Abstract
KIF14 plakater (kinesin familiemedlem 14) er en mitotisk kinesin og en viktig onkogen i flere kreftformer. Tumor
KIF14
ekspresjonsnivåer uavhengig er prediktive for dårlig resultat, og i kreftceller KIF14 kan modulere metastatiske adferd ved å opprettholde passende nivåer av celle adhesjon og migrering proteiner i cellemembranen. Dermed KIF14 er en spennende potensiell terapeutisk mål. Forstå KIF14 regulering i kreftceller er avgjørende for utviklingen av effektive og selektive terapi for å blokkere sin tumorigent funksjon (er). Vi har tidligere fastslått at nær 30% av serøse eggstokkreft (OvCa svulster) viser lav-nivå genomisk gevinst, noe som indikerer en mekanisme av
KIF14
overekspresjon i svulster. Vi rapporterer nå på transkripsjonen og epigenetisk regulering av
KIF14
. Gjennom promoter sletting analyser, identifiserte vi en
cis
regulatoriske område som inneholder bindingsseter for SP1, HSF1 og YY1. siRNA-mediert knockdown av disse transkripsjonsfaktorer viste endogen regulering av
KIF14
overekspresjon av
SP1 Hotell og
YY1
, men ikke
HSF1
. Chip eksperimenter bekreftet en berikelse av både SP1 og YY1 binding til endogene KIF14 promoter i OvCa cellelinjer med høy
KIF14
uttrykk. En sterk korrelasjon ble sett i primær serøs OvCa svulster mellom
SP1
,
YY1 Hotell og
KIF14
uttrykk, ytterligere bevis på at disse transkripsjonsfaktorene er viktige aktører i
KIF14
overekspresjon. Hypometylering mønstre ble observert i primær serøs OvCa svulster, noe som tyder på en mindre rolle for arrangøren metylering i kontroll av
KIF14
genuttrykk. miRNA uttrykket analyse fastslått at MIR-93, MIR-144 og MIR-382 hadde signifikant lavere nivåer av uttrykk i primær serøs OvCa svulster enn normalt vev; behandling av en OvCa cellelinje med miRNA etterligner og hemmere spesifikt modulert
KIF14
mRNA nivåer, og peker på potensielle nye mekanismer for
KIF14
overekspresjon i primære svulster. Våre funn viser flere mekanismer KIF14 oppregulering i kreftceller, og tilbyr nye mål for terapi for å redusere KIF14 i tumorer, med sikte på bedre prognose
Citation. Thériault BL, Basavarajappa HD, Lim H, Pajovic S, Gallie BL, Corson TW (2014) Transkripsjonell og epigenetiske regulering av
KIF14
Overuttrykte i eggstokkreft. PLoS ONE 9 (3): e91540. doi: 10,1371 /journal.pone.0091540
Redaktør: Jean-Marc VANACKER, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Frankrike
mottatt: 21 juni 2013; Godkjent: 13 februar 2014; Publisert: 13 mars 2014
Copyright: © 2014 Thériault et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av US Department of Defence Career Development Award; innvilge # OC080083, og Marsha Rivkin Ovarian Cancer Center Scientific Scholar Award. Dette arbeidet ble også støttet delvis av Indiana klinisk og translasjonell Sciences Institute finansiert, delvis av USAs National Institutes of Health, National Center for Advancing Translasjonsforskerne Sciences, klinisk og translasjonell Sciences Award (TR000163, TWC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
KIF14
ble først identifisert som et onkogen og en bidragsyter til malign transformasjon i barndommen kreft retinoblastom [1]. Ligger på kromosom 1q32.1, genomisk gevinst på
KIF14
forekommer hos opptil 50% av retinoblastomene [1] – [3]. Vår gruppe og andre har tidligere vist at KIF14 protein og mRNA blir overuttrykt i flere kreftformer, inkludert eggstokk-kreft (OvCa tumorer) [4] – [10]. Vi rapporterte også at den samlede utfallet av serøse OvCa pasienter kan forutsies basert på
KIF14
mRNA uttrykk nivåer i sine primære svulster. Ytterligere analyse av disse prøvene viste at ekspresjon av
KIF14
mRNA og protein som overskrider nivåene forventes basert på kopiantallet vinning alene, noe som antyder en opp-regulering i transkripsjonen kontroll i kreftceller sammenlignet med deres respektive normale motstykker.
Det er for tiden 45 menneske kinesins klassifisert i 14 forskjellige familier. Hos mennesker
KIF14
er en mitotisk kinesin tilhører den N-3 familien. Selv om cellular funksjon ennå ikke er fullt ut klarlagt,
KIF14
spiller en viktig rolle i gjennomføringen av cytokinese, og kan også fungere i primær cilium [11]. Det interagerer med protein-regulator av cytokinese 1 (PRC1) og citron kinase gjennom bestemte domener for å støtte riktig celledeling [12], [13]. Dempe
KIF14
hjelp siRNA induserer cytokinese svikt som resulterer i multinucleated celler, Aneuploidy, og apoptose [12]. En midlertidig oppsamling av KIF14 proteinet er observert i mitotiske celler, i samsvar med sin funksjon [12]. Vi har nylig vist i brystkreftcellelinjer, direkte interaksjon av KIF14 med Radil, en viktig mediator av Rap1a-mediert integrin innsiden ut signalisering, for derved å styre Radil-Rap1a aktivitet ved cellemembranen og fremme celle adhesjon og migrering [14].
Mens strukturen og funksjonen til andre kinesins er ganske godt forstått, er langt mindre kjent om deres regulering på DNA-nivå. En studie beskrevet rollene til transkripsjonsfaktorer Sp1 og E2F1 i henholdsvis aktivering og undertrykker transkripsjonen av det humane mitotiske cent-assosiert kinesin (MCAK) promoter [15]. Ingen studier har ennå ikke blitt rapportert om
KIF14
. Forstå mekanismen for sin genregulering er avgjørende som
KIF14
fremstår som et viktig mål i kreftbehandling.
Vi rapporterer nå identifisering av en antatt
cis
regulatoriske regionen
KIF14
arrangøren husing bindingsseter for transkripsjonsfaktorer
SP1
,
YY1 Hotell og
HSF1
. Gjennom siRNA knockdown og chip-analyser, viser vi at SP1 og YY1, men ikke HSF1 direkte binde til
KIF14
promoter og kontrollere endogene
KIF14
nivåer i OvCa cellelinjer. Videre har både
SP1 Hotell og
YY1
uttrykk nivåer korrelerer med
KIF14
mRNA uttrykk i grunnskolen serøs OvCa svulster, demonstrere sin potensielle rolle i å opprettholde høye KIF14 nivåer i OvCa kreftceller . Metylering analyse viste at den menneskelige
KIF14
arrangøren er i stor grad hypomethylated i OvCa primære svulster, normal eggstokk vev og cellelinjer, noe som indikerer at metylering er usannsynlig å regulere
KIF14
overekspresjon innen OvCa svulster. Imidlertid kan en differensial metylering mønster eksisterer i OvCa svulster som uttrykker svært høy KIF14.
miRNA uttrykk analyse av primære OvCa svulster og cellelinjer avdekket tre mulige regulatorer (MIR-93, MIR-144 og MIR-382) av
KIF14
uttrykk som har dokumentert roller i tumorigenesis i kreftceller. Vi bestemt at disse kandidat mirnas kan direkte modulere
KIF14
mRNA uttrykk, noe som indikerer deres betydning i å opprettholde høye KIF14 kreft nivåer. Våre resultater avsløre en kompleksitet av reguleringsmekanismer kjøring
KIF14
overekspresjon i OvCa svulster, og understreker viktigheten av å forstå
KIF14
regulering til slutt målrette dette genet for terapeutisk effekt.
materialer og metoder
Bygging av luciferaserapportørplasmid Plasmider
Seksten forskjellige lengder av
KIF14
promoter (548 bp, 966 bp, 1514 bp, 1666 bp, 1787 bp, 1898 bp, 2032 bp, 2150 bp, 2245 bp, 2327 bp, 2366 bp, 2401 bp, 2466 bp, 2536 bp, 2898 bp, 4555 bp) alle deler felles sekvensene ved sin proksimale ende ble amplifisert ved polymerasekjedereaksjon (PCR) fra genomisk DNA av sunn hinnen ved hjelp KOD Hot start-DNA Polymerase (Novagen) (tabell S1). Arrangøren fragmenter ble subklonet inn StrataClone ™ Blunt PCR Kloning Vector PSC-B (Stratagene) og bekreftet for riktig innsetting og orientering av restriksjonskutting. PCR-produktet ble skåret ut ved hjelp av Kpn1 /Sma1 restriksjonsseter og innført i pGL3-Basic vektor (Promega) ved komplementære områder oppstrøms av luciferasegenet genererer reporteren konstruerer pGL3-548, pGL3-966, pGL3-1514, pGL3-1666, pGL3 -1787, pGL3-1898, pGL3-2032, pGL3-2150, pGL3-2245, pGL3-2327, pGL3-2366, pGL3-2401, pGL3-2466, pGL3-2536, pGL3-2898, og pGL3-4555. Sekvenser av alle 16 konstruksjoner på linje med referansesekvensene fra NCBI nettside. Den pRSV-luciferase reporter plasmid ble vennlig levert av Dr. A. Schimmer, Ontario Cancer Institute.
Cell Culture
SKOV3 (en slags gave fra Dr. Mark Nachtigal, University of Manitoba) [ ,,,0],16] og HeLa-celler (ATCC) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin /L-glutamin (P /S /G) (Invitrogen). OvCa 429 celler (Dr. Mark Nachtigal) [16] ble dyrket i alfa-MEM inneholder 10% FBS og P /S /G. WERI-RB1 retinoblastom-celler (positiv kontroll for Sp1 binding) ble dyrket i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) inneholdende 10% FBS (PAA Laboratories), P /S /G, 10 pg /ml insulin og 55 pM β-merkaptoetanol. Cellekulturer ble holdt ved 5% CO
2 med fuktighet i en 37 ° C inkubator. Cellelinje identitet ble bekreftet av kort tandem repeat profilering.
Transfeksjon av Reporter konstruerer og siRNA
tryptinisert celler ble sådd med en tetthet på 5 × 10
4 celler /ml. 24 timer etter såing, like store mengder (0,5 ug) av både reporter og cytomegalovirus-β-galaktosidase (pCMV-β-gal, Promega) konstruksjoner ble kotransfektert inn i triplikat 12-brønners plater ved bruk av Gene Juice (Novagen). For å evaluere den endogene effekten av transkripsjonsfaktor knockdown på
KIF14
nivåer, et sett av 3 siRNAs (Sigma Aldrich) for
HSF1
,
SP1
, og
YY1
ble transfektert til et beløp på 0,5 nmol inn i 60 mm skåler. Target sekvenser for hver siRNA er oppført i Tabell S2. Transfections ble utført i tre eksemplarer i henhold til produsentens instruksjoner og gjentas minst tre ganger.
Luciferase og β-galaktosidase analysen
Celler som ble transfektert med reporter og pCMV-β-gal konstruksjoner ble høstet 24 timer etter transfeksjon. Cellelysater ble fremstilt og analysert for luciferase-aktivitet ved hjelp av Luciferase Assay System (Promega) i henhold til den protokoll. Luciferase-aktiviteten ble normalisert til p-galaktosidase-aktivitet (målt ved hydrolyse av den kolorimetriske substratet ONPG [
O
nitrofenyl β-D-galaktopyranosid], Sigma) og uttrykkes som en relativ prosentandel av pRSV-Luc-kontroll.
kliniske prøver
Tjueseks seks~~POS=HEADCOMP Dypfryst OvCa tumorprøver, ti Dypfryst normale ikke-neoplastiske eggstokkene fra pasienter som gjennomgår oophorectomy for ikke-onkologiske tilstander og fire normale svangerskap utenfor epitel vev ble oppnådd fra universitetet helsenett (uhn) Biobank. Den uhn forskningsetikk Board godkjent studiet av vevsprøver og tilknyttede kliniske data (# 08-0884-TE), og alle vev ble banked med skriftlig informert samtykke. Kliniske data knyttet til uhn Biobank prøvene ble vurdert av en gynekologisk onkolog og gynekologisk patolog for å sikre dataintegritet og kvalitet, og alle uhn Biobank vev (ved H E beiset lysbilder) ble anmeldt av en gynekologisk patolog for å sikre prøvene inneholdt 80 % kreftceller.
real-time PCR
sytti-to timer etter transfeksjon med siRNA, ble cellelinjer høstet og total RNA isolert av TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. OvCa tumor og normal ovarie og tubene epitel-RNA ble også isolert ved hjelp av TRIzol Reagens som tidligere beskrevet [8]. Første-tråd cDNA ble fremstilt fra 1 ug av totalt cellulært RNA med 100 um tilfeldige heksamerprimere, 20 U RiboLock RNase inhibitor (Fermentas), og 200 enheter Superscript II revers transkriptase (Invitrogen) i et sluttvolum på 20 mL. 1 mL av syntetiserte cDNA ble lagt til 1X TaqMan PCR mester mix (ABI), og 1X TaqMan Gene Expression analyse primer-probe mix for
KIF14 plakater (Hs00978216_m1),
SP1 plakater (Hs00916521_m1),
YY1 plakater (Hs00231533_m1), og
HSF1 plakater (Hs01027608_g1). Mener uttrykket av tre husholdningsgener ble brukt som en endogen kontroll:
TBP plakater (Tata-box binding protein, Hs_99999910_m1),
HPRT plakater (hypoxantin fosforibosyl transferase, Hs99999909_m1) og
GAPDH
(glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, Hs99999905_m1). Triplikate reaksjoner ble utført for hvert gen og hver prøve, og PCR utført ved hjelp av SDS-7900HT systemet (ABI) som beskrevet [8]. SDS 2.1-programvare (ABI) ble brukt til å beregne ΔΔCt relative uttrykk verdier, normalisert til endogene kontroll gener og i forhold til enten vektor kontroll (for cellelinje siRNA transfections) eller uttrykk for normal eggstokk og tubal epitel vevsprøver (for vev målinger).
Western blot analyse
syttito timer etter transfeksjon siRNA, ble cellene høstet og lysert med buffer inneholdende 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 1% Triton X-100, og den protease-inhibitorer aprotinin, leupeptin, og phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF). Totalt cellulært protein ble kvantifisert ved Bradford-analyse (Bio-Rad). 30 ug ble applisert på en 4-12% gradient SDS-PAGE-gel prefabrikerte (Lonza) og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran og blokkert med 5% BLOTTO (BioRad) i Tris-bufret saltvann-0,05% Tween-20 ( TBST). Primære antistoffer mot KIF14 (Bethyl), SP1, YY1 og HSF1 (Abcam) og β-tubulin (Sigma) ble brukt for å påvise endogent protein uttrykk. Pepperrotperoksidase-merket sekundære antistoffer (Chemicon) ble oppdaget ved hjelp av en chemiluminescence reagens (Denville) og inkuberes med fotografisk film (Denville). Signalintensitetsmålinger ble beregnet ved hjelp av Photoshop CS3.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) Analyse
chip analyser ble utført med Imprint® Chromatin Immunpresipitasjon Kit (Sigma) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, en x 10
5-celler ble dyrket, og de protein-DNA komplekser tverrbundet med 1% formaldehyd (sluttkonsentrasjon), etterfulgt av kjernefraksjonering og DNA-skjær via ultralydbehandling. Immunoutfellinger ble utført i 90 minutter ved RT med antistoffer mot Sp1, YY1, HSF1 (Abcam), RNA polymerase II (positiv kontroll) og IgG (negativ kontroll). Tverrbindingene ble reversert, DNA ble ekstrahert og ble brukt for både endepunkt og sanntids-PCR. Endpoint PCR ble utført i 25 ul reaksjoner med KOD Hot Start-DNA Polymerase (Novagen) og hensiktsmessig utformet primerpar (target promotorsekvens: Spiss: tta CAA TGT gaa GTC ttc gat gta, Omvendt: CTC tac TCC, cac ccc gc; RNA Pol II målsekvens: hGAPDH-Forward: CAA ttc ccc atc TCA GTC gt; hGAPDH-Revers: tag tag CCG GGC CCT handling tt, 246 bp). PCR-betingelsene var som følger: 95 ° C i 2 minutter etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 58 ° C i 30 sek, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sekunder, og deretter en endelig forlengelse periode på 72 ° C i 10 min. Produktene ble gjort synlige ved hjelp av agarosegel-elektroforese. Signal intensitetsmålinger ble beregnet ved hjelp av Photoshop CS3. Sanntids PCR ble utført i triplikat ved anvendelse av 1 pl chip DNA per reaksjon, sammen med 1 x TaqMan Master Mix (ABI), 500 nM hver primer og 250 nM sonde. Primere var Forward: tga cac CCA CTT CAA cga gg og bakover: TCT CTG aat GCT GGA CTC gc, og sonden var cac GCT tta GCA gaa ccc gag gag, merket med FAM og ZEN drikk (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA). Reaksjonene ble kjørt ved hjelp av standard parametere på en ViiA7 instrument (Life Technologies). Ct-verdier ble normalisert til IgG prøver og relative mengden (RQ) beregnet i henhold til RQ = 2
-ΔCt.
miRNA cDNA syntese og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ekstraksjon var utført som beskrevet ovenfor. En kommersielt tilgjengelig miRNA cDNA syntese kit (TaqMan® mikroRNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems) ble brukt til å reversere transkribere kandidat mirnas med spesifikke RT primere (TaqMan® miRNA Analyser, Applied Biosystems). Sekvensspesifikke analyser (TaqMan® real-time PCR-analyser, Applied Biosystems, Tabell S3) ble brukt for å oppdage modne kandidat mirnas fra primær svulstvev ekstrakter.
RNU44
, et lite ikke-kodende RNA med bred og konstant vevsfordeling (Applied Biosystems), ble anvendt som endogene kontroll. Triplikate reaksjoner ble utført for hvert gen og hver prøve, og PCR utført ved hjelp av SDS-7900HT systemet (ABI) som beskrevet [8]. SDS 2.1-programvare (ABI) ble brukt til å beregne ΔΔCt relative uttrykk verdier, normalisert til endogen kontroll (
RNU44
) og i forhold til uttrykk for normal eggstokk og tubal prøver epitelvev (for svulst vev målinger) eller IOSE celler (for OvCa cellelinjer).
miRNA etterligner og hemmere
SKOV3 celler i 12-brønners plater ble transfektert med 50 nm miR93, miR144 og miR382 etterligner eller hemmere eller tilsvarende ikke-koding kontroll ligne eller hemmer (Applied Biosystems) med 3 mL av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) reagens i henhold til produsentens anvisninger. Etter 72 timers transfeksjon, ble total RNA isolert og cDNA syntetisert som beskrevet ovenfor. Ekspresjonsnivåene av KIF14 og mirnas av interesse ble analysert som ovenfor, med qPCR utført ved å anvende en Applied Biosystems ™ Vlla 7 sanntid PCR system. De relative uttrykk verdier (RQ) av KIF14 eller mirnas normalisert til kontroll endogene gener og i forhold til å få tak behandling ble beregnet ved hjelp av Vlla ™ 7 versjon 1,2 software.
Metylering analyse
Genomisk DNA ble isolert fra primære OvCa tumorvev og normal eggstokk kontroller som tidligere beskrevet [8]. Genomisk DNA (200 ng) ble endret og renset ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig bisulfitt modifikasjon kit (Imprint® DNA Modification Kit, Sigma) i henhold til produsentens instruksjoner. En CpG island ble identifisert (https://cpgislands.usc.edu/) innen 4500 bp
KIF14
promoter-regionen (-2371 til -1129) (figur S1 A), og metylering-spesifikke primere (~120 bp) mot den største CpG øy i
KIF14
arrangøren bruke online programvare Methprimer ble utformet (https://www.urogene.org/methprimer/) (figur S1B). Primer sekvenser var som følger: metylert spesifikke: Spiss: att TAA agg ggg tta agt ttt acgt; Omvendt: gat aat TAA handle CCG ata acc GTC; Unmethylated spesifikke: Spiss: att TAA agg ggg GTt agt ttt atgt; Omvendt: CAA TAA tta aac TCC aat aac CATC. En fjerdedel av det rensede bisulfit-behandlet DNA (5 ul av en 20 pl eluat) ble anvendt ved metylering PCR-reaksjonen. End-point PCR reaksjoner ble utført i 25 mL endelig volum med Maxima Hot Start-Taq polymerase (Fermentas). PCR-betingelsene var som følger: 94 ° C i 3 minutter etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 30 sek, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sekunder, og deretter en endelig forlengelse periode på 72 ° C i 10 min. Produkter (~120 bp) ble visualisert ved hjelp av agarosegel-elektroforese. Densitometry ble utført på gråtonebilder ved hjelp av Image J. Verifikasjon av bisulfitt konvertering av DNA ble utført med umodifiserte calponin spesifikke primere (figur S2) som beskrevet [17].
Statistical Analysis
Expression verdier (luciferase aktivitet, mRNA, miRNA eller protein uttrykk) ble vurdert mellom normale vev kontroller og OvCa tumorvev, eller kontroller og behandlede grupper som bruker sammenkoblede eller uparede t-tester. KIF14 uttrykk etter miRNA inhibitor /mimic behandling ble analysert ved en-veis ANOVA. Med mindre annet er angitt, ble alle statistiske analyser utført ved bruk av Graph Pad Prism 4.0. Sammenhenger mellom
KIF14
få vs.
KIF14
ingen gevinst kategorier og
SP1
,
YY1 Hotell og
HSF1
mRNA uttrykk ble analysert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient (r).
Resultater
Identifisering av en
KIF14
cis regulatorisk region i eggstokkreft cellelinjer
en 4500 bp regionen genomisk DNA umiddelbart oppstrøms av den menneskelige
KIF14
transkripsjonen starter nettstedet ble forsterket fra normal menneskelig DNA, og delesjons reporter ble det gjennomført analyser ved kloning sekvensielt mindre regioner av
KIF14
promoter inn i pRSV-Luc promoter-regionen. Luciferase-aktivitet ble målt i OvCa429, SKOV3 og HeLa-celler, og promoter-aktivitet ble beregnet i forhold til pRSV-Luc uttrykket (fastsatt til 100%). Hele promotorområde-konstruksjonen (pGL3-4555) viste luciferaseaktivitet nær den for den positive kontroll (pRSV-Luc). Ett meget aktive region ble identifisert mellom -2366 og -2245 bp, noe som viser tilsvarende aktivitet til full-promoteren konstruksjonen, men betydelig mer luciferaseaktiviteten i forhold til alle andre delesjons- konstruksjoner for alle tre cellelinjer (P 0,05, figur 1). Bioinformatiske analyse av denne aktive regionen gjennom online analyse programvare (Genomatix) identifisert antatte transkripsjonsfaktor bindingssteder for
SP1
,
YY1 Hotell og
HSF1 plakater (figur 1), noe som tyder på tilstedeværelsen av en potensiell
cis
regulerende område i
KIF14
promoter.
Arrangøren sletting konstruksjoner smeltet til Luciferase ble testet for aktivitet i HeLa, SKOV3 og OvCa429 celler. pRSV-Luc, positiv kontroll, 0, tom vektor kontroll. Tallene er basepar i forhold til transkripsjonsstartsetet (0). Bioinformatiske analyse (Genomatix) av de mest aktive regionen i
KIF14
promoter (-2366 til -2245) identifiserte mulige bindingsseter for transkripsjonsfaktorer YY1, HSF1 og SP1. Spesifikk transkripsjonsfaktor gjenkjenningsseter er understreket, og plass i sekvens betegner plasseringen av sletting konstruksjoner. N = 3, * Betydningen på
P
0,05, uparet t-test.
P
= 0,01 (HeLa);
P
= 0,01 (SKOV3);
P
= 0,03 (OvCa429).
SP1 og YY1 endogent regulere KIF14 uttrykk i OvCa cellelinjer
Vi testet om disse transkripsjonsfaktorene påvirkes
KIF14
mRNA uttrykk av siRNA-mediert knockdown av endogen
SP1
,
HSF1 Hotell og
YY1
i SKOV3 og OvCa429 celler. Forbigående knockdown resulterte i en betydelig reduksjon av transkripsjonsfaktor (
SP1
,
HSF1
,
YY1
) mRNA (Figur 2A, B). Mens knockdown av
HSF1
hadde ingen signifikant effekt på
KIF14
genekspresjon,
SP1 Hotell og
YY1
knockdown resulterte i betydelig redusert
KIF14
mRNA, noe som tyder på at både SP1 og YY1 fungere som forsterkere av
KIF14
transkripsjon. Som svar på
SP1 Hotell og
YY1
knockdown, en nedgang i transkripsjonsfaktor protein uttrykk og tilhørende KIF14 protein ble bekreftet via immunoblotter (figur 3) i SKOV3 celler. Mens HSF1 proteinnivåer ble redusert som svar på knockdown, ble ingen signifikant endring i KIF14 proteinekspresjon sett. Lignende resultater ble sett for OvCa429 celler (data ikke vist), noe som indikerer at
SP1 Hotell og
YY1
kan kontrollere uttrykk for
KIF14
i OvCa cellelinjer. Reduksjonen i KIF14 mRNA og protein ekspresjon som reaksjon på Sp1 knockdown var mindre enn med YY1 knockdown, og kan sannsynligvis være relatert til effektiviteten av transkripsjonsfaktor knockdown (figur 2A, B og figur 3A, B). Reduksjonen i
KIF14
mRNA og protein var mer uttalt i respons til
YY1
knockdown, noe som tyder på at YY1 kan være en betydelig aktør i reguleringen av
KIF14
overekspresjon i disse celler.
siRNA knockdown av endogen
SP1 plakater (oransje),
HSF1 plakater (grønn), og
YY1 plakater (rød) transkripsjonsfaktorer, og måling av deres mRNA uttrykk sammen med tilsvarende
KIF14
mRNA nivåer (blå) via real-time PCR i A SKOV3 og B OvCa429 celler. Y-akser: normalisert mRNA uttrykk i forhold til Mock. GL2, kontroll siRNA; N = 3, * Betydningen på
P
0,05, uparet t-test. Tre forskjellige siRNA-molekyler (A, B, C) ble anvendt for å slå ned hvert gen. P-verdier for panel A (SKOV3 celler):
P
= 0,02 for SP1 uttrykk (oransje) med SP1 sirnas A, B og C;
P
= 0,03 (siRNA-A),
P
= 0,047 (siRNA-B),
P
= 0,04 (siRNA-C) for KIF14 uttrykk (blå) .
P
= 0,001 for HSF1 uttrykk (grønn) med HSF1 sirnas A, B og C;
P
= 0,23 (siRNA-A),
P
= 0,12 (siRNA-B),
P
= 0,4 (siRNA-C) for KIF14 uttrykk (blå) .
P
= 0.01 for YY1 uttrykk (rød) med YY1 sirnas A, B og C;
P
= 0,006 for KIF14 uttrykk (blå) med YY1 sirnas A, B og C. P-verdier for panel B (OvCa429 celler):
P
= 0,03 for SP1 uttrykk (oransje) med SP1 sirnas A, B og C;
P
= 0,05 (siRNA-A),
P
= 0,04 (siRNA-B),
P
= 0,045 (siRNA-C) for KIF14 uttrykk (blå) .
P
= 0,003 for HSF1 uttrykk (grønn) med HSF1 sirnas A, B og C;
P
= 0,31 (siRNA-A),
P
= 0,45 (siRNA-B),
P
= 0,39 (siRNA-C) for KIF14 uttrykk (blå) .
P
= 0,02 (siRNA-A),
P
= 0,01 (siRNA-B),
P
= 0.01 for YY1 uttrykk (rød);
P
= 0,02 (siRNA-A),
P
= 0,001 (siRNA-B),
P
= 0,006 (siRNA-C) for KIF14 uttrykk (blå) .
En siRNA knockdown av endogen SP1 (oransje), HSF1 (grønn), og YY1 (rød) transkripsjonsfaktorer, og måling av deres protein uttrykk sammen med tilsvarende KIF14 protein nivåer (blå) via immunoblot i SKOV3 celler. x-aksen: normalisert protein uttrykk i forhold til Mock. B Representant immunoblot av KIF14 og transkripsjonsfaktor uttrykk. Tallene representerer normaliserte uttrykk verdier for forsøket vist. Lignende resultater ble sett med OvCa429 celler. GL2, kontroll siRNA; N = 3; *,
P
0,05 for transkripsjonsfaktor uttrykk; #
P
0,05 for KIF14 uttrykk, uparet t-test.
P
verdier for panel A (SKOV3 celler):
P
= 0,009 (siRNA-A),
P
= 0,003 (siRNA-B),
P
= 0,006 (siRNA-C) for SP1 uttrykk (orange);
P
= 0,005 (siRNA-A),
P
= 0,007 (siRNA-B),
P
= 0,004 (siRNA-C) for KIF14 uttrykk (blå) .
P
= 0.01 for HSF1 uttrykk (grønn) med HSF1 sirnas A, B og C;
P
= 0,54 (siRNA-A),
P
= 0,65 (siRNA-B),
P
= 0,41 (siRNA-C) for KIF14 uttrykk (blå) .
P
= 0,001 for YY1 uttrykk (rød) med YY1 sirnas A, B og C;
P
= 0,01 (siRNA-A),
P
= 0,02 (siRNA-B),
P
= 0,005 (siRNA-C) for KIF14 uttrykk (blå) .
For å verifisere om SP1 og YY1 kunne knytte direkte med
KIF14
promoter, kromatin immunoutfelling (chip) analyser ble utført i SKOV3, OvCa429 og HeLa-celler. Vi fant at både SP1 og YY1, men ikke HSF1 viste en mye høyere bindende affinitet til
KIF14
promoter region enn IgG kontroll (høyere relative uttrykk verdier, figur 4). OvCa429 celler viste størst anrikning av binding til både Sp1 og YY1 (over 10 ganger, figur 4A, B), mens SKOV3 og HeLa-celler som viste mer beskjeden anrikning (i gjennomsnitt fire ganger, figur 4A, B). Binding av HSF1 til KIF14 arrangøren var mye mindre uttalt (i gjennomsnitt to ganger for alle cellelinjer, figur 4C). Berikelse i SP1 og YY1 binding ble også vist via endepunkt PCR (figur S3). Disse resultatene bekrefter våre mRNA og protein uttrykk resultater ved å vise at både SP1 og YY1 kan binde direkte til
KIF14
promoter. Kombinert, disse dataene indikerer at SP1 og YY1 kan endogent regulere
KIF14
uttrykk i OvCa cellelinjer.
chip analyser av endogen YY1, SP1 og HSF1 fulgt av real time PCR med
KIF14
promoter-regionen (-2300 til -2133) i cellelinjer SKOV3, OvCa429, og HeLa forhold til IgG (negativ kontroll). Verdier representerer gjennomsnittlig mengde promoter regionen produkt i forhold til IgG kontroll. Feilfelt representerer standardavvik tredoble analyser.
SP1 og YY1 overekspresjon korrelerer med KIF14 overekspresjon
Vi har tidligere dokumentert genomisk gevinst på
KIF14
i opp til 30 % av primær OvCa svulster som korrelerer med svært høy overekspresjon av
KIF14
mRNA (
KIF14
HIGH) [8]. Disse dataene antyder at genomisk gevinsten er en mekanisme som
KIF14
er overuttrykt i disse svulstene. For å avgjøre om
KIF14
overekspresjon i OvCa svulster kan også være knyttet til transkripsjonsregulering, målte vi mRNA uttrykk for
SP1
,
YY1 Hotell og
HSF1
i en undergruppe av OvCa tumorvev med (15 prøver) og uten (50 prøver)
KIF14
genomisk gevinst. I OvCa svulster uten genomisk gevinst (50), dikotomisert vi prøvene inn i to grupper basert på median uttrykk, i enten
KIF14
HIGH eller
KIF14
Lav grupper, som vi har tidligere rapportert [8]. Mange av de 19
KIF14
HØYE OvCa svulster uttrykt betydelig høyere nivåer av
SP1 Hotell og
YY1
mRNA (Figur 5) enn de med
KIF14
LOW overekspresjon (31), som indikerer mulige roller for SP1 og YY1 å opprettholde høye
KIF14
nivåer i svulster.
HSF1
mRNA nivåene var lik i alle OvCa svulster, og dermed mindre sannsynlighet for å være viktig i å regulere
KIF14
mRNA. Gjennomsnittlig
YY1
uttrykk nivå i grunnskolen OvCa svulster er mye høyere enn gjennomsnittet
SP1
uttrykk nivå; sammen med
YY1
knockdown data i cellelinjer (figur 2 og 3), disse resultatene tyder på at YY1 er en viktig regulator av KIF14 overekspresjon i OvCa svulster. Til støtte for dette, ble en sterk sammenheng sett mellom
KIF14 Hotell og
SP1
eller
YY1
uttrykk, mens ingen eksisterte for
HSF1 plakater (tabell 1 og Figur S4D-F). Svulster med KIF14 genomisk gevinst viste ingen transkripsjonsfaktor korrelasjon (tabell 1 og figur S4A-C), som bekrefter at genomisk gevinst er mekanismen kontrollere
KIF14
overekspresjon i disse svulstene. Interessant, en andel (ca. 40%) av
KIF14
HØYE svulster viste
SP1 Hotell og
YY1
uttrykk nær normale vev nivåer (figur 5), videre impliserer andre biologiske mekanismer for potensielt styre
KIF14
overekspresjon i OvCa svulster.
Kvantitativ mRNA uttrykk analyse av primære OvCa svulster med
KIF14
HIGH (rød) og <
