Abstract
SSX er en transkripsjonsfaktor med unnvikende onkogene funksjoner uttrykt i en rekke humane tumorer av epitelial og mesenchymale opprinnelse. Det har ført til betydelig interesse som et mål for kreftbehandling siden det utløser humorale responser og viser begrenset uttrykk for kreft, spermatogoniene og stamceller. Her undersøkte vi de onkogene egenskaper SSX ved å ansette en RNA-interferens å slå ned endogen uttrykk for SSX i melanom og osteosarcom cellelinjer. Uttømming av SSX ekspresjon resulterte i redusert spredning med celler akkumulert seg i G1 fasen av cellesyklusen. Vi fant at den vekstfremmende og overlevelses egenskaper SSX medieres delvis skjønt modulering av MAPK /Erk og Wnt signalveier, ettersom SSX tie hemmet Erk-mediert signalisering og transkripsjon av cMYC og Akt-1. Vi fant også at SSX danner en forbigående kompleks med β-catenin ved G1-S-fasegrensen resulterer i endrede ekspresjon av β-catenin målgener som E-cadherin, snegl-2 og vimentin, er involvert i epitel-mesenchymale overganger. Viktigere taushet av SSX uttrykk i
in vivo
betydelig svekket vekst av melanom tumorxenotransplantater. Tumor biopsier fra SSX forstummet svulster som vises redusert cyclin A farging, indikerer lav spredning og overveiende cycloplasmic β-catenin forhold til SSX uttrykker svulster. Denne studien viser en tidligere ukjent funksjon av SSX, at som et onkogen og som en svulst mål for utvikling av nye kreftmedisiner
Citation. D’Arcy P, Maruwge W, Wolahan B, Ma L, Brodin B (2014) Oncogene Funksjoner av kreft-testikler Antigen SSX på spredning, overlevelse, og signalveier av kreftceller. PLoS ONE 9 (4): e95136. doi: 10,1371 /journal.pone.0095136
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 17 september 2013; Godkjent: 24 mars 2014; Publisert: 30 april 2014
Copyright: © 2014 D’Arcy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det svenske Barn Cancer Foundation, Lillian Sagens och Curt Ericssons Forskningsstiftelse og Stockholm Cancer Foundation til Bertha Brodin. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
SSX
ble først identifisert som en del av
SS18 /SSX
fusjonsgenet i synovial sarkom [1] og som melanom forbundet tumor antigen HOM-Mel40 [2] . Den består av en familie på ni, svært homologe gener organisert i klynger på X-kromosomet med produkter som er klassifisert som kreftfrem testis antigener basert på deres begrenset uttrykk i svulster og testikler. I normale celler som har SSX ekspresjon ble funnet i spermatogoniene [3], [4], mesenchymale stamceller [5]. Uttrykket av SSX familiemedlemmer i svulster har blitt grundig undersøkt, og det har vist seg at SSX1, SSX2, SSX4 og SSX5 er uttrykt uavhengig eller samtidig ofte viser utbredt, spredt eller fokale uttrykk mønstre i svulster i epitel, blodkreft, nevrale og mesenchymale . opprinnelse [3], [6] – [8]
proteinet er rikt på ladede aminosyrer [9], og inneholder to såkalte repressor-domener som undertrykker transkripsjon
in vitro
; en Krüppel tilhørende boks lokalisert ved N-terminus, og et sterkere repressor domene (RD) ved den C-terminale ende [10], [11]. I celler, har SSX et granulært uttrykksmønster og lokaliserer i kjernen og cytoplasma [5], [12]. Direkte interaksjon av SSX med DNA er ikke påvist, det antas derfor at SSX undertrykke transkripsjon ved å danne komplekser med DNA-bindende proteiner. Til støtte for denne modellen både SSX og SS18 /SSX fusjonsgenet produktet er blitt vist å interagere med medlemmer av polycomb repressoren komplekset BMI-1 og Ring 1 [13], og kjerne histoner [14] tyder på at SSX kan kontrollere ekspresjonen av gener som regulerer celledifferensiering. Andre proteiner som samhandler med SSX er Ras-lignende GTPase bindende protein RAB3IP, atom protein SSX2IP [15], og LIM homeobox protein LHX4 [16].
Siden den ble oppdaget som en kreft-testis antigen, den immunterapeutiske målretting av SSX har hevet stor interesse som et anti-kreft-strategi på grunn av dets immunogenisitet [2], [3], begrenset tumor uttrykk, og korrelasjon mellom SSX ekspresjon og sykdomsprogresjon [8], [17], [18] . T-celle cytotoksiske responser har blitt generert
in vitro
mot SSX epitoper [19] – [21], men valideringen av SSX som et terapeutisk mål
in vivo
har ikke blitt rapportert. I den foreliggende undersøkelsen har vi vurdert rollen til SSX i formidling cellevekst og overlevelse av kreftceller, i
vitro Hotell og
in vivo
, og identifiserte vekst signalveier SSX uttrykk.
Resultater
SSX2 fortrinnsvis Uttrykt ved metastaserende melanom skader og cellelinjer utvunnet, men ikke i normale celler
Vi undersøkte uttrykk for SSX1 å SSX5 i 12 metastatisk melanom lesjoner, 9 tidlig passert melanomcellelinjer, normale humane epitelceller melanocytter (NHEM) og humane diploide fibroblaster (HDF) ved hjelp av en sekvense validert RT-PCR-metoden beskrevet tidligere [5]. I likhet med andre publiserte studier fant vi at flere SSX transkripsjoner ble samtidig uttrykt i alle melanomer og melanom cellelinjer undersøkt. Interessant SSX2 ble påvist i nesten alle melanoma vev og avledede cellelinjer (95%) i forhold til SSX4 (57%), SSX1 (38%), SSX5 (33%) og SSX3 (19%) ekspresjon. Ingen av SSX medlemmer ble oppdaget i normale menneskelige epitelceller melanocytter (NHEM) eller i normale humane diploide fibroblaster (HDF) (figur 1). Sekvensen av primerne anvendt for deteksjon av SSX-1 til SSX-9 og ekspresjon av SSX i osteosarkomer cellelinjer, inkludert den linjen som brukes i denne undersøkelsen SAOS-2 er vist i figur S1.
SSX ekspresjon var analysert ved hjelp av en nestet RT-PCR-metode tidligere beskrevet ved anvendelse av primere som gjenkjenner SSX1 til SSX 9 cDNA. Ferske biopsier ble hentet fra metastatiske lesjoner av melanom pasienter. Den Dallas melanomcellelinje som uttrykker høye nivåer av SSX1 til SSX5 ble brukt for RNAi studier. NHEM: normale menneskelige epiteliale melanocytter, HDF. Humane diploide fibroblaster
Den Betinget stanse av SSX Hemmer Tumor Cell Proliferation ved å blokkere oppføring av tumorceller i S-fase
For å få en innsikt i funksjon av SSX i tumorceller, til taushet vi SSX i melanomcellelinje som uttrykker Dallas SSX1 til SSX5 (figur 1) ved bruk av plasmider for både stabil og doksycyklin betinget ekspresjon av shRNA-molekyler som målretter SSX1-9 transkripter (figur 2A og figur S2) som beskrevet i materiale og metoder.
A) grafisk fremstilling av shRNA-sekvensen (som er komplementær til SSX1 til SSX9) ligert inn i shRNA vektorer for stabil og doksycyklin reguleres shRNA uttrykk (se materiale og metoder). B) Western blot viser SSX uttrykk i kontroll-shRNA og SSX-shRNA transfekterte celler 24 timer etter doksycyklin tillegg til kultur medium. C) Celle koloni kvantifisering i kontroll og SSX-shRNA transfektert DFW celler dyrket i nærvær av doksycyklin i 8 dager. D) celleproliferasjon kurver bestemmes ved å telle antallet levende celler i kontroll og SSX stillhet kulturer ved hjelp av trypanblått-farving. E) S-fase cellesyklusprogresjon bestemmes av BrdU-inkorporering i en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS). F) Prosent av celler i G1, S og G2 faser av cellesyklus i kontroll og SSX shRNA slått ned DFW celler i løpet av 96 timer perioden.
Betinget stanse av SSX ble indusert ved tilsetning av doksycyklin i mediet, og resulterte i en signifikant nedgang i SSX protein etter 24 timer (figur 2B). Celleviabilitet tellinger ved hjelp av trypanblått-eksklusjons celler viste tilstedeværelse av levedyktige, men ikke-prolifererende celler i nærvær av doksycyklin som indikerer at SSX ekspresjon er nødvendig for cellevekst (figur 2D). For å undersøke gyldigheten av denne observasjonen vi også utført siRNA knockdown av SSX uttrykk i to ekstra osteosarcom cellelinjer, U2-OS og Saos-2, ved hjelp av RNAi molekyler rettet mot SSX1-9, eller bestemt for SSX1 og SSX2. I likhet med tidligere resultater SSX uttømming resulterte i redusert spredning sammenlignet med kontroll siRNA som indikerer at den observerte fenotype er en bona fide effekt av SSX knockdown og ikke på grunn av off-target effekter (fig S2). I klonogene analyser, ved å stanse all SSX i DFW tumorceller resulterte i en nedsatt kolonidannelsen som observeres av en fire gangers nedgang i antall kolonier i celler dyrket i nærvær av doksycyklin i 14 dager sammenlignet med kontroller (figur 2C). Cellesyklusanalyse av celler i DFW etter tilsetning av doksycyklin viste at cellene ikke klarte å gå inn i S-fasen av cellesyklus (figur 2D). Prosentandelen av celler i S-fase falt fra 50% (ved 0 og 24 timer) til 5% (ved 72 og 96 timer) sammen med en samtidig akkumulering av celler i G1 fase, en indikasjon på en feil i cellesyklusprogresjon ( Figur 2F). For å bekrefte denne effekten av SSX uttrykk på S-fasen oppføring, vi synkronisert villtype (SSX +) og SSX slått ned DFW celler i G1 /S-fasen ved å dobbelt tymidin blokk og slipper inn vanlige FBS inneholder medium. Control (SSX +) DFW celler raskt gått fra G1 til S-fase 4 til 10 timer etter løslatelse fra tymidin blokk. I motsetning til dette SSX-knockdown-celler ikke kunne traversere G1 /S fasegrensen, med celler gjenværende arrestert i G1 fasen (figur 3A). I samsvar med disse observasjoner, nivåer av cyklin E, regulerings komponenten av cyclin E-CDK2 kompleks og en nøkkel regulator av G1 og S-faseprogresjon, ble redusert i parallell til nedregulering av SSX. (Figur. 3B).
Control (SSX +) og forstummet (SSX-) DFW melanomceller ble synkronisert i G1 /S-fasen ved å dobbelt tymidin blokade og utgitt i normal medium som beskrevet i materialer og metoder. A) opprettelse av cellene i S-fasen (S) ble analysert ved hjelp av kvantifisering av DNA-innhold ved hjelp av propidiumjodid (PI) inkorporering og et fluoriserende aktivert cellesorterer FACS. B) Western blot viser tidsavhengig uttrykk for SSX og cyclin E i kontroll og SSX forstummet (+ Dox) DFW celler. Celler ble synkronisert i G1 /S (0 h), utgitt i normal medium som inneholder FBS og høstet på angitte tidspunkter.
SSX formidler tumorcellevekst gjennom MAPK /Erk signalveien
Oppdagelsen av at SSX opprett celleproliferasjon og er nødvendig for oppføring av tumorceller inn i S-fasen fikk oss til å undersøke om denne effekten var forbundet med signaleringskaskader som stimulerer celleproliferasjon og overlevelse. Vi begynte med å sammenligne potensialet i SSX uttrykke og knockdown celler for å aktivere (phosphorylate) intracellulære budbringere Erk og Akt-1 etter vekstfaktor stimulering.
Tap av SSX uttrykk ble assosiert med redusert fosforylering av ekstracellulære signal -regulated kinase (Erk) 1 og 2, men ikke av Akt-en etter stimulering med FBS. En reduksjon i protein nivåene av Akt-1 ble imidlertid observert i SSX stilnet-celler (figur 4). Våre resultater tyder på at effektene av SSX på tumorcelleformering blir forbundet i det minste delvis for å modulere aktiviteten av MAPK /Erk signalveien.
Western blot som viser ekspresjonen av Erk1-2 og Akt-1 og deres aktiverte (fosforylerte) former Pakt (Ser 473) og perk (Thr202 /Tyr204) i kontroll shRNA og SSX-shRNA DFW celler. Cellene ble sultet i serumfritt medium i 36 timer (0 h) og cellesignalisering ble aktivert ved tilsetning av serum i mediet. Prøver ble samlet sammen ved 10 og 30 minutter (10 «og 30») og etter 6 og 24 timer (6 timer, 24 timer) etter serumstimulering. SSX ble bestemt ved immunoprecipitation (fl188 antistoff) og western blot (N18 antistoff) de senere recognozing band på ca 22 og 14 kDa.
SSX Samhandler med β-catenin å regulere transkripsjon av EMT Associated β -catenin gener
3 «regionen av SSX-1, 2 og 4 gener er kondensert til nesten hele SS18-genet i synovial sarkomer. Interessant SS18 /SSX2 fusjonsprotein danner et kompleks med β-catenin som resulterer i aktivering av en T-celle-faktor TCF /lymfocytt forsterker faktor (LEF) reporter-konstruksjonen når ectopically uttrykt i pattedyrceller [22]. Vi undersøkte derfor om denne interaksjonen er bevart for full-lengde SSX proteiner.
Siden SSX uttrykk varierer med cellecyklusprogresjonen, synkronisert vi DFW og Saos-2-celler (tid 0) ved G1 /S fasegrensen og sluppet inn i celle syklusen for 6 og 24 timer og utføres immunoprecipitation på cellelysatene med SSX antistoffer og immunblotting med β -catenin antistoffer (figur 5a). β-catenin ble ko-utfelt med SSX fra begge Saos-2-celler og DFW blokkert i G1 /S (tid 0), så vel som fra celler som ble gitt inn i cellesyklus i 6 og 24 timer. For å sikre spesifisitet, ble like proteinmengder Saos-2-celleekstrakter immunopresipitert med irrelevante immunoglobuliner fra mus (M) og kanin (R) som kontroller (figur 5A).
A) DFW og Saos-2-cellelinjer ble synkronisert i G1 /S ved å dobbelt tymidin blokade som angitt i materiale og metoder (0 timer), og ut i normal medium som inneholdt FBS for 6 og 24 timer. SSX ble immunopresipitert fra proteinekstrakter samlet på de angitte tidspunkter med kanin anti SSX-antistoff (FL188, oppdager SSX1-9). En ekvivalent mengde av protein fra G1 /S blokkert Saos-2-celler ble immunoutfelt med et irrelevant anti mus (m) eller ant-kanin (r) antistoff. Den proteinkompleks ble elektroforese i reduserende forhold og utslettet eter med geit anti SSX (N18) eller mus anti β-catenin antistoffer. De totale inngangsnivåer av β-catenin vises i øvre gel bildet. B) Aktivitet av en TCF /Lef luciferase reporter i SSX taushet og tak Dallas og Saos-2-celler, 48 timer etter transfeksjon av siRNA-molekyler (n = 5). Aktiviteten av TCF /Lef reporter i SSX stilnet celler er i forhold til den for kontrollceller (= 1). C) Gene transkripsjon forbundet med SSX ekspresjon i begge Saos-2 og DFW celler, determinded ved PCR-matriser inneholdende 84 gener assosiert med epitelial til mesenchymal overgang (n = 5) og bekreftet ved Q-RT-PCR i SSX taushet og tak Dallas og Saos -2-celler som beskrevet i materiale og metoder. SSX ble slått ned i Saous-2 eller DFW celler ved hjelp av siRNA molekyler eller shRNA vektorer som angitt. Celler ble samlet og RNA ble isolert 6 vårt etter siRNA transfeksjon eller 6 timer etter tilsetning av doksycyklin i mediet (betinget shRNA). Tapet av SSX uttrykket etter RNAi lyddemping ble bekreftet ved western blot før hver Q-RT-PCR-matrise, slik som vist i figuren. Fold-Change [2∧ (-Delta Delta Ct)] er den normaliserte genuttrykk [2∧ (-Delta Ct)] i SSX forstummet celler dividert med den normaliserte genuttrykk i kontrollgruppen (SSX +) celler. Verdier mindre enn ett indikerer en negativ eller nedregulering.
Det motsatte eksperiment ble også utført der celleekstrakter fra DFW ble utfelt med β-catenin antistoffer og utslettet med anti-SSX antistoffer. Immunoutfelling av β-catenin resulterte i ko-utfelling av SSX. Varsel er at utbyttet av SSX oppnådd etter β-catenin antistoffer var lavere enn omvendt immunoprecipitation, som kan skyldes økt konkurranse av β-catenin binding med andre proteiner (Figur S3).
I den kanoniske Wnt veien, binder β-catenin til TCF /Lef å aktivere transkripsjon av gener assosiert med celleproliferasjon, overlevelse, motilitet og differensiering [23]. Basert på dette har vi undersøkt om samspillet mellom β-catenin med SSX påvirker transkripsjon av TCF /β-catenin målgener. For det første bestemmes vi aktiviteten til et TCF /Lef-luciferase reporter i SSX-slått ned og kontroll (SSX +) celler. DFW og Saos-2-celler ble transfektert i tetraplicates med TCF /Lef- ildflue luciferase reporter og med enten siRNA til SSX eller kontroll molekyler. Aktiviteten av reporter ble evaluert 48 timer etter transfeksjon. Interessant vi har observert en nedgang i aktivitet reporter siRNA-SSX behandlede celler i fem uavhengige eksperimenter (figur 5B). Vi neste undersøkt om SSX /β-catenin interaksjon var forbundet med endringer i transkripsjon av endogene β-catenin /TCF målgener. For dette formål sammenlignet vi transkripsjons profiler av kontroll og SSX knockdown ved hjelp av RT-PCR arrays for 84 transkripsjoner forbundet med epithelial til Mesenchyma (EMT) overganger i Saos-2 celler. Vi valgte gener assosiert med EMT basert på rollen til β-catenin fremme EMT og vår tidligere rapport som viser at SSX ekspresjon er assosiert med invasiv kapasitet av tumorceller og med ekspresjon av gener mesenchymale [5]. De oppnådde i 5 uavhengige matriser resultater ble bekreftet ved RT-PCR i Dallas cellelinje. Av 84 analyserte genene fant vi at tapet av SSX uttrykk i Saos-2 og DFW ble assosiert med redusert transkripsjon av Akt-1, E-cadherin (CDH1), GSK3p, Snail 2 (SNAI2), c-myc (cMYC), og vimentin (VIM) (figur 5C). Med unntak av Akt-1, alle disse genene bære DNA-bindende sekvenser for TCF /Lef og er derfor ansett β-catenin mål. Vi har også observert en økt kollagen 3A transkripsjon etter nedregulering av SSX i Saos-2 (tabell S1).
siRNA målretting av SSX Svekker Tumor Xenotransplantat Vekst
Etter å ha vist at SSX er nødvendig for svulst celle vokse
in vitro
, undersøkte vi veksten av kontroll og SSX silenced xenotransplantater hos mus. Vi subkutant injisert SCID-mus med enten kontroll-shRNA (SSXm) eller SSX-shRNA (SSXi) stabile transfekterte DFW celler (figur 5A-B), eller med DFW celler der shRNA uttrykk ble betinget regulert med doksycyklin (figur 5C-D ). I den betingede systemet, ble SSX knockdown indusert ved subkutan implantasjon av langsomme utgivelsen doxycycline pellets som beskrevet i materialer og metoder. Sammenlignet med kontroll (SSX +) tumorxenotransplantater, SSX knockdown svulster viste svekket vekst som observert av reduserte tumorvekstkurver og ved redusert tumorvolumet ved endepunktet for analysen (Figur 6 A-D). Mikroskopisk, SSX negative svulster vises omfattende nekrose, opp til 80% og hadde avgrenset grenser (figur 6E, HTX) med lokal prolifererende cyclin A positive celler. I motsetning kontroll svulster viste radial cellevekst med rikelig proliferativ (cyklin En positiv) områder og kjernefysisk β-catenin (figur 6E). Interessant SSX knockdown svulster viste en overveiende cytoplasma lokalisering av β-catenin sammenlignet med kontroll svulster, muligens indikerer en rolle for SSX i cellulær lokalisering av β-catenin (figur 6E). Vi bekreftet SSX knockdown i svulster ved western blot på ferske tumor biopsier. (Figur 6F).
A) DFW melanomceller som er stabilt transfektert med SSX-shRNA (SSXi) eller med en kontroll shRNA (SSXm) vektor, ekspandert og xenopodet i SCID-mus. A) Tumorvolum bestemmes ved de angitte tider. B) Tumorvolum ved endepunktet av forsøket (21 dager). C) Vekstkurver av transplantater fra betinget SSX-shRNA forstummet DFW celler (SSX-) og kontroll shRNA (SSX +) celler. Doksycyklin ble administrert til alle mus ved subkutan innføring av en langsom frigjøring pellet tilgjengeleg jevn konsentrasjon av doksycyklin (10 mM) i 21 dager. D) Tumorvolum ved endepunktet av forsøket. E) Immunohistokjemi av svulstene visualisert i lysmikroskop bruker 10x objektiv, setter 63x forstørrelse. Hematoxillin (HTX), markør spredning (ki-67) og β-catenin (β-cat)
Disse resultatene viser at nedregulering av SSX uttrykk svekker tumorvekst
in vivo Hotell og resulterer i endrede β-catenin lokalisering.
diskusjon
SSX proteiner er kodet av gener som blir uttrykt bare i flere kreft undergrupper med ekspresjon i normalt vev begrenset til kjønnsceller, trofoblaster og føtale stamceller. Gitt dette begrenset uttrykk, SSX antigener er attraktive mål for svulst immunterapi [21]. Imidlertid er funksjonen til SSX proteiner i spermatogenesis eller tumorgenesis dårlig definert. SSX er uttrykt i forskjellige subpopulasjoner av spermatogoniene og i føtale stamceller som tyder på en rolle for SSX i celledifferensiering [4], [5]. I tumorer, SSX øker invasiv potensial og undertrykker E-cadherin uttrykk, som har vært vist i melanoma [5] og brystkreftceller, henholdsvis [24]. Våre resultater viser at ekspresjon av SSX er essensiell for inntrengning av tumorceller inn i S-fasen av cellesyklusen, og følgelig tumorceller som uttrykker SSX opprett celleproliferasjon og langtidsoverlevelse. Disse funksjonene kan være forbundet med evnen til å modulere SSX MAPK /Erk, Akt og β-catenin signalveier. I samsvar med en rolle SSX i celleproliferasjon, knockdown av SSX blokkert Perk aktiverings en viktig del av spredning kaskade initiert av ekstracellulære vekstfaktor kinaser. I tillegg SSX knockdown også resulterte i redusert ekspresjon av Akt, en celle signalisering kinase med en sentral rolle i et stort antall av cellulære funksjoner inkludert cellevekst, metabolisme og overlevelse [25]. Til støtte for dette, har nylige rapporter vist at SSX er avgjørende for melanom celle proliferasjon [26] og for invasjonen kapasitet av brystkreftceller [24].
Vi fant at SSX vekselvirker direkte med β-catenin i G1 arrestert celler og at dette samspillet påvirker transkripsjon av β-catenin /TCF målgener siden stanse av SSX uttrykk ble forbundet med redusert aktivitet av et TCF /Lef reporter konstruere og redusert transkripsjon av β-catenin /TCF målgener som E -cadherin, GSK3b, snail-2, vimentin og c-Myc.
β-catenin er en kraftig transkripsjonsfaktor med en stor liste over mål gener som er involvert i celledeling, stemcellness og epitelial til mesenchymale overganger (EMT ). I en tidligere rapport foreslo vi en rolle for SSX i EMT basert på våre funn at i en melanoma cellelinje og i føtale stamceller, ble uttrykket av SSX forbundet med en mesenchymale fenotype som økt celle invasjon kapasitet, redusert E-cadherin og øket matriks proteinase 2 (MMP2) ekspresjon [5]. Vi viser nå at SSX samhandler med β-catenin og basert på våre transkripsjon profildata foreslå at denne interaksjonen kan indusere eller opprettholde en mesenchymale fenotype. Aktiviteten av SSX /β-catenin komplekse ved endogene målse kan imidlertid være avhengig av cellen avstamning, tid og signalering fra mikromiljøet.
SSX er en gjeldende mål for utvikling av cellebaserte immunovaccines . HLA A2 begrenset cytotoksiske T-celler (CD8 +) som gjenkjenner SSX peptider har blitt isolert fra lymfeknuter fra en SSX2 seropositive melanom pasient [19] og har også blitt generert for immunotargeting av prostatakreft celler
in vitro product: [ ,,,0],21]. Videre har det blitt rapportert at behandling med autonome dendrittiske celler primet med SSX peptider resulterte i tumorremisjon fra en synovial sarcom pasient [27]. I denne rapporten viser vi at transkripsjonen stanse av SSX hemmer veksten av melanom xenografter legge ytterligere støtte til betydningen av SSX som terapeutisk mål.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr arbeid har blitt godkjent av det svenske sentralstyret for dyrestudier (Centrala Försöksdjur nämnden, CFN), Stockholm Nord. Etiske godkjenningsnumre N399 /07, N340 /10 til B.b. Dyret studier har blitt gjennomført i henhold til sine etiske retningslinjer. Innsamling av kliniske prøver for forskning ble gjort med pasienten concent og godkjent av Karolinska, forskningsetikkommitté Nord Ingen 03-019. Alle data ble analysert anonymt og i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
Cellelinjer
DFW er en HLA-A2 melanoma cellelinje hentet fra en metastatisk melanom svulst. Linjen ble generert ved Karolinska Institutet [28], og vennlig levert av R. Kiessling. SAOS-2 (sarkom osteogene) er en cellelinje som genereres fra en primær osteosarkom [29] og U2OS er en osteosarcom-cellelinje, begge cellelinjer ble gitt av M. Fritsche, Universitat Freiburg, Tyskland. Alle cellelinjer påvise høye nivåer od SSX1 til SSX5, bestemt ved hjelp av RT-PCR (figur 1 og figur S1). Cellene ble dyrket som monolagskulturer i RPMI medium (Sigma) supplementert med 10% tetracyklin-fri FBS (Clonetech), 100 ug /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin og 2 mM L-glutamin med fuktet atmosfære og 5% CO
2 ved 37 ° C.
SSX-RNA interferens
En passende RNA interferens (RNAi) oligonukleotid rettet mot alle SSX isoformene SSX (1, 2, 3, 4, 4B, 5 , 7, 8 og 9) og SS18 /SSX1, SS18 /SSX2 og SS18 /SSX4 fusion transkripsjoner uttrykt i synovial sarkom ble identifisert ved å justere mRNA sekvenser av ekson 5, ekson 6 og 3’UTR regionen SSX1 til SSX5 hjelp etablerte RNAi kriterier. Innskudd ble konstruert for å inneholde et 19-bp SSX mRNA-sekvens separert av en 9-nukleotid som ikke er komplementære avstands, og etterfulgt av omvendt komplementære 19-bp mRNA-sekvens (figur 2A). For shRNA vektor kontroll, ble en kryptert sekvens inneholder 3 feilaktige posisjoner også klonet inn vektorene. shRNA oligonukleotider ble klonet inn pSuper (for stabile) og pSuperior (doxycycline induserbar) vektorer (Oligoengine) og skjermet av PCR og DNA-sekvensering.
For SSX stanse i cellelinjene vi brukte både shRNA vektorer og også siRNA-molekyler . For å undersøke spesifisiteten av RNAi-SSX system og å kontrollere off-target effekter Effekten av siRNA-SSX brukt i denne studien ble sammenlignet med kommersielt tilgjengelige shRNA vektorer rettet mot SSX1 og SSX2 i tre independet cellelinjer (DFW, U2OS og SAOS- 2. Dette er vist i tilleggs figur 2.
For transiente trans DFW ble transfektert med pSuper SSX shRNA (SSXi) eller kontroll RNA vektor (SSXm) sammen med en tom vektor bærer en neomycin motstand kassett. Cellene ble valgt etter transfeksjon i G418 inneholdende medium, og utvidet i bulk før analysene. for generering av induserbare siRNA-celler, ble DFW-celler transfektert med tetracyklin repressoren uttrykkende vektor pcDNA6 /TR (Invitrogen) og pSuperior vektor ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse til produsentens instruksjoner og valgt med 8 ug /ml blasticidin og 1 ug /ml puromycin. Cell kloner ble utvalgt basert på deres effektivitet i tie SSX uttrykk etter tilsetning av doksycyklin ved en konsentrasjon på 10 ug /ml som evaluert ved western blot.
For gentranskripsjon studier, vill type DFW eller Saos-2 ble transfektert med siRNA-SSX eller styrer siRNA-molekyler (Ambion). Effektiv stanse av SSX ble bekreftet i de transfekterte kloner 8 og 24 timer forut for RNA isolering og Q-RT-PCR-matriser.
For forenkling SSX stilnet celler omtales som SSX- og kontrollcellene som SSX +.
Cell Cycle Synkronisering og analyse
Celler ble synkronisert i G1 /S-fasen ved å dobbelt tymidin blokk
i korthet.; Cellene ble sådd ut i 50% konfluens, og ble behandlet med 2 mM tymidin i 12 timer, tripzinized, utsådd og frigjøres til normal medium i 8 timer, og blokkeres igjen i medium inneholdende 2 mM tymidin i 12 timer. For betinget stanse av SSX i synkroniseres DFW-celler, ble doksycyklin (10 ug /ml) tilsatt til cellene i 2 timer før den slippes inn i celler som normalt medium og celleprøver ble deretter oppsamlet ved angitte tidspunkter og analysert ved propidiumjodidfarging, eller 5′- brom-2′-deoksy-uridin (BrdU) (Roche Diagnostics) farging og FACS-analyse. Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble beregnet ved anvendelse ModFit programvare.
Antibodies, Immunoblotting og Immunoutfelling
For SSX immunopresipitering, dyrkede celler ble lysert i RIPA lysebuffer (50 mM Tris -HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,25% Na deoksycholat, 1% NP-40) supplementert med proteasehemmere (Roche). Prøvene ble så ultralydbehandlet og sentrifugert i 10 minutter (14 000 x g). 100 ug protein fra den resulterende supernatant ble resuspendert i et totalvolum på 1 ml med PBS som inneholdt protease-inhibitorer og immunopresipitert over natten ved 4 ° C med med 3 ug anti SSX 1-9 antistoff fl188 (Santa Cruz Technologies) er koblet til protein G-Dynabeads (Invitrogen). Immunopresipitatene ble vasket en gang med lyseringsbuffer og to ganger med PBS resuspendert i ladningsbuffer (Invitrogen), oppvarmet ved 70 ° C i 5 minutter og løst på 4-12% polyakrylamid geler og Western blotting.
For deteksjon av proteiner ved western blot, ble cellene lysert
in situ
med lyse /lasting buffer; ultralydbehandlet og oppvarmet ved 70 ° C og løses på 4-12% polyakrylamid-gel-elektroforese for western blotting
De følgende antistoffer ble anvendt:. FL188 (hevet i kanin) for påvisning av SSX 1-9, og N18 ( dannet i geit) for påvisning av SSX1-4, 6 og 8, (Santa Cruz Bioteknologi), og en i huset produsert polyklonalt antistoff mot et SSX peptidsekvens (SSX PAb); antistoffer mot cyclin-E (HE-12, Santa Cruz); P-catenin (BD Biosciences Pharmingen), Erk, Perk, Akt, Pakt (Cell Signal). For chemiluminiscence deteksjon vi brukte pepperrotperoksidase-coupled konjugater og forbedret chemiluminescence underlaget deteksjon (ECL og Super Signal West femto, Pierce).
celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble evaluert telle antall levende og døde celler ved hjelp av trypanblått-utelukkelse fargestoffcelleantallet i tre eksemplarer. I korte trekk 50000 ble sådd ut i 12 brønners plater og behandlet med 10 ug /ml doksycyklin. Cellene ble trypsinert og farget med trypanblått ved angitte tidspunkter. Hver tilstand ble kjørt i triplikat, og alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger.
celle proliferasjon ble bestemt i sanntid ved hjelp av xCELLigence celle analysator (Asea Biosciences) som måler den elektriske impedans av adherente celler og uttrykkes i vilkårlige enheter (celleindeks). Cell-indeksen er avhengig av celle etterlevelse, morfologi og spredning.
Colony Forming analyse
1 × 10
3 DFW SSXi celler ble sådd ut i 3 cm cellekulturplater (i tre paralleller).
