Abstract
Selv om c-Abl har i økende grad framstått som en sentral aktør i DNA skade respons, dens rolle i denne sammenheng er langt fra klart. Vi har studert effekten av inhibering av c-Abl-kinase-aktivitet med imatinib med kjemoterapi narkotika og fant en slående forskjell i celleoverlevelse etter kombinert mitoxantron (MX) og imatinib behandling sammenlignet med et panel av andre cytostatika. Den combinatory behandling indusert apoptose i HeLa celler og andre kreftcellelinjer, men ikke i grunnskolen fibroblaster. Forskjellen i MX og doksorubicin ble knyttet til en betydelig økning av DNA-skade. Transkripsjonelt aktive p53 akkumuleres i celler hvori human papillomavirus E6 vanligvis forringer p53. Kombinasjonsbehandling resulterte i caspaseaktivering og apoptose, men denne effekten ble ikke avhengig av enten p53 eller p73 aktivitet. Til tross for økt p53 aktivitet, cellene som ble arrestert i G2 fase ble skadet i dette sjekkpunktet, slik at cellesyklusprogresjon. Effekten etter MX behandling avhengig delvis på c-Abl: Kort interfering RNA knockdown av c-Abl gjengitt HeLa-celler mindre følsomme for MX. Effekten av imatinib ble redusert med c-Abl siRNA foreslå en rolle for katalytisk inaktive c-Abl i døden kaskade. Disse funnene tyder på at MX har en unik cytotoksisk effekt når den kinase-aktiviteten til c-Abl er sperret. Behandlingen gir økt DNA skade og c-Abl-avhengig apoptose, noe som kan gi nye muligheter for potensering av kreft kjemoterapi
Citation:. Alpay K, Farshchian M, Tuomela J, Sandholm J, Aittokallio K, Siljamäki E, et al. (2014) Hemming av c-Abl kinase aktivitet Renders kreftceller svært følsomme for Mitoxantrone. PLoS ONE 9 (8): e105526. doi: 10,1371 /journal.pone.0105526
Redaktør: Stephan Neil Witt, Louisiana State University Health Sciences Center, USA
mottatt: 9. desember 2013, Godkjent: 24 juli 2014; Publisert: 22 august 2014
Copyright: © 2014 Alpay et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert med tilskudd fra finske Medical Society, Åbo universitet Foundation og Kreftforeningen i Sør-Vest-Finland, Academy of Finland (prosjekter 137687 og 268360), den finske Cancer Research Foundation, Sigrid Juselius Foundation, Turku universitetssykehus EVO stipend (prosjekt 13 336). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kjemoterapi i tumorbehandling virker hovedsakelig gjennom forårsaker DNA-skade som induserer et komplekst nettverk av cellulære responser til syvende og sist fører til kreftcelledød. I kjernen av responsen er veier som gjenkjenner skaden, stanse cellesyklusen, og vedta døden kaskade. I kreftbehandling, strålebehandling og de fleste kjemoterapi fungere ved direkte å skade DNA eller forstyrrer DNA replikasjon. Den DNA-skade reaksjon av maligne og normale celler bestemmer effekt og bivirkninger av behandlingen. Skjebnen til cellen ligger i de komplekse DNA reparasjons trasé fremkalt av mange typer DNA-skader som kan oppstå etter gentoksisk behandling [1]. Vellykket reparasjon er kritisk for normal vev for å overvinne bivirkninger av behandlingen, men i tumoren kan føre til behandling motstand. Kreftceller vanligvis har samlet mutasjoner i gener involvert i DNA-reparasjon, og tilbyr en rekke terapeutiske muligheter for midler som modulerer de resterende funksjonelle reparere veier. Etter DNA-ødeleggende behandling, er skadet baser, mistilpasninger eller DNA-addukter som regel tolereres opp til en viss terskel kvantitativ, men kan gi opphav til mutasjoner hvis de forblir unrepaired [2].
c-Abl-inhibering er nylig blitt foreslått til å føre til en endret DNA-skade reaksjon [3]. c-Abl er en ikke-reseptor tyrosin-kinase som spiller en rolle i differensiering, adhesjon, celledeling, død og stressresponser og binder seg til flere proteiner involvert i apoptose trasé [4]. Endringene i c-Abl-proteinet konformasjon variere, og bindingspartnerne følgelig avvike [4] – [6]. Flere proteiner som ATM, DNA-PK, BRCA1, og transkripsjonsfaktorer p73 og RFX1 samhandle med c-Abl [5]. Mest spesielt, har c-Abl blitt rapportert til å samhandle med homolog rekombinasjon-reparasjon protein Rad51, heve [7] til uttrykk på gennivå, og aktivere den ved fosforylering. Aktiv c-Abl kan bli hemmet av lite molekyl stoffet imatinib (Glivec, STI-571), som er utviklet mot avvik BCR /abl fusjonsprotein som finnes i kronisk myelogen leukemi (KML) [8]. I CML-celler, er det første ekson av c-Abl erstattet av BCR-gensekvensen, noe som resulterer i konstitutivt aktiv c-Abl uttrykk. Denne avvikende kinase aktivitet resulterer i forbedret spredning, noe som kan være hemmet med imatinib. Imatinib er en ATP-kompetitiv hemmer stabiliserende inaktive c-Abl konformasjon [8]. Kinaseaktiviteten av c-Abl økes etter DNA-skade, og deretter øker aktiviteten av Atm og Atr [9]. Behandling med imatinib reduserer nivået av forhøyet RAD51 involvert i dobbel tråd pause (DSB) reparasjon og sensitizes flere celletyper til kjemoterapi [10] – [13]. Direkte interaksjon er også påvist mellom c-Abl og DNA-PK, som regulerer ikke-homologe ende sammenføyning [14].
Utviklingen av livmorhalskreft er en flertrinnsprosess som involverer cervix mucosal celletransformasjon ved onkogene humant papillomavirus (HPV) E6- og E7-proteiner. E7 inaktiverer cellesyklus regulator pRb, hemmer cellesyklus arrest, mens E6 inaktiverer tumor suppressor protein p53, nøkkelen regulator av apoptose og gentoksisk stress respons [15]. Fordi cervical kreft celler nesten alltid bære villtype p53, som er nedbrutt av høyrisiko HPV, ble p53 tidligere ansett som fullstendig ikke-funksjonell i cervikale kreftceller. Imidlertid har arbeidet med flere grupper nylig gjort klart at p53 inaktivering kan bli tilbakestilt om HPV E6-celler som bærer og som p53 status i cervikale kreftceller er ikke like god som for kreftceller med et mutert p53-gen [16]. Vi har tidligere sett at chemoradiation reactivates p53 i livmorhalskreftceller og fremmer celledød synergi. Imidlertid, når de analyseres i detalj, de p53-protein kan enten forsterke eller inhibere cytotoksisitet av kjemoterapi medikamentet [17], [18]. Muse embryonale fibroblaster null for c-Abl er defekte i p53 fosforylering og motstandsdyktig mot døden etter gentoksisk skade. Hemming av c-Abl av imatinib avtar hydroksyurea-indusert p53 fosforylering [9]. Vi antok at den aktive p53 kan forsterke DNA-reparasjon og således ønsket å studere effekten på celledøden av reparasjon modulasjon. c-Abl er generelt antatt å formidle pro-apoptotisk signalering fra ATM og ATR til p53 og p73, blant andre mål [3]. Vi studerte her effekten av c-Abl hemming på p53 aktivitet i HPV-positive celler og hvordan den forholder seg til de skader og døds svar.
En omfattende panel av rusmidler representerer alkylerende midler, platina narkotika, og topoisomerase og II-hemmere ble studert sammen med imatinib i livmorhalskreftceller bærer HPV og HPV-negative cellelinjer. Vi rapporterer her at c-Abl hemming av imatinib i kombinasjon med MX gentoksisk behandling resulterer i nedsatt DNA-reparasjon, opphør av G2 fase sjekkpunkt, og massiv apoptose.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cytotoksisitetsassayer
Den menneskelige livmorhalskreft cellelinjer Siha (HPV 16+), CaSki (HPV16 +), og HeLa (HPV 18+), brystkreft cellelinje MCF7, og vulva kreft cellelinje A431 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). De primære humane fibroblaster er blitt beskrevet før [19]. Cellene ble dyrket som monolag i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, ikke-essensielle aminosyrer (Euroclone, Wetherby, UK), og 50 ug /ml gentamycin (Calbiochem, San Diego, CA, USA ). HeLa p53 rapportørcellelinje, bærer p53 reporter plasmid ptkGC3p53-luc, er blitt beskrevet tidligere [18]. Til tross for tilstedeværelsen av HPV E6, selv HPV-positive cellelinjer som viser noen p53 aktivitet etter genotoksiske stress, men aktiviteten kan brytes ned av dominant-negative p53 (DDp53) eller ektopisk E6 drevet av en sterk promoter. Den Siha DDp53, Siha CMV, HeLa DDp53, HeLa CMV (tom vektor), og Siha E6 cellelinjer er også blitt tidligere beskrevet [18].
dominant-negative p53-uttrykkende cellelinje HeLa (HeLa DD ) ble avledet ved transfeksjon den parentale cellelinje med et plasmid som uttrykker en trunkert mus p53 inneholdende aminosyrerester 1-14 og 302-390 under kontroll av CMV-promoteren. Stabile transfektanter ble selektert med 0,8 mg /ml G418.
I korttids celleviabilitet analyser, 1-2 x 10
4 celler per brønn (avhengig av cellelinjen) ble utsådd i 96-brønners plater , og mediet ble erstattet med medikamenter fortynnet med medium. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av WST-1 middel (Roche, Mannheim, Tyskland) eller MTT middel (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA), og absorbans ble målt ved 450 nm (Multiskan plate microreader; Labsystems, Finland) eller ved 570 nm (Tecan flerplateleser;. Tecan, Sveits), henholdsvis
For klonogene vekstmålinger, Siha og HeLa-celler ble sådd inn i 6-brønners plater 48 timer før behandling. Cellene ble utsatt for behandling i 6 timer og deretter trypsinert og suspendert i friskt medium og sådd ut i 6-brønns plater med 3 uM imatinib. Siha cellene ble inkubert i 14 dager og HeLa-celler i 7 dager. Etter inkubering ble cellene fiksert med 01:01 aceton-metanol og farget med Giemsa (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA). Deretter kloner ble tellet enten manuelt eller analysert som tidligere beskrevet [20]. Caspase 3/7 aktivitet av celler gjennomgår apoptose ble bestemt ved bruk av Apo-ONE caspase-3/7 homogen caspase-analyse (Promega).
reagenser, narkotika, og antistoffer
kjemoterapi forbindelser mitoxantrone (MX) (Wyeth-Lederle, Finland), doxorubicin (DXR) (Nycomed, Roskilde, Danmark), cyklofosfamid (Orion Pharma, Espoo, Finland), topotekan (GlaxoSmithKline, Uxbridge, Middlesex, UK), etoposid (Pfizer), cisplatin (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA), docetaxel (Aventis), og karboplatin (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA) ble lagret og fremstilt som beskrevet [17]. Imatinib var en gave fra Novartis (Basel, Sveits). Stamoppløsningen av imatinib ved 200 mM ble fremstilt ved oppløsning av forbindelsen i DMSO. C-kit og PDGF-α og β reseptorblokker AG1296 ble kjøpt fra Calbiochem (kat. Nr. 658551). PDGF-BB ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Følgende antistoffer ble benyttet for Western blotting: monoklonalt DO-en for p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), kanin polyklonale anti-GADD45α (.. Cell Signaling, katt no 3518), kanin polyklonale anti-fosfor -PDGF β-reseptor (Cell Signaling, katt no 3161..), monoklonalt mus anti-RAD51 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA;. katt nr 35-6500), monoklonalt mus anti-cyclin B1 (BD Biosciences, katt. nr. 554 178) og monoklonale anti-p73 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). RNA ble isolert ved hjelp av RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Tyskland).
Short interfererende RNA og transfections
c-Abl kort interfererende RNA (siRNAs) ble hentet fra Invitrogen (Stealth, Carlsbad, CA, USA,…. katt ingen 1299003), og ikke-måls siRNA (Qiagen, katt ingen 1.027.281) ble brukt som kontroll. Transfeksjon av cellene ble utført med 75 nM av tre individuelle siRNAs rettet mot c-Abl og kontrollere siRNA bruker siLentFect Lipid Reagens (Bio-Rad).
p53 reporter analysen
Stall ptkGC3p53luc-bsd Siha, CaSki, og HeLa-cellelinjer, så vel som sammensetningen av p53-reporter plasmid ptkGC3p53-luc er blitt beskrevet tidligere [17]. Cellene ble sådd på 96-brønners plater (10
4 celler /brønn). Etter noe som åpner for cellebinding i 24 timer, ble behandlingene begynt for de angitte varigheter. De levende celler i hver brønn ble bestemt kolorimetrisk med den WST-1-assay. Deretter ble cellene renset med PBS og belagt med 100 pl av en blanding inneholdende 50% PBS og 50% Bright-Glo luciferase-assay-reagens (Promega, Madison, WI, USA). Luciferaseaktiviteten ble kvantifisert ved hjelp av en hybrid capture luminometer (Digene, Gaithersburg, MD, USA). Luciferasepreparater målingene ble delt av WST-en verdi for å hente normalisert reporter aktivitet.
Western blotting
Cellene ble høstet ved hjelp av 200 ul standard 1 × SDS sample buffer. De resulterende fullcelle-ekstrakter ble kokt og deretter separert ved 10% SDS-PAGE og overført til Immobilon-P polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranene ble undersøkt med de angitte primære antistoffer, og sekundær deteksjon ble gjort med anti-mus pepperrot (HRP) (GE Healthcare, NJ, USA), anti-kanin HRP (DAKO, Glostrup, DK), og ECL (GE Healthcare , NJ, USA). Beta-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Western Blot filmene ble digitalisert med en ChemiDoc MP gel analyse plattform (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). og analysert med Fiji (ImageJ) ver 1.47q (Wayne Rasband, NIH, USA) ved hjelp av Gels alternativet.
Flowcytometri
Cellesyklus analyse ble utført av flowcytometri. Cellene ble høstet med trypsinering sammen med flytende ikke-levedyktige celler. Cellene ble vasket en gang med PBS og suspendert i natriumcitrat-buffer (40 mM Na-sitrat, 0,3% Triton X-100, 0,05 mg /ml propidiumjodid, PBS) 20 minutter før analyse. Cellesyklus analyse ble utført ved hjelp FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, USA) og Cellquest Pro-programvare (Becton Dickinson). Cellesyklus og apoptose analyser ble utført med ModFit LT (Verity Software House, Inc., Topsham, ME, USA) og rennende programvare ver. 2,5 (Mr. Perttu Terho, Turku Centre for bioteknologi, Finland, www.flowingsoftware.com), henholdsvis. For ytterligere å analysere apoptoseinduksjon etter MX og MX + imatinib behandlings HeLa-celler ble dyrket i 6-brønns plater og behandlet med medikamenter som er angitt i 24 og 48 timer. Medium og cellene ble samlet og prøvene ble farget med Annexin-V-FITC kit (ab14085; Abcam, Cambridge, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. Data ble kjøpt med en FACSCalibur flowcytometer, og analysert med Flowing Software.
Sanntids kvantitativ revers transkripsjon PCR
RT-PCR-metoden har blitt beskrevet før [18]. Primerne var HPV 18 E6, fremover, 5′-TGGCGCGCTTTGAGGA-3 «, og omvendt, 5′-TGTTCAGTTCCGTGCACAGATC-3′; og EF1α, fremover, 5»-CTGAACCATCCAGGCCAAAT-3 «, og omvendt, 5′-GCCGTGTGGCAATCCAAT-3». Mengden av HPV 18 E6 transkripsjoner ble normalisert mot avlesninger for EF1α.
Comet assay
DNA-skader ble undersøkt med en enkelt celle gelelektroforese kit (Trivigen, Gaithersburg, MD, USA). Analysen ble utført under alkaliske betingelser for å detektere både enkelt- og dobbelt-trådet DNA-skade. Enkelt-celle gel-elektroforese av DNA ble utført som beskrevet av produsenten. Bilder ble tatt med et Olympus BX60 fluorescens mikroskop (Zeiss Axiovert 200 M) ved × 20 forstørrelse.
Time-lapse mikros
Bilder ble tatt til fange i en time intervall i 72 timer med IncuCyte ZOOM kinetic bildesystem (Essen Bioscience, Michigan, USA). Representative brønner ble valgt, og filmene ble konstruert med ImageJ ver 1.47d (Wayne Rasband, NIH, USA). Bar representerer 200 mikrometer.
statistikker
For å evaluere forskjeller mellom gruppene, vi brukte Student t-tester. En p-verdi under 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans.
Resultater
Hemming av c-Abl av imatinib potenserer cytotoksiske effekten av mitoxantrone i kreftceller, men ikke i grunnskolen fibroblaster
styrken på imatinib i styrke cytotoksisitet ble vist i et stort panel av kjemoterapi narkotika. I korttids cytotoksisitetsanalyser, imatinib alene ikke var cytotoksisk til noen av cellelinjene på 3 uM til 10 uM. Når HeLa, CaSki, og Siha celler ble behandlet med topoisomerase I inhibitorer (topotekan og etoposid), nukleosidanaloger (gemcitabin, fluorouracil og Cytarabin), alkyleringsmidler (cyklofosfamid og dacarbazine), eller cisplatin, imatinib ikke forbedre cytotoksisitet (data ikke vist). Heller ikke det påvirke anthracycline- (doxorubicin, DXR) behandlede celler (Figur 1a). Effekten av karboplatin ble forsterket to ganger ved tilsetning av imatinib i 48 timer (data ikke vist). I motsetning til alle de andre kjemoterapeutiske midler som ble testet, viste imatinib en dramatisk effekt sammen med mitoxantron (MX), en topoisomerase II-inhibitor (figur 1A). Effekten av imatinib var lik mellom 3 uM og 10 uM indikerer at kinase aktivitet er blokkert i de undersøkte cellelinjer, selv ved 3 pM.
(A) Humant livmorhalskreft (HeLa celler) ble behandlet med MX ( 0,6 uM), DXR (0,8 uM), imatinib (10 uM) eller deres kombinasjoner. WST cellelevedyktighet Analysen ble utført etter 12 timer, 24 timer og 48 timer. Resultatene ble normalisert med celle nummer i mellom bare inneholder brønner. *** P 0,001 uavhengige utvalg t-test. (B) både A-431 vulvar carcinom cellelinje som har en missense mutasjon i p53-genet og MCF-7 brystkreftcellelinje som har en vill-type p53-genet viser en forbedret effekt når MX og imatinib kombineres. Imatinib øker ikke cytotoksisitet av MX i grunnskolen fibroblaster. Målinger ble utført ved 48 timer ved bruk av WST celleviabilitet assay. ** P 0,01, *** p 0,001 uavhengige utvalg t-test. (C) klonogene assay. Imatinib forbedrer MX cytotoksisitet både i HeLa CMV-cellelinjen med vill-type p53 og tom vektor og HeLa DDp53 cellelinje som bærer en dominant negativ p53. Celler ble behandlet med hvert medikament i 12 timer. Deretter ble mediet erstattet med friskt medium uten medikamenter. Konsentrasjonen av imatinib var 3 uM, mens MX ble anvendt i forskjellige konsentrasjoner i området fra 1 nM til 40 nM. Kloner ble tellet under mikroskop. Eksperimentet ble utført i triplikat, gjennomsnitt ± SD. *** P. 0,001
Den forbedrede effekten ble også sett i CaSki og Siha celler men i mindre grad (figur S1). Cellelinjene som vi primært ønsket å prøve ble avledet fra HPV-positive livmorhalskreft. Imidlertid synes effekten å ikke ha vært begrenset til disse cellene. Medikamentene ble testet med to kreftcellelinjer av forskjellig opprinnelse: Den vulvar carcinom cellelinjen A431 har en missense mutasjon i p53-genet, og MCF7 brystcancercellelinje har en villtype p53. Overlevelsen ble påfallende lik HPV-positive cellelinjer (figur 1B). I motsetning til dette primære ikke-transformerte fibroblaster ikke var mer følsom når imatinib ble tilsatt til MX behandling (figur 1B). Dette resultatet indikerer at den observerte effekten er ikke begrenset til HPV-positive cancerceller, men kan forekomme større utstrekning uavhengig av p53 status. Imidlertid kan ikke-transformerte celler vise motstand mot denne behandlingen.
økt effekt av imatinib ble også sett i innfødt og annerledes endret HeLa og Siha celler på en måte uavhengig av enten p53 eller E6 (figur S2). MX ble ytterligere undersøkt i klonogene vekstmålinger for å overvåke den langsiktige utvinningen kapasitet av cellene. konsentrasjoner MX så lave som 1 nM sammen med tre mikrometer imatinib hemmet HeLa celleklonal vekst helt, både p53-null og tomme vektorførende celler (figur 1C). I Siha cellelinjer, tre mikrometer imatinib alene ikke påvirker klonal vekst. Sensitiviteten av CaSki celler for imatinib tillegg var mellom den for Siha og HeLa-celler (Figur S3).
Mitoxantrone induserer caspase 3/7, som forsterkes ved å blokkere c-Abl med imatinib
behandlingen med MX øker frigivelsen av caspase 3 og 7 fra mitokondriene indikative av apoptose. Imatinib alene ikke er i stand til å endre disse nivåene (figur 2). Celler ble behandlet med 0,6 uM MX og 0,8 uM DXR øket kaspase-aktivitet 2,5 ganger, mens MX + imatinib kombinasjonsbehandling øket aktivitet fire ganger. Imatinib ikke øke aktiviteten indusert av DXR alene.
HeLa-celler ble behandlet med medikamenter som er angitt i 48 timer. Deretter ble friskt medium erstattet og caspase 3/7 aktivitet ble målt ved anvendelse av ELISA-analysen. Eksperimentet ble utført i triplikat, gjennomsnitt ± SD. *** P 0,001 T-test
Hemming av c-Abl kinase aktivitet øker DNA-skader i MX-behandlede celler
Legge imatinib til MX økt kometen tailing i HeLa celler. mens imatinib alene ikke har noen effekt (figur 3A). Imatinib induserte ikke tailing i DXR-behandlede celler. Mengden av protein GADD45α økt noe, selv i de helcellelysater med MX + imatinib (5 ganger, figur 3B). Denne økningen synes å være regulert på transkripsjonsnivået, fordi vi har også observert en markert økning i GADD45α transkripsjonsnivåer etter kombinasjonsterapi i microarray RNA-analyser (upubliserte data). Som p53 protein opphopning i celle stress, GADD45α transkripsjons øker under stress, inkludert med DNA-skade. Både DXR og MX øket RAD51 nivåer (10 ganger), og imatinib forbehandling hemmet økning like (20%), men forbedret akkumulering av p53 når de tilsettes til MX (13 fold, figur 4).
(A) DNA-skader i HeLa-celler ble undersøkt ved hjelp av Comet assay etter behandling med MX (0,6 mm), DXR (0,8 mm) og imatinib (5 mm), eller kombinasjoner. Cometting (tailing) viser DNA-skader. (B) Imatinib kombinert med MX øker nivået av GADD45α. Western blot av GADD45α protein nivåer fra helcellelysater. Jakten celler ble behandlet med MX (0,6 mm), DXR (0,8 mm), imatinib (5 mm), eller kombinasjoner i 30 timer.
Western blot av p53 og RAD 51 i HeLa celler. Imatinib kombineres med MX øker p53 protein nivåer i HeLa celler. RAD51 nivå ble noe redusert i celler behandlet med imatinib og MX. Cellene ble behandlet med MX (0,6 mm), DXR (0,8 mm), imatinib (5 mm) eller kombinasjoner i 30 timer.
Mitoxantrone-indusert p53-aktivering er forbedret ved å hemme c-Abl kinase aktivitet
kjemoterapi narkotika brukes i denne studien fremkalle ulike former for DNA-skade, som p53 i målcellene sansene. p53 er aktivert i livmorhalsen til tross for nedbrytning av E6 [16], [19]. Vi målte p53 reporter aktivitet i HeLa, CaSki, og Siha cellelinjer med DXR, MX, og cisplatin. Når medikamentene ble sammenlignet, cisplatin-indusert reporteren mer enn MX i HeLa og CaSki-celler, men på samme måte i Siha celler, og 0,6 uM MX alene ikke aktiverte reporteren i det hele tatt i HeLa-celler ved 48 timer. DXR indusert reporteren mer enn cisplatin og MX i alle cellelinjer (tabell 1). Imatinib alene ikke i betydelig grad endre aktiviteten i noen av cellelinjene. Tilsetning av imatinib til cisplatin noe redusert aktivitet, men det var ingen effekt for DXR. I motsetning til dette å tilsette imatinib til 0,6 uM MX øket aktivitet i alle cellelinjer, med 50% i Siha celler, men fire ganger i HeLa-celler og åtte ganger i CaSki-celler. Begrensningen med denne tilnærmingen er at en direkte sammenligning mellom cellelinjer ikke kan foretas på grunn av forskjellige mengder av integrerte reporter plasmid. I samsvar med rapportør analysene, ble p53-protein-nivå også signifikant økt i Western blot analyser (figur 4). Vi så ingen nedgang i p53 nivå med imatinib alene, resultater som var i samsvar med reporter analyseresultater.
p73 er et medlem av p53 protein familien og samhandler med c-Abl direkte og kan også indusere apoptose. De p73 protein nivå endret seg ikke etter behandlingene (figur S4).
Imatinib endrer ikke HPV E6 nivåer
De fleste av cytostatika redusere mengden av E6 mRNA [17]. Vi ønsket å vite hvorvidt imatinib forårsaker reduksjon i E6 ekspresjon i HeLa-celler, enten alene eller i kombinasjon med MX. Vi fant at 1 uM MX senker E6 mRNA-nivåer i HeLa-celler med omtrent 50%, og at 5 uM imatinib alene ikke reduserer nivået av E6 mRNA i disse cellene. En kombinasjon av 5 uM imatinib og 1 pM MX ikke redusere nivået av E6 mRNA i HeLa-celler mer enn 1 um MX alene.
Imatinib opphever S-fase rest forårsaket av MX og øke apoptose
i HeLa-celler behandlet med imatinib alene, ved 24 timer, cellesyklusfordelingen var den samme som i celler med medium alene, men det var litt flere celler i S-fasen etter 48 timer (figur 5A). Ved 24 timer og spesielt 48 timer, DXR akkumulert i cellene i G2-fasen. Legge imatinib indusert S fase arrest i programvaren analyse; imidlertid, ved 48 timer med DXR + imatinib, det syntes å være en liten G2 populasjon at analyseprogramvaren ikke oppdaget. MX-behandlede celler kommet på 24 timer til S og G2, men utvidet inkubasjon etter 48 timer viste en klar G2 arrest. Legge imatinib til MX viste på 24 timer i befolkningen utvikler seg til G1, som indikerer opphør av arrest. Ved 48 timer var det ingen celler utover i S-fasen, men likevel også en klar G1 befolkning. Dette funnet tyder på at cellene hadde tidlig inn direkte fra S-fasen til mitose og at imatinib kjørte denne effekten. Alternativt kan MX + imatinib indusere en forsinkelse fra G1 /S til G2. Men flere mislykkede mitoser ble påvist i time-lapse video av MX + imatinib-behandlede celler favoriserer tolkningen at cellesyklus arrest ble avskaffet (Video S1). Vi har også bestemt at cyclin B1 nivåer, en godt anerkjent mitotisk markør, i stoffet behandlet cellepopulasjoner for å samle ytterligere bevis for den oppfatningen at MX + imatinib co-behandlede cellene er i stand til å fortsetter i cellesyklus og skrive M-fase. Vi har funnet at behandling av HeLa-celler med DXR, DXR + imatinib, MX og MX + imatinib fører til opphopning av cyklin B1. Proteininnholdet av de imatinib behandlede celler var under deteksjonsgrensen på samme måte som de ikke-behandlede kontroller som oppviser basalnivået cyklin B1 ekspresjon (fig S5).
(A) Celler ble behandlet med MX (0,6 uM), DXR (0,8 mm), imatinib (5 mm) eller kombinasjoner for 24 og 48 timer. Etter behandling ble cellene høstet og farget med propidiumjodid for å kvantifisere DNA-innhold ved hjelp av strømningscytometri. Histogrammene viser cellesyklusfordelinger. (B) Annexin V-(X-aksen) mot PI (Y-aksen) farging av HeLa-celler behandlet med medikamenter som er angitt i 48 timer. Prosenter indikerer tidlig (nedre høyre kvadrant) og sen (øvre høyre kvadrant) apoptotisk brøkdel. MX og imatinib viser en tydelig synergistisk virkning i apoptose-induksjon. Utslipp spektra av PI og DXR falle på FL2 kanalen, noe som gjør det umulig å skille tidlig apoptotisk befolkningen fra slutten av apoptotiske befolkningen i DXR-behandlede celler. Men når de riktige kvadrantene ble lagt sammen, var det ingen forskjell mellom DXR og DXR + imatinib populasjoner.
Imatinib økt under G1 hendelser i MX-behandlede HeLa-celler, dels indikerer apoptose. Under G1 befolkningen var den største (38,6%) i MX + imatinib gruppe på 48 timer. Imatinib økte også DXR-induserte sub G1, men i en mindre grad (17,8%) etter 48 timer (Tabell S1). For ytterligere å analysere mulige apoptose vi farget cellene med annexin V, som er en markør for tidlig apoptose. Vi fant at imatinib øker andelen av apoptotiske celler i MX-behandlede celler i betydelig grad, men klarte ikke å påvise eventuell økning når imatinib ble tilsatt til DXR (figur 5B) Strømningscytometri resultatene er i samsvar med caspase eksperimentet støtter ideen om at imatinib med MX er mer potent induserer celledød enn med DXR. Imatinib har tidligere blitt rapportert å forårsake G1 arrest i hode- og halskreft cellelinjer [21] mens MX og DXR årsaken G2 arrest [22]. Vi så ingen G1 rest med imatinib alene.
nedregulering av c-Abl med siRNA hindrer cytotoksisiteten av MX + imatinib
Imatinib og MX viste en additiv virkning i å redusere antallet kontroll siRNA HeLa celler. Når c-Abl ble slått ned med siRNA, fant vi at spredning av ubehandlede celler ble redusert med 30-50% i gjentatte forsøk (figur 6, Video S2). Både vekstkurver og time-lapse mikroskopi data viser en svak veksthemming i c-Abl siRNA HeLa-celler. Men verken kontroll siRNA eller c-Abl siRNA alene indusert celledød. Dette resultatet tyder på at c-Abl er nødvendig for normal proliferasjon av disse cellene. Målretting av c-Abl i HeLa celler ved siRNA gjengitt cellene mindre følsom for MX. CaSki-celler var også mindre følsom for MX når c-Abl ble nedregulert med siRNA, men ingen inhibering av proliferasjon ble observert. Disse cellene var vanskeligere å transfektere med siRNA og bare 40% effekt ble oppnådd. Dette kan også forklare hvorfor spredning ikke ble inhibert i disse cellene. Videre combinatory effekten av imatinib ble betydelig redusert, impliserer c-Abl som avgjørende målet for imatinib i dette utfallet. Dette funnet er også i tråd med eksperimenter med andre mål for imatinib, PDGF og c-Kit. AG1296 er kjent for å potente hemmere av signalisering av humant PDGF α- og p-reseptorer, så vel som den aktuelle stamcellefaktor-reseptor c-Kit, 1 pM og 5 uM konsentrasjoner henholdsvis. AG1296 kunne ikke etterligne effekten av imatinib med MX (figur 7A). Videre MX ikke har noen effekt på fosforylering av PDGF-reseptor (figur 7B). Videre siRNA eksperiment underforstått at den kinase-aktiv c-Abl er ansvarlig for celleoverlevelse etter MX skade. Av betydning, dette eksperimentet viser til ulike roller for kinase-aktiv og kinase-inaktive c-Abl. Kinase-inaktive c-Abl ser ut til å være nødvendig for apoptose med MX, men kinase-aktiv c-Abl er en nøkkelspiller for DNA-skade reparasjon etter MX i HeLa celler.
(A) HeLa og CaSki Celler ble transfektert med ikke-målretting eller c-Abl siRNA (75 nM). Western blot-analyse ble utført for å undersøke effekten av siRNA. Nivå av c-Abl ble kvantifisert og korrigert for β-aktin nivå. Verdiene er proporsjonert til kontrollnivåer siRNA for hver cellelinje. (B) HeLa, og (C) CasKi-celler ble transfektert med kontroll eller c-abl siRNA. Etter treansfection celler ble behandlet med MX (0,6 uM), imatinib (5 uM) og deres kombinasjon i 48 timer. Relative mengde av overlevende celler ble bestemt ved WST-1-assay. Resultatene er fra to uavhengige eksperimenter i triplikater. Data er vist som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. NS, ikke signifikant.
(A) Cellene ble behandlet med MX og AG1296 eller deres kombinasjoner i 48 timer og målt med WST-1-analysen. Wang et al. Chen et al.
