Abstract
Vi har nylig rapportert at to artemisinin-avledet dimerer (dimer primær alkohol 606 og dimer sulfone 4-karbamat 832-4) er betydelig mer potent i å hemme human cytomegalovirus (CMV) replikering enn artemisinin-avledet monomerer. I vår videre evaluering av virksomheten til artemisinins i CMV hemming, ble tolv artemisinin-avledet dimerer og fem artemisinin-avledet monomerer brukt. Dimerer som gruppe ble funnet å være potente inhibitorer av CMV-replikasjon. Sammenligning av CMV-inhibering og helningen parameter av dimerer og monomerer tyder på at dimerer er forskjellige i deres anti-CMV-aktivitet. En deoxy dimer (574), mangler endoperoxide bro, ikke har noen effekt på CMV replikasjon, noe som tyder på en rolle for endoperoxide broen i CMV hemming. Forskjeller i anti-CMV-aktivitet ble observert mellom tre strukturelle analoger av dimer sulfon 4-karbamat 832-4 som indikerer at den nøyaktige plasseringen og oksydasjonstilstanden for svovelatom kan bidra til dets anti-CMV-aktivitet. Av alle de testede dimerer, artemisinin-avledede difenylfosfat dimer 838 viste seg å være den mest potente inhibitoren av CMV-replikasjon, med en selektivitet indeks på omtrent 1500, i forhold til våre tidligere rapporterte dimer sulfon 4-karbamat 832-4 med en selektivitet indeks av ca. 900. Diphenyl fosfat dimer 838 var svært aktiv mot en Ganciclovir bestandig CMV belastning og var også den mest aktive dimer i hemming av kreftcellevekst. Dermed kan difenylfosfat dimer 838 representerer en leder for utvikling av et svært potent og trygg anti-CMV sammensatte
Citation. Han R, Mott BT, Rosenthal AS, Genna DT, Posner GH, Arav-Boger R (2011) En Artemisinin-Avledet Dimer Har svært potent anti-Cytomegalovirus (CMV) og anti-kreft aktiviteter. PLoS ONE 6 (8): e24334. doi: 10,1371 /journal.pone.0024334
Redaktør: Kim D. Janda, The Scripps Research Institute, USA
mottatt: 1 juni 2011; Godkjent: 06.08.2011; Publisert: 31 august 2011
Copyright: © 2011 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av NIH AI 34885 (GHP), NIH KO8 AI074907, NIH 1R01AI093701 og March of Dimes 6 FY11 268 (RAB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Infeksjon med CMV, et medlem av herpesvirus-familien, er vanlig hos mennesker. Seroprevalensdata prisene øker med alderen, og nådde 90% hos personer eldre enn 80 år [1]. Viruset etablerer livslang vedvarende infeksjon, noe som vanligvis forblir asymptomatiske. I immunsupprimerte verter som resipienter og pasienter med AIDS, er CMV infeksjon assosiert med betydelig morbiditet og mortalitet [2], [3]. CMV er også den vanligste medfødt ervervet infeksjon forårsaker mental retardasjon og døvhet i congenitally-smittede barn [4]. Nylig har påvisning av CMV i immunkompetente individer blitt koblet med resultatene av flere syndromer, inkludert sepsis, lungekomplikasjoner hos pasienter i intensivavdelinger, og i en hjernesvulst, glioblastom multi [5] – [7]. Selv om direkte rolle for CMV i disse syndromene er uklart, kan virusreplikasjon bidrar til deres naturlige historie, og rollen som anti-CMV terapi i disse forholdene er for tiden under etterforskning.
Den tilgjengelige systemisk anti-CMV narkotika handling ved å målrette den viral DNA polymerase. Disse forbindelsene effektivt undertrykke CMV replikasjon, men bruken er forbundet med betydelig toksisitet til benmargen (Ganciclovir-GCV) og nyrene (foskarnet og cidofovir) [8], [9] og fremveksten av resistente mutanter under lengre kurs av terapi [9], [10]. Dermed nye forbindelser med lav toksisitet og ideelt med en tydelig mekanisme for CMV hemming er nødvendig for CMV terapi.
artemisinin-avledet monomer artesunate ble opprinnelig rapportert å hemme CMV replikasjon
in vitro Hotell og
in vivo product: [11], [12]. Nylig har vi rapportert om to artemisinin-avledet dimerer med betydelig mer potent aktivitet mot CMV replikasjon
in vitro
sammenlignet med artemisinin-avledet monomerer [13]. Artemisinin monomerer er i dag de narkotika av valget for malaria terapi [14]. I tillegg ble både artemisinin monomerer og dimerer vist seg å ha anti-kreft-aktivitet [15] – [17]. Den potent anti-CMV aktivitet av to artemisinin-avledet dimerer [13] bedt oss om å vurdere en rekke nylig syntetiserte artemisinin-avledet dimerer. Vi rapporterer om anti-CMV og anti-kreft aktiviteter de mest potente stoffer i denne undersøkelsen.
Resultater
En sammenligning av anti-CMV aktivitet av 17 artemisinin derivater
Vi har tidligere rapportert om anti-CMV aktivitet av fire artemisinin monomerer (artemisinin, artesunat, artemether, og artefanlide) og to artemisinin-avledet dimerer (dimer primær alkohol 606 og dimer sulfone 4-karbamat 832-4) [13]. Vi har nå testet en ny artemisinin-avledet monomer og ytterligere 10 nye artemisinin-avledet dimerer og sammenlignet deres anti-CMV aktiviteter til de av tidligere testede forbindelser. Den forkortede navn på de 17 forbindelsene og deres molekylvekter er oppført i tabell 1. I denne rapporten er hver forbindelse referert til av dens molekylvekt. For eksempel ble forbindelse 606 refererer til dimeren primær alkohol, og 832-4 refererer til dimer sulfon 4-karbamat (Tabell 1). Sulfone karbamat 551 er den monomere versjon av dimer sulfone karbamat 832-4. Den kjemiske strukturen til dimer sulfon 4-karbamat 832-4 hindrer den fra å bli catabolized til monomer sulfon 4-karbamat 551. Forbindelse 574, som er den deoxy-versjonen av 606, ble valgt for testing fordi anti-malaria og antikreftaktiviteter av artemisinins er i det minste delvis endoperoxide bro-avhengig [18], [19].
to tidligere testede artemisinin-avledede dimerer hadde potent anti-CMV-aktivitet ved konsentrasjoner på 1 uM eller lavere, mens Artemisinin-avledet monomerer oppnådd en tilsvarende grad av CMV hemming bare ved konsentrasjoner høyere enn 10 mikrometer [13]. Basert på disse dataene, ble alle nye forbindelser i utgangspunktet screenet for anti-CMV aktiviteter. De mest aktive forbindelsene ble deretter testet i detalj for deres anti-CMV-aktivitet. Alle dimerer ble først undersøkt ved konsentrasjoner på 1 uM, 0,3 uM og 0,1 uM. Den deoksy dimer 574 og monomer sulfone karbamat 551 ble vist på 1 mikrometer og 10 mikrometer. Ved 1 pM, dimerene viste sterk inhibering av sen pp28 genekspresjon (som sterkt korrelerer med plaque-reduksjon) [20] målt av luciferase-aktivitet, men det deoksy dimer 574 og monomer sulfon karbamat 551 ikke gjorde det (Fig. 1A). Flere dimerer var også effektiv ved 0,3 uM, men bare to dimerer, sulfon 4-karbamat 832-4 og difenyl fosfat 838, var sterkt hemmende ved 0,1 pM. Tre strukturelle analoger av sulfon 832-4 ble syntetisert (832-3, 800-3 og 800-4) å variere oksydasjonstilstand og posisjonen til svovelatomet på den aromatiske ringen (Fig. 1B). Selv om meta-sulfid (800-3), meta-sulfone (832-3), og para-sulfid (800-4) var aktive mot CMV replikasjon på 0,3 mikrometer, i motsetning til para-sulfone 832-4 de var ikke aktiv på 0,1 uM (fig. 1A). Derfor nøyaktig plassering og oksidasjonstilstanden til svovel atom bidrar til sin anti-CMV aktivitet
A:. Relativ luciferase aktiviteten artemsinin-avledet dimerer (til venstre), deoksy dimer 574, og artemisinin monomerer (til høyre) . Infisert og behandlet HFFS ble samlet 72 HPI og vasket en gang med PBS. Lysatene ble undersøkt for luciferase-aktivitet ved hjelp av Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI). B. Kjemisk struktur av analoger av dimer sulfon 4-karbamat 832-4. Avbildet er to sulfid carbamate analoger (800-3 og 800-4) og en sulfone 3-karbamat analog (832-3) av sulfone 4-karbamat 832-4. C: Cytotoksisitet av ti artemisinin-dimer og fem artemisinin-monomerer i HFF. HFFS behandlet med dimere /monomere i de angitte konsentrasjoner ble samlet opp ved 72 og vasket en gang med PBS. Lysatene ble analysert for celleviabilitet hjelp CellTiter-Glo Lysende celleviabilitet Assay Kit på GloMax®-Multi + Detection System (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner.
Vi neste undersøkt for cellulær toksisitet av dimerer og monomerer valgt CellTiter-Glo Luminescent celleviabilitet assay ved konsentrasjoner på 10 uM, 50 uM og 100 uM. For de fleste dimerer (bortsett fra 644 og 760), 50% cellulær cytotoksisitet (CC
50) varierte fra 50 til 100 um (Fig. 1C). Monomerer generelle vises ligner cytotoksisitet mønster, men var betydelig mer giftig enn dimers 100 mikrometer (p = 0,03 ved tosidig t-test). Dimerer 832-4 og 838 hadde den beste selektivitet indeks (SI), som er forholdet mellom CC
50 EC
50, og ble derfor valgt for ytterligere detaljert analyse av anti-CMV-aktivitet.
Struktur-aktivitetsforhold og celle toksisitet av dimerer 832-4 og 838 og deres overordnede dimerer 760 og 606
En detaljert sammenligning av anti-CMV aktivitet og toksisitet i ikke-kreft primære HFF-celler ble neste utført med de mest potente dimerer, 832-4 og 838 (fig. 2A). En doseavhengig økning i anti-CMV-aktivitet ble observert fra 0,01 uM til 1 uM for både dimerer 832-4 og 838 (fig. 2B, tabell 2). Cellulære toksisitet, målt på 1 til 100 mikron (tabell 2), ikke ble observert ved konsentrasjoner på fullstendig CMV inhibering. EF
50, er CC
50 og SI vist i fig. 2B og Tabell 2. dimerer 832-4 og 838 hadde en høy SI, men 838 var den beste forbindelsen. De overordnede alkoholer som 832-4 og 838 ble syntetisert, 760 og 606, henholdsvis, var mindre effektive enn sine derivater i CMV hemming. For 606-838 paret forskjellen i SI var 5 ganger, og etter den 760-832-4 paret, 30-ganger (fig. 2A, 2B). Selv om dimeren sulfon 4-karbamat 832-4 og monomeren sulfon 4-karbamat 551 har identisk sulfon 4-karbamat-funksjonelle grupper (Fig. 2A), dimer 832-4 var minst 150 ganger mer effektiv i CMV inhibering enn 551 monomer.
A: Kjemiske strukturer av de to mest potente artemisinin-avledet dimerer 838 og 832-4 og tilhørende foreldre alkoholer 606 og 760. Monomer 551 er avbildet til venstre på dimer 832-4. Sulfonet benzylisk dimetyl- karbamat enhet er den samme i monomeren 551 som i dimer 832-4. Derfor er den forbedrede anti-CMV-aktivitet av dimeren 832-4 løpet av monomeren 551 ikke på grunn av noen forskjell i sulfon-karbamat delen av molekylet. B: Detaljert anti-CMV-aktivitet av dimerer 832-4 og 838, og deres respektive moderforbindelsene 760 og 606. CMV-infiserte HFF ble behandlet med dimerer 832-4 og 838 ved de angitte konsentrasjoner. 72 hpi luciferase-aktivitet ble bestemt i lysater av infiserte celler. Luciferase-verdier representerer gjennomsnittet og standardavvik for data som er utledet fra minst fire uavhengige eksperimenter utført in triplo. Kurven montering verktøykasse, Matlab programvare (v7.5), Mathworks (Natick, MA) ble benyttet for å bestemme EF
50 verdier med en fire-parameter logistisk regresjon.
Hemming av en GCV-resistent CMV belastningen ved dimers 832-4 og 838
Vi evaluerte hemming av en GCV-resistent stamme (EF
50 av GCV = 7,6 mm) av dimer 832-4 og 838 ved hjelp en plakett reduksjon analysen. Dimerer 832-4 og 838 ble påført på infiserte celler ved en konsentrasjon på 0,1 uM; GCV ble påført ved 5 uM og 30 uM. Tyve en dager etter infeksjon, ble cellene farget med krystallfiolett og plaques ble telt i hver tilstand (fig. 3). Dimerer 832-4 og 838 fullt ut inhiberte dannelse av plaque på 0,1 uM, mens denne stamme viste en tydelig motstand mot GCV ved 5 uM.
A plakkreduksjonsanalyse ble anvendt for å kvantifisere inhiberingen av GCV-resistente CMV. CMV-infiserte HFF ble behandlet med 832-4, 838 og GCV på de angitte konsentrasjoner. Plakk ble talt 21 dager etter smitte.
bakkene anti-CMV dose responskurver av de testede anti-CMV forbindelser
En klassisk beskrivelse av dose-respons-forhold er medianen virkning modell basert på massevirknings som indikerer at [21]: i denne funksjonen, er andelen av den inhiberte fraksjon av virus, eller inhiberingsprosenten,
D
er medikamentkonsentrasjonen,
EU
50
er den medikamentkonsentrasjon som oppnår 50% av den maksimale inhiberende effekt og
m
er en skråning parameter av kurven matematisk. Effekten av skråningen parameteren på anti-HIV-aktivitet ble nylig evaluert, og viste seg å være en egenskap av medikament klasse og en avgjørende parameter dimensjon i analyse av antiviral aktivitet [21].
påført denne modellen for å våre derivater og beregnet helningen parameter av de mest potente dimerer (832-4 og 838), GCV og artemisinin-avledede monomer artesunate (tabell 2). Sammenlignet med GCV og artesunat, som hadde en anti-CMV
m
verdi på ca 1,
m
verdier av 832-4, 838, 760 og 606 var rundt fire, en indikasjon på at disse forbindelser er en svært potent klasse av anti-CMV-forbindelser.
Inhibering av kreftcellevekst av dimerer 832-4 og 838
artemisinin-avledede monomerer og flere dimerer har blitt rapportert å inhibere vekst av cancercellelinjer [16], [17]. Fire dimerer (832-4, 838, 760 og 606), to monomerer (artesunat og artefanilide) og GCV ble påført tre kreftcellelinjer: HeLa (cervical adenokarsinom), HCT116 (kolorektal kreft) og 1205Lu (melanom) i konsentrasjoner som varierte fra 0,01 uM til 1 uM. MTT-analysen ble utført 72 timer etter behandling og CC
50 av hver forbindelse i hver kreftcellelinje ble beregnet (tabell 3). CC
50 av hver forbindelse i kreftceller ble sammenlignet med CC
50 i ikke-cancer primære HFF-celler. Alle dimerer var signifikant mer aktive enn monomerer i å hemme vekst av cancercellelinjer. For eksempel, dimeren 838 var minst 200 ganger mer potent ved inhibering av vekst av HCT116 og 1205Lu celler og 37 ganger mer potent ved inhibering av veksten av HeLa-celler, sammenlignet med artesunate, den mest potente monomeren i denne analysen. En kvalitativ korrelasjon ble observert mellom anti-CMV-aktivitet og anti-kreft aktivitet blant de fire dimerer (838, 832-4, 606 og 760); dimer 838, den mest potente av alle testede dimer mot CMV replikasjon, hadde også den sterkeste effekten på vekst hemming av kreftceller.
Diskusjoner
Vi rapporterer her på anti-CMV aktiviteten av ti nye artemisinin-avledede dimerer, en deoksy-dimer og en ny artemisinin monomer, og identifiseringen av de mest potente anti-CMV dimer. Den forbedrede anti-CMV-aktivitet av dimerer i forhold til monomerer var ikke et resultat av økt cytotoxcity men snarere et spesifikt anti-CMV-aktivitet. De to mest potente dimerer var effektive i hemming av laboratorie innrettet Towne-stamme, så vel som et GCV-resistent stamme. De ble også vist å ha den sterkeste hemmende virkning på veksten av kreftcellelinjer.
Alle dimerer oppviste potent CMV inhibering ved 1 pM. Imidlertid kan bare to forbindelser (832-4 og 838) velges som sterkt potente anti-CMV agenter basert på deres høye CMV inhibering ved 0,1 uM og deres lav cytotoksisitet. Ved denne konsentrasjonen de andre dimerer hadde enten ingen inhibering eller høyst 40% inhibering av luciferase uttrykk, mens GCV hadde ingen hemming i det hele tatt.
artemisinin derivater ble opprinnelig utviklet som anti-malaria medikamenter, men senere ble også funnet å ha andre farmakologiske aktiviteter som vekstinhibering av kreft celler og inhibering av CMV-replikasjon [12], [13], [22] – [25]. Hvorvidt disse nye aktiviteter er knyttet til hverandre og indikere en felles mekanisme, synes endoperoxide broen å være kritisk i alle farmakologiske aktiviteter av artemisinin derivater.
Som en generell observasjon, dimerene var signifikant mer potent enn monomerene i CMV-inhibering. Bruke EF
50 verdier
, dimer 838 var 165 ganger mer potent enn artesunate i anti-CMV aktivitet og dens SI var 134 ganger høyere sammenlignet med artesunat. Til støtte for dette funnet, modell av doserespons helling parameter som nylig ble benyttet for å karakter aktiviteter av anti-HIV-forbindelser [21] viste at dimerene hadde en mye høyere skråning enn monomerer. Generelt korrelerer en større skråning med en mer kraftig antiviral aktivitet. Dette kan resultere enten fra meget høy affinitet av medikament binding til en enkelt ligand eller fra samarbeidende virkning av multippel-ligander med lik affinitet.
Mange anti-kreftmidler (slik som kinase-inhibitorer) har vært vist å hemme CMV-replikasjon , men generelt, de konsentrasjoner som kreves for å oppnå CMV hemning var toksisk for celler og forbudt deres anvendelse som antivirale kandidater [26]. Interessant, Sorafenib, en multi-kinase inhibitor, ser ut til å hemme CMV-replikasjon uten tilknyttet cellulær toksisitet [27]. Dimerene rapporteres her hindret veksten av kreftcellelinjer og var potente hemmere av CMV replikasjon uten åpen cellulære toksisitet. Derfor kan de tilveiebringe en ny klasse av anti-CMV midler, med en tydelig virkningsmekanisme. I likhet med anti-CMV-aktivitet, dimerer var også mer effektiv enn monomerer i hemning av kreftceller. Fremtidige studier kan avsløre hvorvidt de to anti-CMV og anti-kreft-aktivitet av dimerer resultere fra en felles virkningsmekanisme. Vi og andre har vist at inhibering av CMV-replikasjon med artemisinin derivater vises tidlig i løpet av replikasjonssyklusen og involverer en mekanisme som er forskjellig fra DNA-polymerase-inhibitorer [28], [29]. Den anti-kreft-aktivitet av artemisinins har blitt postulert til å involvere cellesyklus-stans, apoptose og /eller angiogenese [30], prosesser som også påvirkes av bestemte CMV-gener, for det meste umiddelbart tidlige gener. . Framtidige studier vil ta mekanismen av CMV hemming av artemisinin-avledet dimerer og deres potensial overlapp med onkogene signal hendelser
I konklusjonen, vi har vist at: 1). Dimerer er meget aktive mot CMV-replikasjon, og dimer-difenylfosfat 838 er den mest potente i CMV-inhibering. 2). Doserespons helling parameter av dimerer er betydelig høyere enn for artemisinin monomerer og GCV, en mulig indikasjon på at dimerer er en distinkt klasse av anti-CMV-forbindelser. 3) dimerer er mer potente hemmere enn monomerer i begge kreftcellelinjer og i CMV.
Materialer og metoder
Forbindelser
Ganciklovir (GCV) ble hentet fra Roche, USA . Alle artemisinin derivater brukt i denne studien ble syntetisert ved Johns Hopkins University [17], [31] – [33]. Nylig syntetiserte dimer sulfid 3-karbamat (800-3) og dimer sulfid 4-karbamat (800-4) så vel som dimer sulfon 3-karbamat (832-3) ble syntetisert som beskrevet i Materialer S1. Artemisinin-avledet monomerer og dimerer ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) og lagrene av 10 mM ble lagret i -80 ° C. Syntetiske forbindelser var minst 98% rent basert på proton-NMR-spektroskopi. Den DMSO selv ble testet i CMV-infiserte celler, og det hadde ikke noen anti-viral aktivitet [13].
Virus
pp28-luciferase Towne belastningen ble bygget som tidligere beskrevet [ ,,,0],20]. I korte trekk ble det rekombinante virus som uttrykker luciferase under kontroll av UL99 (pp28) sent promoter dannet ved innsetting av reportergenet mellom US9 og US10 åpne leserammer (ORF) i det Towne genomet. Ekspresjonen av pp28 -luciferase er sterkt aktivert 48-72 timer etter infeksjon (HPI) og er nesten fullstendig hemmet i nærvær av DNA-polymerase-inhibitorer som for eksempel foscarnet og GCV [20]. Vi har nylig rapportert at pp28-luciferase reporter system er følsom, reproduserbar og sterkt korrelert med plakkreduksjon [20]. Den ganciclovir (GCV)-motstandsdyktig stamme ble erholdt fra en pasient med CMV-sykdom. Den har en UL97 mutasjon (H520Q) og en EF
50 på 7,6 mikrometer for GCV. Denne kliniske isolat ble gitt av klinisk laboratorium virologi uten identifikatorer som kan knytte til et bestemt emne. The Johns Hopkins Office of Human Subject Forskning Institutional Review Board besluttet at denne forskningen kvalifisert for fritak.
Cell Culture, virus infeksjon og Anti-virus-analyser
Menneskelige forhudsfibroblaster (HFF) passasje 12 -16 (ATCC, CRL-2088 ™) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Gibco, Carlsbad, CA) i en 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C og brukt til infeksjoner med pp28-luciferase Towne CMV eller GCV-resistent stamme. En dag før infeksjon med pp28-luciferase, 4 x 10
4 HFF-celler ble sådd i hver brønn av 24-brønners vevskulturplater. -Infeksjon ble utført ved multiplisitet av infeksjon av en PFU /celle (MOI = 1). Etter 90 minutters adsorpsjon, ble medium inneholdende virus fjernet og erstattet med DMEM med 4% føtalt bovint serum (Gibco, Carlsbad, CA) inneholdende antivirale forbindelser. Konsentrasjonen av hver forbindelse ble beregnet og justert til volum, slik at det var konstant under hele forsøket.
infiserte og behandlede HFF-celler ble samlet opp 72 hpi og vasket en gang med PBS. Lysatene ble analysert for luciferase og celleviabilitet ved hjelp av en Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI) og CellTiter-Glo Lysende celleviabilitet Assay Kit, henholdsvis på GloMax®-Multi + Detection System (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner.
Menneskelige lungefibroblaster (HEL) passasje 8-12 (ATCC, CCL-137 ™) ble dyrket i DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum. En dag før infeksjon, 3 x 10
5-celler ble sådd ut i hver brønn av 12-brønns vevskulturplater. GCV-resistente CMV ble fortynnet i DMEM til en ønsket konsentrasjon som ga ca. 100 plaques pr brønn og tilsatt til hver brønn i duplikater. Platene ble inkubert i 90 minutter med risting hvert 10 min; Deretter legemidler ble tilsatt, og en metylcellulose overlegg påført til hver brønn. Etter inkubasjon i 21 dager, ble cellene farget med krystallfiolett og plaketter ble tellet under mikroskop ved 40 × forstørrelse.
Anti-kreft celler analysen
HeLa (menneskelig cervikal adenokarsinom), HCT116 (human kolorektalt karsinom) og 1205Lu (human melanoma-celler) (alle fra ATCC) ble opprettholdt i DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum. 12-16 timer før medikamentbehandling, 3 x 10
3 til 5 x 10
3-celler ble sådd ut i hver brønn av 96-brønners vevskulturplater. Legemidler ble fortynnet i DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum og påført til cellene. 72 timer etter medikamentbehandling, 20 ul av MTT-løsning (5 mg /ml i PBS) ble tilsatt til hver brønn, etterfulgt av risting platene ved 150 rpm i 5 minutter og en inkubasjonstid på 4 timer (37 ° C, 5% CO
2). Media ble fjernet, platene ble tørket og hver brønn ble resuspendert i 100 ul MTT formazan /DMSO. Absorbansen av hver brønn ble registrert ved 560 nm på GloMax®-Multi + Detection System (Promega).
Hjelpemiddel Informasjon
Materialer S1.
1) Syntese av Dimer Herding 3-karbamat 800-3. 2) Syntese av Dimer Sulfone 3-karbamat 832-3. 3) Syntese av Dimer Sulfide 4-karbamat 800-4. 4) Syntese av deoksy-artemisinin alkohol 574. 5) Syntese av Monomer Sulfone benzylalkohol Dimethyl karbamat 551.
doi: 10.1371 /journal.pone.0024334.s001 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Michael Forman fra Institutt for patologi, Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, Maryland, for å gi GCV-resistente CMV.
