene var imidlertid betydelig mindre enn provoserende score observert i konvensjon
Il10
– /-
mus (gjennomsnittlige poengsum = 2,6, p = 0,03) (figur 6A.). Konkordant med betennelse status, mono-forbundet
Il10
– /-
mus viste en betydelig lavere svulst mangfold i forhold til sine konvensjon kolleger (henholdsvis 0,4 og 2,3, p = 0,002) (Figur 6b). Pearson lineær regresjonsanalyse viste en sterk positiv korrelasjon mellom histologiske kolitt poengsum og tykktarms svulst blandt
B. vulgatus
mono-forbundet mus (p = 0,009). Videre AOM behandlet bakterie fri
Il10
– /-
mus klarte å utvikle kolitt og dermed kolorektal tumorer som bekreftes av histologisk evaluering (Fig 6A . B). Disse funnene tyder på at tilstedeværelsen av colitogenic bakterier er viktig for utviklingen av CAC.
A. Sammenligning av betennelse score for
Il10
– /-
mus henhold SPF,
B. vulgatus
mono-forbundet og bakteriefrie forhold. B. Tumor mangfaldet i
Il10
– /-
mus henhold SPF,
B. vulgatus
mono-forbundet og bakterie gratis forhold.
MyD88 signalering er nødvendig for bakteriell-indusert CAC
For å undersøke hvilken rolle TLR /MyD88 sti signalisering i CAC utvikling,
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus ble administrert AOM og tykktarmstumordannelse ble evaluert. Koloskopi viste tilstedeværelse av neoplastiske lesjoner i
Il10
– /-
mus mens
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus viste ingen tegn til sykdom (data ikke vist). Representative eksempler på tykktarmen vev histologi for
Il10
– /- Hotell og
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus er vist i figur 7A.
Il10
– /-
mus utviklet et gjennomsnitt på 0,8 kolorektal tumorer /mus mens
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus var blottet for neoplastiske lesjoner (figur 7B)
A.. Representant histologi observert i
Il10
– /- Hotell og
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus behandlet med AOM. B. Tumor mangfaldet i
Il10
– /- Hotell og
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus behandlet med AOM. C. Relativ uttrykk for
Il12p40 Hotell og
TNFa
mRNA i distale kolon av
Il10
– /- Hotell og
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus
For å utforske muligheten for at opphevet tumordannelse i
Il10
– /-.
;
MyD88
– /-
mus er et resultat av endrede inflammatorisk-cytokin uttrykk, brukte vi semi-kvantitativ PCR for å bestemme de relative mRNA uttrykk nivåer av proinflammatoriske cytokiner
Tnf
a og
Il12p40
i distal kolon, den dominerende stedet for tumordannelse. Vi har observert betydelig lavere
Il12p40
mRNA ekspresjon (p = 0,032), samt en bemerkelsesverdig tendens mot redusert
TNFa
uttrykket (p = 0,089) i
Il10
– /- ; MyD88
– /-
sammenlignet med
Il10
– /-
mus (figur 7C). Til sammen disse funnene tyder på at bakteriell-indusert betennelser fremmer utviklingen av kolitt-assosiert kolorektal kreft og er avhengig av TLR /MyD88 sti signalering.
Diskusjoner
Selv om UC representerer prototypiske eksempel på knytte eksisterende mellom kronisk betennelse og risiko for å utvikle tykktarmskreft, mekanismene bak denne prosessen er fortsatt ikke klarlagt. Dette er sannsynligvis på grunn av begrensninger som følger av eksisterende eksperimentelle modeller, som gjør det vanskelig å rekapitulere effektene av kronisk betennelse på tykktarms tumorigenesis. I denne studien viste vi at colitogenic bakterier er nødvendig for utvikling av kronisk tarmbetennelse som fører til tumorigenesis. Ved hjelp av AOM som en svulst initiativtaker og microbiota å utløse kronisk kolitt i genetisk mottakelige
Il10
– /-
mus, viser vi at betennelse korrelerer direkte med kolorektal svulst mangfold og forbedrer tumorprogresjon. Disse hendelsene ble ikke observert i
Il10
– /-
mus holdt under bakterie-frie forhold og var sterkt svekket i mus forbundet med
B. vulgatus
, en svak inducer av tarmbetennelse. Videre forstyrrelse av MyD88 signalering, en nøkkel integrator av flere TLRs hindret utvikling av tykktarmssvulster i
Il10
– /-
mus. Disse funnene sterkt etablere microbiota som sentrale i å utløse tarmbetennelse og neoplastiske endringer i en mottakelig vert. Rollen TLR signalering i utviklingen av kolorektal kreft har vært gjenstand for siste intens etterforskning. Rakoff-Nahoum og medarbeidere viste at MyD88 signale bidrar til tumorprogresjon i
Apc
Min
modell for menneskelig familiær adenomatøs polypose, tyder på en rolle for tarmmikroorganismer i ferd med tumorigensis [27]. Men fordi cytokiner som IL1 og IL18 også benytte MyD88 å aktivere nedstrøms målgener [28] involvering av tarmfloraen i denne modellen er uklart. Videre involvering av MyD88 signalering i utviklingen av CAC ble ikke behandlet i denne studien. Et bedre bilde av hvilken rolle TLR signalisering i CAC har begynt å dukke opp fra studier med AOM /DSS modell. For eksempel, Fukata og medarbeidere viste at tykk- tumorigenesis er sterkt redusert i
TLR4
– /-
mus, noe som tyder på at denne medfødte reseptoren er viktig for utviklingen av CAC [24]. Men denne sterke reduksjon av neoplasi ble ikke ledsaget av en samtidig reduksjon i inflammasjon. Det er derfor en åpenbar frakobling mellom tarmbetennelse og tumorigenesis i AOM /DSS modell. Dette fenomenet er ikke spesifikt for TLR signale siden en fersk rapport viste at tumorigenesis er dramatisk redusert i
IL6
– /- Hotell og
Stat3
– /-
mus, til tross for betydelig høyere inflammatorisk resultater i disse musene [29]. I motsetning til dette, ved hjelp av AOM /
Il10
– /-
modell, ble det observert en sterk korrelasjon mellom betennelse stillingen og tumor multiplisitet. Dette tyder på at alvorlige betennelser mer treffende støtter overlevelse av tidlige transformasjon hendelser. I tillegg våre data indikerer at tilstedeværelsen av betennelse uavhengig av alvorligheten påvirker tumorprogresjon. Det er mulig at tumor-mikromiljøet til stede i AOM /DSS modellen skiller seg fra den i AOM /
Il10
– /-
modellen, noe som kan gjøre rede for redusert tumordannelse til tross for den høye inflammatorisk tilstand i det tidligere modell.
Nye rapporter har gitt innsikt i rollen som kolitt som en formidler av kolorektal tumorigenesis i AOM /DSS modell [24], [29]. Men et viktig spørsmål som gjenstår ubesvart, er om disse tumorfremmende effekter er utløst av den sårhelende respons iboende forårsaket av DSS behandling eller ved betennelse som følger med det. For eksempel, Grivennikov og medarbeidere viser at
IL6
– /-
mus utstillings redusert svulst mangfold og belastning i forhold til WT mus etter AOM /DSS behandling ennå disse musene viste mer alvorlig tarmbetennelse enn WT mus . Følgelig reduseres tumorigenese i denne modellen er et resultat av svekket IL6 /STAT3 signalisering i intestinale epitelceller (IEC), og ikke nødvendigvis av intestinal inflammasjon. Vi viser her at AOM /
Il10
– /-
modell av CAC kan brukes til å undersøke spesielt, virkningen av kolitt på tykk- tumorigenesis. Enten IL6 /STAT3 signalering er viktig i utviklingen av CAC i AOM /
Il10
– /-
mus gjenstår å bli undersøkt. I tillegg, viser vi at CAC forekommer i sammenheng med aktivert NFkB veien signalering, som vist ved nærvær av NFkB positive immunceller tyder på at denne inflammatoriske signalveien er viktig i utviklingen og /eller fremming av neoplasi. Ytterligere studier vil være nødvendig for å mer spesifikt definere en rolle for NFkB-mediert betennelsessignalering i CAC.
I sammendrag viser vi at tarmen bakterieflora er viktig for utviklingen av CAC og at kronisk kolitt fremmer onkogene potensialet kolorektale svulster som resulterer i progresjon til avanserte stadier. Disse hendelsene er avhengige av mikrobiell anerkjennelse av TLR /MyD88 system. Modulering av dette viktige medfødt sensing system kan representere en roman mener med å forhindre /dempe utviklingen av CAC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle dyr protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of North Carolina i Chapel Hill
Mus og induksjon av CAC
WT og
Il10
-. /-
mus på 129 SvEv bakgrunnen ble avlet og plassert i gnotobiotiske Animal Facility ved University of North Carolina i Chapel Hill. Ti til tolv uker gamle bakterie-fri mus ble overført til spesifikk patogen gratis (SPF) forhold (conventionalized), og etter 5 uker ble injisert intraperitonealt med 10 mg /kg kroppsvekt AOM (Sigma Aldrich) en gang i uken i 6 uker.
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus og kontroll
Il10
– /-
mus (C57BL /6J /129) ble tatt opp i henhold SPF forhold og ved 12 ukers alder ble injisert med AOM som beskrevet ovenfor. Alle musene testet fri for helicobacter hepaticus og Helicobacter pylori, to kjente indusere av tumordannelse i
Il10
– /-.
Mus [30]
Bakteriell kolonisering
Il10
– /-
– og WT mus var mono-forbundet ved 10-12 ukers alder med sonde fôring og rektal swabbing med levedyktige bakterier dyrket fra marsvin isolater av
Bacteroides vulgatus
. Mono-forbundet mus ble opprettholdt i gnotobiotiske Animal Facility ved University of North Carolina i Chapel Hill. Bakteriell foreningen og fravær av kontaminering av andre bakteriearter ble bekreftet av periodisk aerob kultur avføringsprøver og gram flekker.
Obduksjon og tumorhistologi
Ved ofring, kolon ble fjernet fra cecum til rektum, spylt med PBS, sprikende lengderetningen og svulster telles. Distale colon vevsprøver ble samlet og hurtigfrosset. Kolon ble swiss-valset fra den distale til den proksimale enden, faste over natten i 10% formalin og parafin-innleiret. Seks mikrometer seksjoner ble utarbeidet og farget med hematoxylin og eosin for histologisk analyse. Svulster ble scoret for betennelse og tumor klasse.
Histologisk evaluering av slimhinnebetennelse ble utført ved hjelp av et poengsystem fra 0 til 4 for å klassifisere graden av lamina propria mononukleære celle infiltrasjon, krypten hyperplasia, pokal celle uttømming og arkitektonisk forvrengning som tidligere beskrevet [18]. Svulster ble klassifisert som lavgradig dysplasi når de vises en uorganisert epitel omgitt av hyperchromatic celler med atom pseudostratification. Svulster ble klassifisert som høy klasse da de inneholdt back-to-back kjertler, høy kjernefysisk til cytoplasma ratio, økt atom pleomorphism og tap av mobilnettet polaritet. Svulster ble klassifisert som invasive karsinomer når det var klart penetrasjon av dysplastic regionen gjennom muskularis slimhinnene som resulterer i desmoplastic respons fra nabo stroma. Betennelse og neoplastiske lesjoner ble scoret av en utdannet patolog.
Immunohistochemistry
Tissue seksjoner ble deparaffinized i xylen og rehydrert gjennom en gradert serie av alkohol vasker. Immunhistokjemi for fosforylert-Rel A (Rela 276) ble utført med et kanin polyklonalt antistoff fortynnet 1:50 (Cell Signaling Technology) ved hjelp av Vectastain Elite kanin IgG kit (Vector Laboratories). Ki67 immunohistochemisry ble utført som følger: Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering i 0,3% H
2o
2 i 30 minutter. Antigen gjenfinning ble utført ved å koke seksjoner i 7 minutter i 0,01 M citratbuffer pH 6,0 og avkjølt ved romtemperatur i 30 minutter. Blokkering ble utført med 3% BSA i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) i 30 minutter ved romtemperatur. Ki67 monoclonoal antistoff (Dako) ble fortynnet 1:200. Biotinylert sekundært antistoff (Vector Laboratories) ble fortynnet 1:200 i 1% BSA /PBS. Etterfølgende trinn ble utført under anvendelse av Vectastain ABC-kit ifølge produsentens instruksjoner. CTNNB1 immunohistohistochemistry ble utført ved hjelp av en mus anti-CTNNB1 antistoff fortynnet 1:100 (Transduction Laboratories) med M.O.M. peroksidase kit (Vector Laboratories). Primære antistoff inkubasjons-trinn ble utført over natten ved 4 ° C. Visualisering ble utført ved hjelp av 3,3′-diaminobenzidin (Dako).
Real-time PCR
RNA ble isolert fra distal kolon vev ved hjelp av TRIzol metoden (Invitrogen, Carlsbad, California). cDNA ble utarbeidet av revers transkribere en mikrogram RNA ved hjelp av 126 enheter av M-MLV revers transkriptase, 1 mM dNTP og 875 pmol tilfeldige primere (Invitrogen). Semi-kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av en Eppendorf Realplex Master sykler. PCR-reaksjon: 150 nM endelig konsentrasjon på forover og bakover primere, 6 mL QuantiTect SYBR Grønn PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA) og 50 ng av cDNA mal i totalt 12 pl. De følgende PCR-betingelsene ble anvendt: 95 ° C, 15 minutter; (95 ° C, 15 sekunder; 56 ° C, 30 sekunder; 72 ° C, 30 sekunder) x 40 sykluser. Spesifisitet og linearitet av forsterkning for hvert primersett ble bestemt ved å smelte kurve analyse og beregning av hellingen fra seriefortynnede prøver. Relative fold-endringer ble bestemt ved bruk av ΔΔCT beregningsmetode. Verdiene ble normalisert til den interne kontrollen β-aktin. Grunning:.
TNFa product: (5 «ATGAGCACAGAAAGCATGATC 3’and 5» TACAGGCTTGTCACTCGAATT 3 «) og
Il12p40 product: (5′ CACGGCAGCAGAATAAATATG 3 «og 5» TTGCATTGGACTTCGGTAGA 3 «)
statistiske analyser
statistiske analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism versjon 5.0a. Sammenligninger gjort mellom WT og
Il10
– /-
eller
Il10
– /- Hotell og
Il10
– /-
;
MyD88
– /-
mus ble analysert ved hjelp av en to-tailed uparet t-test. Sammenligninger gjort mellom SPF,
B. vulgatus
mono-assosiert og bakterie-frie mus ble analysert ved anvendelse av en enveis variansanalyse (ANOVA). Individuelle sammenligninger ble senere gjort ved hjelp av en to-tailed uparet t-test. Pearson korrelasjonsanalyse ble utført for å vurdere sammenhengen mellom svulst antall og betennelse alvorlighetsgrad i AOM-behandlet WT og
Il10
– /-
mus (n = 22) med SAS (SAS Institute, Cary NC)
kolonoskopi
kolonoskopi ble utført 4, 8, 12, 16 og 18 uker etter overføring av mus fra bakteriefritt til SPF betingelser (Fig. 1) for å følge progresjonen av kolitt og tumordannelse .
In vivo
visualisering av svulster ble utført ved hjelp av en «Coloview System» (Karl Storz Veterinary Endoskopi). Musene ble bedøvet under anvendelse av 1,5% til 2% isofluran og ~4 cm av kolon fra analåpningen fra milt flecture ble visualisert. Prosedyrene ble digitalt innspilt på en AIDA Compaq PC.
Takk
Vi takker Maureen Bower og Cindy Spivey på The National gnotobiotiske gnager Ressurssenter for deres eksperthjelp i bakterie-fri gnager teknologi. Forfatterne ønsker å takke Amber McCoy fra Center for Gastrointestinal biologi og sykdom (CGIBD) Histologi Kjerne Facility for å få hjelp med histologisk behandling.
