Abstract
En stadig voksende listen over microRNAs (miRNAs) viser avvikende uttrykk mønstre i leverkreft (HCC ), men de reguleringsmekanismene i stor grad fortsatt uklare. RNA redigering katalysert av medlemmer av adenosindeaminase virker på RNA (ADAR) familie kunne målrette miRNA forløpere og påvirke biogenesis prosessen. Derfor undersøker vi om RNA redigering kan være en mekanisme som bidrar til dereguleringen av spesifikke miRNAs i HCC. Ved overekspresjon av individuelle ADARs i hepatomceller, ble RNA redigering på forløperne til 16 mirnas ofte deregulerte i HCC skjermet av en følsom høyoppløselig smelte plattform. Resultatene identifisert RNA forløpere for MIR-214 og MIR-122 som potensielle mål redigert av ADAR2. En undergruppe av HCC som viser forhøyet ADAR2 bekreftet de store editings identifisert i ARAR2 overuttrykt hepatomceller, enten med A-til-I- eller U-til-C endringer. Den uvanlige U-til-C redigering ved bestemte residuer ble demonstrert som å være knyttet til A-til-I redigering på RNA-transkripter komplementære til den pri-mirnas. Redigerings hendelse forårsaket en reduksjon av RNA transkripsjon komplementær til pri-MIR-214, noe som førte til nedgang på pri-MIR-214 og MIR-214 og resulterte i økt proteinnivå sin roman målgenets Rab15. Konklusjonen er at den aktuelle studien oppdaget ADAR2-mediert redigering av de komplementære antisense transkripsjoner som en ny mekanisme for å regulere biogenesis av spesifikke miRNAs under hepatocarcinogenesis
Citation. Liu WH, Chen CH, Yeh KH, Li CL, Wu YJ, Chen DS, et al. (2013) ADAR2-mediert Redigering av MIR-214 og MIR-122 forløper og Antisense RNA transkripsjoner i lever kreft. PLoS ONE 8 (12): e81922. doi: 10,1371 /journal.pone.0081922
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 31 juli 2013; Godkjent: 17 oktober 2013; Publisert: 27.12.2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Research Program for Biopharmaceuticals, National Science Council, Taiwan (NSC102-2325-B-002-032-), og National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX100-9832BI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er endogene ikke-kodende RNA identifisert som posttranskripsjonelt regulatorer av genuttrykk. Økende antall mirnas ble ofte funnet å være deregulert i HCC, og noen har deltatt i kreftfremkallende prosessen gjennom målretting av spesifikke cellulære gener som er involvert i tumor spredning, apoptose, og metastase [1], [2].
forskjellige mekanismer er blitt rapportert å bidra til den avvikende ekspresjon av mirnas i tumorer. I tillegg til de genomiske eller epigenetiske forandringer, ble defekter av miRNA biogenese prosessen også være involvert i den feilregulering, enten transkripsjonelt av spesifikke transkripsjonsfaktorer eller posttranscriptionally av prosesserings faktorer [3]. Økende antall faktorer som deltar i posttranskripsjonelt BIOGENESIS skritt er identifisert, inkludert generelle faktorer for alle mirnas (som drosha, DGCR8, og dicer) [4] og de spesifikke faktorer for en undergruppe av miRNAs (som P53, TRBP2, KSRP, p68 /P72, Lin28B, og andre) [5], [6]. I tillegg til disse faktorer, har det vært ansett at RNA-redigering kan være en annen mekanisme for å regulere posttranscriptionally miRNA nivå i tumorer.
RNA-redigering resulterer i en endring av RNA-sekvens, som er forskjellig fra den som blir kodet av genomet og bidrar til mangfoldet av proteinprodukter [7]. Hos mennesker er dette arrangementet mediert av ADAR enzymer, inkludert ADAR1 og ADAR2, som katalyserer deaminering av adenosin til inosin (A-til-I) på dobbelt-trådet RNA [8]. To ADAR1 isoformer av alternativ arrangøren bruk ble identifisert som koder ADAR1S og ADAR1L [7], [8].
I tillegg til de proteinkodende gener, de ADARs kan også målrette miRNA forløpere, enten pri- eller pre-mirnas, som inneholder stammeløkkestrukturer som fordelaktige substrater for redigering maskineri. Hjulpet av high-throughput sekvensering analyse, har det blitt anslått at ~ 20% av menneskelige pri-mirnas redigeres [9]. Slike redigerings arrangementer har potensial til å påvirke funksjonen av mirnas, herunder stabiliteten av forløperne, behandling effekt under biogenese, eller til og med målgenet utvalg [10], [11]. En slik mulighet har allerede blitt godt demonstrert i flere spesifikke miRNAs. For eksempel ble pri-MIR-142 funnet redigert av ADAR1 og ADAR2
in vitro
, noe som førte til undertrykkelse av sin behandling av drosha. Et annet eksempel kom fra redigering av pri-MIR-151 ved ADAR1, som hemmer pre- å modne-MIR-151 behandling ved å blokkere spalting av dicer [12].
I denne studien har vi prøvd å undersøke om RNA redigering av ADARs skjer for å regulere behandlingen av HCC-relaterte miRNAs. Som en pilotstudie, forventer vi at resultatene kan bidra til å forstå hvis de RNA redigering hendelser bidrar til deregulert uttrykket av spesifikke miRNAs i hepatocarcinogenesis.
Materialer og Metoder
Plasmid konstruerer
de cDNA kloner for menneskelig ADAR1L og ADAR2 ble kjøpt fra pattedyr Gene Collection (MGC, NIH, USA), og ADAR1S ble subklonet fra ADAR1L klone. Disse cDNA fragmentene ble endret til pCMV.SPORT6 vektor og deretter fortsatte videre å klone inn i lentiviral vektor av pLenti6 /V5-MÅL ved hjelp Gateway Technology ™ System (Invitrogen Livet Technologies Inc.).
pLKO.1 -siLuc og pLKO-en-siGFP konstruksjoner drevet av U6 promoter ble hentet fra RNAi Kjerne Facility i Academia Sinica, Taiwan (Taipei, Taiwan). I tillegg ble flere pLKO.1 vektorbasert siRNA plasmider konstruert ved innsetting av den spesifikke siRNA sekvens i pLKO.1-siLuc vektoren ved restriksjonsseter for AgeI og EcoRI. Sekvensene for hver siRNA innsatser mot fornuft og antisense transkripsjoner av MIR-214 og MIR-122 ble oppført som fulgte. siRNA for MIR-214: 5′-CCTTTGCTCATAGACAGATAC-3 «; siRNA for AS-MIR-214: 5»-GTATCTGTCTATGAGCAAAGG-3 «; siRNA for MIR-122: 5»-CCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 «, siRNA for AS-MIR-122: 5′-TGCCAAGACATTTATCGAGGG -3». Detaljene for utarbeidelse av lentiviruses uttrykker ADARs eller spesifikke sirnas var som tidligere beskrevet [13].
For å konstruere plasmider uttrykker enten den forstand eller komplementære antisensprimere transkripsjoner av pri-miR214 og pri-miR122 i kultur celler, vi har klonet PCR-produktene amplifisert fra genomisk DNA av Huh-7 celler inn i pCMV.SPORT6 vektoren. Primersettene ble utformet for å omfatte de forløper miRNA med rundt 200 baser som strekker seg til både 5 «og 3» flankerende sekvens fra hver miRNA. Mutasjonene av spesifikke rester i disse konstruerer, inkludert A-34g og A-27G for pri-AS-MIR-214 og A-7G for pri-MIR-122, ble introdusert av seterettet mutagenese ved hjelp av Quickchange II Site-Directed mutagenese Kit (Stratagene, Cedar Creek, TX), ved å følge produksjon instruksjon.
reporteren konstruere pGL3-Rab15-3’UTR, som inneholder 3’UTR av Rab15 genet, ble konstruert ved å sette inn DNA fragment dekker nt. 1~714 av 3’UTR av Rab15 genet (nt. En av 3’UTR som den første nukleotidet etter stoppkodonet av Rab15, ved nt. Posisjon 709 av Rab15 transkript, NM_198686) til pGL3-promotoren vektor (Promega, Madison, WI). DNA innskuddet ble forsterket av PCR fra genomisk DNA fra Huh-7 celler med primere av 5′-GGTCCGTCTAGACAGAGCTGGTGCTGCAGGCCCAT-3 «og 5′-GAAGGCTCTAGACGAGGCAGGGTGGAG GGTTCTTC-3».
Høy oppløsning Smelte (HRM) Analyse
HRM er et kraftig verktøy utviklet for sensitiv sekvens variant screening, utnytte DNA tilhører varme separasjon i nærvær av metning fluorescens fargestoffer, som for eksempel High Resolution Melting Dye (Roche Diagnostics Applied Science, Mannheim, Tyskland) anvendt i denne studien. De heterodupleks-DNA-fragmenter kan skilles fra den homozygote seg ved å vise en annen formet smeltekurve [14]. Dette muliggjør deteksjon av enkelt-basepar-endring i DNA-fragmenter opp til 400 bp etter smelting kurve analyse. HRM analyse er dermed egnet for vår identifisere nucleotide endringer forårsaket ved å redigere hendelsene i pre-mirnas (~ 100 bps i gjennomsnitt).
Primerne ble utformet for hver miRNA bruker LightCycler Probe Design Software, med sekvensene oppsummert i tabell S1. Lengden av hvert fragment ble rundt 200 bp, som dekker hele pre-mirnas med minst 50 bp som strekker seg til 5 «og 3»-ender. PCR forsterkning og HRM analyse ble utført av LightCycler® 480 (Roche Diagnostics Applied Science), med detaljer som beskrevet [15].
PCR produktene inneholder heterodupleks fragmenter ble identifisert ved å vise den relative signalforskjell på smelte kurvene sammenlignet med de som er forsterket av det genomiske DNA av Huh-7-celler (som standard uten redigering), ved bruk av Gene Scanning Software (Roche Diagnostics Applied Science). For å unngå falske positive resultater forårsaket av analyse variasjoner, har vi satt grenseverdier for hvert fragment ved å analysere den relative signalforskjell mellom PCR-produkter fra 12 gjentakelser av PCR reaksjon med Hu-7 genomisk DNA som mal, som var mindre ; 3,5 i alle tilfeller. Derfor ble cut-off verdier for den relative signalforskjell angitt som 5 i vår analyse.
forsøkspersonene
De levervev fra 20 HBV-relatert mannlige HCC pasienter innsamlet i Taiwan leverkreft nettverk (TLCN) ble inkludert i denne studien. DNA og RNA fra den parede tumorous og de tilstøtende nontumorous levervev fra hver pasient ble anvendt for revers transkripsjon og PCR-reaksjoner. Deretter PCR produktet ble behandlet for sekvensering analyse, med formål å identifisere restene med antatte redigerings hendelser. Den resekterte kirurgiske prøver raskt ble oppbevart i flytende nitrogen inntil DNA og RNA-ekstraksjon. The Institutional Review Board of National Taiwan University Hospital godkjent bruk av disse arkiverte vev, og alle pasienter ga sine skrift informert samtykke før innmelding.
Kvantifisering av Pri-miRNA og Eldre mirnas
Total RNA ble isolert fra celler med Trizol reagens (Rezol C T, Protech, Taipei, Taiwan) og deretter bearbeidet for revers transkripsjon ved å bruke Superscript III One-Step RT-PCR System (SuperScript® III First-Strand Synthesis System, Invitrogen, Carlsbad, CA), for den etterfølgende kvantifisering av pri-miRNA. Blandingene for revers transkripsjonsreaksjon inneholdt 1 pg RNA, 10 uM av spesifikk primer, 5′-ATATCAGATGAACCTTCTTGCTC-3 «for pri-miR122 og 5»-GGTTGTAGCTCTTGGTGTAGATG-3 for pri-MIR-214, med reaksjons detaljer som er beskrevet [ ,,,0],13].
qPCR ble utført av LightCycler Faststart DNA Master SYBR Grønn jeg Kit (Roche, Mannheim, Tyskland) i LightCycler PCR maskin med detaljer som beskrevet [13]. Primere som brukes for spesifikk forsterkning av pri-miR214 og pri-miR122 er oppført som følges. Pri-MIR-214: 5′-GTATCTGTCTATGAGCAAAGGAAACC-3 «og 5′-GGTGTAGATGCTATGGTGTGAGGGC-3′; pri-MIR-122: 5»-ACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 «og 5′-TGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGG-3»
Kvantifisering av modne MIR-214 og MIR-122 ble utført ved bruk av TaqMan miRNA Assay Kit (TaqMan® mikroRNA. omvendt Transcription Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens anvisninger. U6 RNA ble anvendt som en intern kontroll for å bestemme den relative miRNA ekspresjonsnivået med detaljer som er beskrevet [13].
Strand Spesifikk QRT-PCR-analyse
Tråden spesifikk QRT-PCR for den primære transkripsjon av pri-MIR-122 og pri-MIR-214, og også deres komplementære antisens transkripsjoner, ble utført ved å følge protokollen som beskrevet av Ho
et al product: [16]. I korte trekk, ble 2,5 ug av RNA ekstrahert fra celler eller vev behandlet for revers transkripsjon (RT) reaksjon av tråd spesifikk primer; og deretter strengen spesifikke RT produkt ble anvendt for den qPCR-analyse. The Strand spesifikke primere designet for pri-MIR-122 og pri-MIR-214 er MIR-122S: 5′-ACCTTCGTGGCTACAGAGTTTCC-3 «og MIR-214S: 5′-GTCTGCCTGTCTACACTTGCTG-3′; og de som er beregnet for de komplementære transkripsjoner er MIR-122AS: 5»-TGCCAAGACATTTATCGAGGGAAGG-3 «og MIR-214AS: 5′-AGGCTGGGTTGTCATGTGACTG-3». Det samme settet med primere for strengen spesifikke RT-reaksjonsproduktet ble brukt i den etterfølgende qPCR-analyse med detaljer som er beskrevet [13].
TA kloning og sekvensanalyse
RT-PCR-produktene fra den lenti -ADAR2-infiserte celler ble renset ved gel utvinning og klonet inn YT A vektor (Yeastern Biotech Co Ltd, Taipei, Taiwan) av TA kloning. De positive kloner inneholdende innskudd ble behandlet for sekvensanalyse for å påvise nukleotid-forandringer, sammenlignet med sekvensen fra kontrollprøvene uten ADAR2 overekspresjon.
Cell Culture, Transfeksjon, Luciferase Assay Reporter, og Western Blot analyse
To hepatomcelle linjer, HepG2 og Huh-7 celler, ble kjøpt fra BCRC (Bioresource Collection and Research Center, Taiwan, https://www.bcrc.firdi.org.tw). Genotypen av disse to cellelinjene er blitt autentisert ved å bruke BCRC AmpFI STR Identifiler PCR-amplifikasjon settet av Applied Biosystems for omfattende STR PCR-DNA-analyse, sammen med profilene identiske med ATCC-data. Detaljene for celle vedlikehold, transfeksjon, luciferase reporter analysen, og Western blot-analyse ble som tidligere beskrevet [17]. Antistoffene benyttet for Western blot-analyse inkludert anti-ADAR2, anti-GUTL1, anti-IGF-1R, og anti-Rab15 (Santa Cruz Biotechnology, California), anti-ADAR1 (Abnova, Taoyuan), og anti-β-actin (Sigma, St. Louis, MO).
Resultater
Redigering av MIR-214 og MIR-122 Forløpere i Huh-7 celler ved Overuttrykte ADAR2
for å undersøke hvis RNA redigering bidrar til avvikende uttrykk for spesifikke miRNAs i hepatocarcinogenesis, 16 mirnas reproduserbart rapportert som deregulert i HCC (tabell S1) ble valgt for vår testing hvis de var substrater redigert av ADARs. Vi tok tilnærming ved overekspresjon individuelle lenti-ADARs i Huh-7 celler, inkludert ADAR1S, ADAR1L, og ADAR2, og deretter undersøkt om RNA redigering medført nukleotid endringer i forløperne for disse miRNAs. Den økte ekspresjon av proteinet individuelle ADARs ble først bekreftet ved Western blot-analyse (Fig. 1A). RNA ble ekstrahert fra celler som overuttrykker individuelle ADARs for RT-PCR og påfølgende HRM analyse.
(A) Cellene ble uinfiserte (mock), infisert med lenti-sh-luc (negativ kontroll), eller infisert med den Lenti-ADAR1S, ADAR1L, og ADAR2 individuelt. Cellelysatene ble bearbeidet for Western-blotting ved probing med Abs som antydet på bunnen av hvert panel. HRM resultater for Mir-214 (B) og Mir-122 (C). Rådata til de relative signaler er vist i det øvre panel; og differansen av den relative signal ved å sammenligne med «ingen redigering» standard er vist i det nedre panel. Stammen loop-strukturene for pre-MIR-214 (D) og pre-MIR-122 (E) er illustrert skjematisk, med nukleotider som tilsvarer modne Mirs merket med grønt. Posisjonene til nukleotidene endret av overekspresjon av ADAR2 er merket med rødt, med tallene som viser deres posisjon i forhold til det første nukleotid av modne Mirs (som posisjon nr. 1). Oppsummerings Resultatene av nukleotid endringer i forløpere for disse to mirnas vises på høyre panel, ved sekvensering av 100 kloner fra TA kloning av RT-PCR produktene forsterket av RNA fra lenti-ADAR2 infiserte celler.
PCR-produktet forsterket av genomisk DNA fra Huh-7 celler, som tilsynelatende ikke er målet for ADARs, servert som «ingen redigering» standard for HRM analyse. Ved å sammenligne med en standard, ble de relative signal scorene for hver av de 16 mirnas fra celler infisert med de enkelte lenti-ADARs beregnet, med resultatene oppsummert i Tabell S2. De avvikende smeltekurver, som viser den relative signal poengsum 5, ble identifisert i RT-PCR produktene forsterket av pri-MIR-214 og pri-Mir-122 forløper RNA hentet fra lenti-ADAR2 infiserte celler (fig 1B for MIR. -214 og fig. 1C for MIR-122). Resultatene indikerte at ADAR2 overekspresjon kan introdusere noen uoverensstemmelser i transkripsjoner av pri-MIR-214 og pri-MIR-122, noe som tyder forløperne kan være underlag for ADAR2.
For å identifisere ytterligere spesifikke rester i primære transkripsjoner av disse to mirnas redigert av ADAR2 ble RT-PCR-produkter fra lenti-ADAR2-infiserte celler behandlet for TA-kloning, og den påfølgende sekvense Undersøkelsen er gjennomført i 100 kloner for hver pri-miRNA. Flere vendende nukleotid-endringer ble identifisert til å være forskjellig fra sekvensen av prøver uten ADAR2 overekspresjon. Fig. 1D (for pri-MIR-214) og Fig. 1E (for pri-MIR-122) som skjematisk illustrert deres posisjoner i forhold til den modne Mirs, som også oppsummert den prosentandel av disse nukleotid-endringer i sekvenserte kloner. De mest hyppige endringer inntraff med det haplotype av U-28 ° C /U-37C for pri-MIR-214 (i ~ 50% av kloner) og med den haplotype av A-7G for pri-MIR-122 (i ~ 30% av kloner).
ADAR2 Elevation korrelert med nucleotide endringer på bestemte Rester av Pri-mirnas i HCC Vev
Deretter undersøkte vi om de ADAR2-mediterte vendende nukleotid endringer identifisert i Huh-7 celler også forekom i kliniske prøver. CDNA fra 20 par HCCs og deres tilsvarende tilstøtende nontumorous vev ble analysert ved direkte sekvensering av deres RT-PCR-produktet fra den primære transkripsjoner av pri-MIR-122 og pri-MIR-214. Tre HCC vev viste klare nucleotide endringer (fig. 2, pasient nr. 11, 13 og 20), med U-til-C endringer på -37 og -28 av pri-MIR-214 (Fig. 2A, avslørt som A -til-G endringer ved sekvensering med revers primer), og en A-til-G endre på -7 av pri-MIR-122 (fig. 2B, avslørt som A-til-G endringer ved sekvensering med fremover primer) . Slike forandringer fant ikke sted på PCR-produktet fra genomisk DNA av de samme HCC vev (data ikke vist). Interessant nok har disse nukleotidforandringer var de samme som de store er identifisert i ADAR2-overuttrykt Huh-7 celler (Fig. 1D, 1E), som støtter disse redigerings hendelsene kan også forekomme i kliniske prøver. Det var bemerkelsesverdig at disse spesifikke nukleotid endringer i hovedsak skjedde i svulstene, men lite i de tilstøtende nontumorous vev av disse pasientene (Fig. 2A og 2B, NT vs. T), noe som tyder på dette som en hendelse fortrinnsvis skje i svulster.
de representative sekvenseringsresultater for MIR-214 (A) og MIR-122 (B), med RT-PCR-produktene fra fire par av HCC vev som angitt. Nukleotid-rester med endringer i tumor (T) vev, sammenlignet med de i de tilsvarende nontumorous (NT) vev, er merket med røde piler. De posisjoner i forhold til det av de modne mirnas er angitt over pilene. (C) De relative ekspresjonsnivåer av ADAR2 mRNA i disse HCC vev ble bestemt ved qPCR-analyse, sammen med de kvantitative resultater som er vist som i forhold til nivået av NT del av pasientens no. 8. (D) Proteinet uttrykk for ADAR2 og ADAR1 i disse fire par HCC vev ble undersøkt ved Western blotting.
Siden våre
in vitro
studier viste at disse nucleotide endringer kan være forårsaket av overekspresjon ADAR2, undersøkte vi om ADAR2 ble hevet i HCC viser bestemte nukleotid-endringer. Uttrykket nivåer av RNA og protein av ADAR2 i disse tre par HCCs ble undersøkt ved qPCR og Western blot, med ett par HCCs uten noen nukleotidforandringer som kontroll (pasient nr. 8). Både RNA- og proteinnivåer ADAR2 ble forhøyet betydelig i HCC vev av disse tre pasientene, men ikke i (fig. 2C, 2D) kontroll tilfelle. Resultatene antydet at ADAR2-mediert RNA redigering hendelser kan også forekomme i en undergruppe av HCC, som er godt forbundet med økt uttrykk av ADAR2.
Redigering av RNA transkripsjoner komplementær til RNA transkripsjoner av Pri-speil 214 og Pri-MIR-122
Det er godt dokumentert at RNA redigering av ADAR2 forårsaker hovedsakelig A-til-i /(G) endringer [8]; men de fleste av nukleotidendringer vi identifisert for pri-MIR-214 og pri-MIR-122 forløpere i ADAR2-overuttrykt Huh-7 celler ble U-til-C endringer, bortsett fra en ved posisjon -7 av MIR-122 (Fig . 1D og 1E). Da slike uvanlige U-til-C endringer er komplementære til de forventede A-til-G endringer, foreslo vi muligheten for at ADAR2-mediert A-til-I redigering kan oppstå på RNA-transkripter komplementære til disse to pri-mirnas.
For å teste denne muligheten, tok vi tilnærming ved overekspresjon enten pri-MIR-214 /pri-MIR-122 (forstand) eller deres komplementære RNA transkripsjoner (antisense) i Huh-7 celler enkeltvis, i kombinasjon med overekspresjon av ADAR2. En slik design kan bidra til å skille redigerings hendelser på verken pri-mirnas eller komplementære antisensprimere transkripsjoner. Under overekspresjon av enten transkripsjoner for både pri-mirnas ( 50 ganger, åpenbart av qPCR analyse), fant vi at ADAR2 kan indusere U-til-C endrer bare i cellene overekspresjon de utfyllende antisensprimere transkripsjoner (fig 3A,. -28 og -37 for AS fra Mir-214 fig. 3B, 57 for AS fra Mir-122) .I kontrast, ble A-til-G endringer kun identifisert i cellene overekspresjon pri-MIR-122 ( fig. 3B, -7 for S av MIR-122). Dette støttes at de observerte U-til-C endringer kan være på grunn av den ADAR2-mediert A-til-I redigering i RNA-transkripter komplementære til både pri-mirnas. Disse endringene skjedde ikke i cellene infisert med lenti-ADAR1S eller lenti-ADAR1L, igjen som støtter disse redigerings hendelsene bli formidlet av ADAR2.
Huh-7 celler ble transfektert med plasmid konstruerer uttrykker enten den forstand (S) eller den komplementære antisense (AS) transkripsjoner av pri-MIR-214 (A) og pri-MIR-122 (B), og deretter smittet med lenti-ADARs som angitt. RNA ble ekstrahert fra hver cellepreparat for RT-PCR og påfølgende direkte sekvensanalyse. Resultatene som er vist her er representative, med fokus på de områdene som dekker restene identifisert som de store redigeringssider (som åpenbart i figur 2), inkludert -37 og -28 for pri-MIR-214 og -7 og 57 for pri-MIR -122 (merket med piler). De nukleotidresidier viser redigerings hendelser er markert med røde stjerner.
Siden den generelle RT-PCR og sekvensering analyse vi brukte ovenfor kan ikke skille redigerings hendelser på fornuft eller antisense transkripsjoner. Vi dermed prøvde å bekrefte den spesifikke A-til-jeg redigere på antisensprimere transkripsjoner av pri-MIR-214 ved strand spesifikke RT-PCR og sekvensering analyse. RNA ble ekstrahert fra de tre HCC med forhøyet ADAR2 (fig. 2, pasienter 11, 13 og 20) ble behandlet for strengen spesifikke RT-PCR, for å forsterke de primære transkripsjoner av disse to pri-mirnas og også deres komplementære antisense-transkripsjoner, for sekvensering analyse. Av notatet, i neuroblastom celler, Loebel et al. har allerede rapportert at genet som koder for MIR-214 er plassert innenfor et ikke-kodende 7,9 kb transkript som er komplementær til den intronic region av dynamin-3 (DNM3), mellom ekson 12 og 13 av dette genet (Fig. 4A) [18]. Hjulpet av de to databasene, GeneMark og GENSCAN, en kort avskrift komplementær til MIR-122 har blitt spådd (Fig. 4B).
Skjematisk illustrasjon av genet strukturer for RNA transkripsjoner komplementære til (A) først og MIR-214 og (B) pri-MIR-122. (C) De representative resultater for sekvensering av Strand-spesifikke RT-PCR-produkter fra HCC med antatte redigerings hendelser i den forstand (S) og antisense (AS) transkripsjoner av pri-MIR-214 og pri-MIR-122, med fokus på regionene som dekker områder med potensielle redigerings hendelser med redigering merket med røde stjerner.
sekvense resultatene viste at redigerings hendelser i hovedsak skjedd på transkripsjoner komplementære til pri-MIR-214, men ikke på sense transkripsjoner i disse HCC prøver (fig. 4C, venstre panel, -28 og -37 av pri-MIR-214). Det støttes at ADAR2-mediert U-til-C endringer kan tilskrives A-til-jeg redigering på de komplementære transkripsjoner av pri-MIR-214 i kliniske prøver. I kontrast til redigering arrangementet på steder med en A-til-G mønster hovedsakelig skjedde på den forstand avskrift i disse HCC (fig. 4C, panel rett, -7 av pri-MIR-122).
ADAR2 -mediert redigering på RNA transkripsjon Complementary til Pri-MIR-214 Påvirker funksjonelt målgenet av MIR-214
det neste spørsmålet er å undersøke den funksjonelle effekten av ADAR2-mediert redigering på biogenesis av disse to miRNAs. Til første fokus på MIR-214, ble effekten av ADAR2 overekspresjon på MIR-214 så vel som dens forløpere analysert i Huh-7 celler, med de cellene som overuttrykker ADAR1S og ADAR1L inkludert som kontroller. Den endogene MIR-214 ble redusert betraktelig ved overekspresjon av ADAR2 men ikke av ADAR1S og ADAR1L (Fig. 5A, venstre panel). Både pri-MIR-214 og utfyllende antisense (AS) RNA transkripsjoner (endogen) ble også redusert med overekspresjon av ADAR2 (Fig. 5A, midtre og høyre panel).
(A) RNA hentet fra Huh -7 celler infisert med individuelle lenti-ADARs som angitt ble brukt for vurdering av nivåene av endogent MIR-214 (til venstre), pri-MIR-214 (i midten), og utfyllende antisense transkripsjon av MIR-214 (komp-AS-RNA ) (til høyre). (B) De enkelte lenti-ADARs ble infisert i Huh-7 celler, som allerede ble transfektert med plasmidene eksogent som uttrykker enten den pri-MIR-214 eller den komplementære antisense transkripsjon (forb-AS-RNA) som angitt. RNA ble ekstrahert for kvantifisering av nivået av begge transkriptene tilsvarende. (C) De Huh-7-celler ble transfektert med plasmid som uttrykker villtype-komp-AS-RNA, eller de som innfører enten enkelt mutasjon som A (-37) G eller doble mutasjoner som A (-37 /-28 ) G. Nivåene av antisense-transkript ble deretter bestemt ved QRT-PCR. (D) De Huh-7 celler ble ikke smittet (mock), infisert med kontroll lenti-si-GFP (si-GFP), eller infisert med lenti-si-AS-214, som retter seg mot RNA transkripsjon komplementær til pri-MIR -214, for å vurdere effekter på uttrykket nivåer av komp-AS-RNA (til venstre), pri-MIR-214 (i midten), og MIR-214 (til høyre). (E) De Huh-7 celler ble transfektert med kontroll vektor eller plasmid som uttrykker komp-AS-RNA, for å vurdere effekten på nivåene av komp-AS-RNA (til venstre), pri-MIR-214 (i midten) og modne MIR-214 (til høyre). (F) Proteinlysatene hentet fra Huh-7 celler friske eller infisert med lenti-si-Luc eller lenti-pri-miR214 ble analysert ved Western blotting-analyse (til venstre). De Huh-7 celler transfektert med pGL3-vektor eller pGL3-Rab15-3’UTR reporter konstruksjonene ble infisert med lenti-si-GFP eller lenti-pri-miR214. Effekten på rapportøraktivitet, ble illustrert i forhold til den fra pGL3-vektor-transfekterte celler infisert med lenti-si-GFP (i midten). Proteinlysatene hentet fra Huh-7 celler enten friske eller infisert med ulike lentiviruses som beskrevet ble behandlet for Western blotting, sondering med antistoffer mot Rab15, ADAR1, ADAR2, og β-aktin (til høyre).
for ytterligere å undersøke redigering effekter på hver avskrift individuelt, ble den pri-MIR-214 og utfyllende antisense transkripsjoner overexpressed i Huh-7 celler separat, i kombinasjon med individuelle ADARs. Bare den komplementære RNA transkripsjon ble redusert med ADAR2 (Fig. 5B, venstre panel). Innføring av A-til-G endringer i posisjonene -28 og -37 i den komplementære transkriptet redusert sin RNA-nivå, lik den som er forårsaket av overekspresjon av ADAR2 (fig. 5C). Det viste således at ADAR2 kan føre til en reduksjon av den komplementære RNA-transkript for pri-MIR-214, gjennom A-til-I redigering ved sine spesifikke rester av -28 og -37 stillinger.
Som nevnt det er ingen direkte effekt av ADAR2 på overuttrykt pri-MIR-214 (fig. 5B, panel til høyre, felt 4), men som forårsake en reduksjon av endogen pri-MIR-214 (fig. 5A, midtre panel, spor 4). Det hevet muligheten for at ADAR2 redigering forårsaket en reduksjon av den komplementære transkript, som i sin tur redusert RNA-transkript av pri-MIR-214. For å løse dette, vi banket ned RNA transkripsjon komplementær til pri-MIR-214 i Huh-7 celler (fig. 5D, venstre panel), noe som førte til en nedgang på pri-MIR-214 (fig. 5D, midtre panelet) . En positiv regulerende effekt av komplementær transkripsjon av nivået på pri-MIR-214 ble dermed innblandet. I tråd med dette, overekspresjon av komplementær antisense RNA økt både pri-MIR-214 og modne MIR-214 (Fig. 5E).
For å undersøke nærmere den funksjonelle effekten av ADAR2-mediert redigering hendelsen på target gen av MIR-214, vi prøvde først å identifisere sin antatte målet genet i hepatocytter. De PicTar, TargetScan, og Miranda algoritmer påpekt Rab15, et medlem av RAS onkogen familien, som en antatt Mir-214 mål genet. For å teste dette, overexpressed vi MIR-214 i Huh-7 celler ved infeksjon med lenti-pri-MIR-214 lentiviruses, noe som resulterte i en reduksjon av nivået av Rab15 protein (fig. 5F, venstre panel). Infeksjon i Lenti-pri-MIR-214 kan også undertrykke pGL3-Rab15-3’UTR luciferase reporter aktivitet (fig. 5F, midtre panelet), som støtter at MIR-214 kan undertrykke uttrykket av Rab15 gjennom målretting sin 3’UTR. Videre overekspresjon av ADAR2, men ikke ADAR1S og ADAR1L, forårsaket en økning på Rab15 (fig. 5F, panel til høyre), noe som tyder på at ADAR2-mediert redigering hendelsen har funksjonell effekt på målet genet av MIR-214.
RNA transkripsjon Complementary til Pri-MIR-122 Regulerer Expression nivå av MIR-122
En tilsvarende analyse for MIR-214 ble også brukt for å håndtere effekten av ADAR2-mediert redigering for MIR-122. Først ble effekten av individuelle ADARs på modne MIR-122 evaluert i HepG2 celler, men det viste ikke signifikante effekter (Fig. 6A). Innføring av A-til-G-mutasjon ved -7 posisjonen av pri-MIR-122-transkript, den store redigerte området, ikke føre til vesentlige endringer i nivået for MIR-122 (fig. 6B). Derfor gjorde ADAR2-mediert redigering på pri-MIR-122 avskrift ikke påvirke biogenesis prosess.
