Abstract
heparanase er en endoglykosidase enzym som finnes i aktiverte leukocytter, mastceller, placenta vev, nøytrofile granulocytter og makrofager, og er involvert i tumormetastase og vev invasjon. Den presenterer et potensielt mål for kreftterapi og forskjellige molekyler som er blitt utviklet i et forsøk på å hemme den enzymatiske virkning av heparanase. I et forsøk på å utvikle en ny terapeutisk med en tilhørende diagnostisk analyse, har vi tidligere beskrevet høy affinitet aptamerer utvalgte mot heparanase. I dette arbeidet, demonstrerte vi at disse anti-heparanase aptamerer er i stand til å inhibere vev invasjon av tumorcellene som er forbundet med oral cancer og bekreftet at en slik inhibering er grunnet hemming av enzymet, og ikke på grunn av andre potensielt cytotoksiske virkninger av aptamerer. Videre har vi identifisert en kort 30 baser aptamer som en potensiell kandidat for videre studier, da dette viste en høyere evne til å hemme vevsinvasjon enn dens lengre motpart, så vel som et redusert potensial for kompleksdannelse med andre ikke-spesifikke serumproteiner. Til slutt ble aptamer funnet å være stabil og derfor egnet for anvendelse i humane modeller, som det viste ingen degradering i nærvær av humant serum, slik at det er en potensiell kandidat for både diagnostisk og terapeutisk bruk
Citation.: Simmons SC, Jämsä H, Silva D, Cortez CM, McKenzie EA, Bitu CC, et al. (2014) Anti-heparanase aptamerer som potensielle diagnostiske og terapeutiske midler for Oral Cancer. PLoS ONE 9 (10): e96846. doi: 10,1371 /journal.pone.0096846
Redaktør: Sophia N. Karagianniss, Kings College London, Storbritannia
mottatt: 27 september 2013; Godkjent: 11 april 2014; Publisert: 08.10.2014
Copyright: © 2014 Simmons et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dr. Bonacossa ble støttet av en post-doc fra Conselho Nacional de Pesquisa Científica – CNPq, på omfanget av programmet Science uten grenser, MCTI, Brasil. Dr. Missailidis ønsker å erkjenne økonomisk støtte fra Conselho Nacional de Pesquisa Científica – CNPq, på omfanget av en senior gjesteforsker program på FIOCRUZ for en del av dette prosjektet. Forskergruppen av Prof. Salo ble støttet av Academy of Finland, det finske Cancer Organisasjoner, finsk Dental Society Apollonia og Oulu universitetssykehus Kevo stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
heparanase er en β-1,4-endoglykosidase enzym [1] som deltar i ekstracellulære matriks (ECM) nedbrytning og remodellering [1]. Den heparanase genet ble først klonet i 1999 av Vlodavsky og Parish grupper i den forutgående rygg mot rygg Nature Medicine papirer [2], [3].
Den begynnende polypeptid er et 543 aminosyre forhånds proenzym, som etter fjerning av signalpeptidet sekvensen i det endoplasmatiske retikulum, gjennomgår proteolytisk prosessering i sene endosomer /lysosomer av cathepsin-L lignende proteaser [4] på steder Glu109-Ser110 og Gln157-Lys158, hvilket ga en N-terminal 8 kDa polypeptidet, en C- -terminale 50 kDa-polypeptidet, og mellom dem en 6 kDa linker polypeptid [3]. De 50 kDa og 8 polypeptider knytte til å danne et heterodimert aktivt enzym, mens den 6 kDa linkeren er skåret ut og degradert [5], [6].
heparanase aktivitet er forbundet med aktiverte leukocytter, mastceller, morkakevevet og makrofager og enzymet blir utskilt av aktiverte CD4 + T-celler [7], [8], [9], blodplater [3], neutrofiler og metastatiske celler [10]. Ved sekresjon av heparanase fra metastatiske tumorceller, hydrolyserer enzymet de glykosidiske bindinger av heparansulfat kjettinger festet til proteoglykaner til et produkt av 10-20 sukkerenheter i lengde [11], som fører til penetrasjon av endotelceller i blodårer og målorganer av tumorcellen. Frigjøring av bundne cytokiner og vekstfaktorer sekvestrert av heparansulfat kjeder i vev [12] ytterligere forenkler vekst av tumoren og fremmer angiogenese og spredning av sekundære tumorer [13]. Nivåene av heparanase uttrykk i tumorceller korrelerer med sin metastatiske potensial; forhøyede nivåer av heparanase mRNA og protein som har blitt funnet i kreftpasienter som ikke viser signifikant kortere postoperative overlevelsestider enn pasienter som heparanase nivåer er normalt [13], [14].
heparanase oppregulering i kreftceller fra myelom, lymfoblastoid og brystkreft gjenspeiler i styrking av exosome sekresjon med et utvidet innhold av syndecan-en, VEGF og HGF hvis roller er nært knyttet til tumor aggressivitet [15]. I tillegg til sin funksjon i kreft progresjon, heparanase enzymet spiller også en viktig rolle i betennelse
per se Hotell og kreftutvikling relatert til betennelsesprosessen [16]. Enzymet er blitt detektert i en rekke av immunceller som T og B-celler, makrofager, nøytrofiler og mastceller. Det har vist seg å mediere ekstravasering gjennom endoteliale barrierer via ombygging av ECM heparansulfat, som deretter gir handel til steder med inflammasjon [10], [17], [18]. Heparanase ekspresjon har vært knyttet til tumorgenese i en rekke forskjellige krefttyper, for eksempel, akutt myelogen leukemi [19], blære, hjerne [20], bryst [21], tykktarm [22], gastrisk [23], øsofageal [24] , oral [25], bukspyttkjertel [14], og livmorhalskreft [26], som tyder på at det kan være et egnet mål for medikamentterapi. For tiden tilgjengelige inhibitorer av heparanase omfatter nøytraliserende antistoff [27], peptider [28] og små molekyler [29], [30].
En rekke modifiserte hepariner og sulfaterte oligosakkarider har også blitt vist å være potente inhibitorer heparanase med lovende anti-tumor aktivitet og har nå avansert til de kliniske testfasen. Eksempler på dette er SST0001, M402, PI-88 og PG545. SST0001 er en fullstendig N-acetylert heparin modifisert som mangler antikoagulerende aktivitet og vist å være en selektiv heparanaseinhibitor. Det er for tiden i fase I /II kliniske studier for behandling av myelom. M402 er et N-sulfatert modifisert heparin som binder et bredere spekter av vekstfaktorer sammenlignet med SST0001. Dette har kommet til fase I /II kliniske studier som en kombinasjonsbehandling med kjemoterapi agenten gemcitabin for behandling av metastatisk kreft i bukspyttkjertelen. PI-88 er et sulfatert polysakkarid med potent anti-angiogene og anti-metastatisk aktivitet og med redusert uønsket antikoagulerende aktivitet. Den har nådd fase III kliniske studier for post-reseksjon leverkreft. PG545 er en tetrasakkarid som har overlegne farmakokinetiske egenskaper på grunn av høy grad av lipofilitet. Det har vist potent anti-tumor aktivitet i PI88 resistente modeller, men Fase I kliniske studier i slutten av 2010 ble avlyst på grunn av uventede reaksjoner på injeksjonsstedet [31].
aptamerer er korte DNA eller RNA oligonukleotider utviklet for diagnostisk og terapeutisk bruk som viser høy bindende affinitet og spesifisitet for målmolekylene [32] – [34]. Affiniteten til aptamerer har blitt sammenlignet med den til antistoffer (dvs. i det nanomolare området), men som er mindre aptamerer (8-25 kDa sammenlignet med 150 kDa størrelsen av antistoffer), de kan både trenge inn i vevene og fjernes fra plasma bare minutter etter intravenøs administrasjon uten å utløse en immunrespons, noe som kan være nyttig når du bruker dem som diagnostiske agenter [35]. For terapeutisk anvendelse, er de i stand til å beholde sin funksjon og bindende egenskaper ved modifisering med andre grupper for å forbedre deres stabilitet og oppløselighet, samtidig redusere deres toksisitet og plasma-clearance [35] – [38], [39] – [41]. Typisk aptamerer er fra 22 til 100 baser i lengde, og inneholder en region med variabel sekvens, flankert av kjente sekvenser, som brukes til forsterkning og identifikasjonsformål. Et stort repertoar av forskjellige sekvenskombinasjoner (vanligvis i området 10
15) i det sentrale domenet skaper mange forskjellige folde ordninger, spesifisiteten og bindingsaffiniteten for forskjellige molekyler. Aptamerer stilles typisk basert på den SELEX (systematiske utskilling av ligander med eksponensiell anrikning) prosedyre [42], selv om en rekke andre utvelgelsesmetoder er for tiden tilgjengelige [43] -. [45]
aptamerer tidligere ble generert mot aktiv human rekombinant heparanase ved hjelp av en modifisert protokoll SELEX og salt eluering serie. Utvalg ga tre aptamerer, «1,5 M korte», en 30 basis avkortet versjon av «1,5 M lang «(73 baser), og» 3,0 M «(55 baser). ELISA og fluorescens titreringer skilte de to lengre aptamerer som viser høyere affinitet og anerkjennelse av heparanase i placenta celler, mens morkakevevet flekker favoriserte «1,5 M lang». Dette ble bekreftet i en Matrigel invasjonen assay ved hjelp av ovarialcancer celler tidligere vist seg å kreve heparanase for invasjonen [46]. To ekstra aptamerer, betegnet «rosa» og «yellow» ble valgt ut mot linkerpeptid sekvensen av pro-heparanase, da disse kan ha en funksjon i å inhibere dannelsen av den aktive heterodimer enzymet, ved å blokkere peptid protease eksisjon.
i denne studien ble det arbeidet med å ytterligere karakterisere de tidligere valgte aptamerer og for å vurdere deres potensial som et diagnostisk eller terapeutisk middel. Stabiliteten av aptamer ble bedømt ved inkubasjon over forskjellige tidspunkter med humane og museserum, og polyakrylamid-gelelektroforese som brukes for å bestemme graden av dens degradering av nukleaser til stede i serum. En ytterligere invasjon assay, i tillegg til det foregående mus EHS-tumor avledet Matrigel invasjon analysen ble utført ved å bruke humane uterin leiomyom vev og heparanase-uttrykkende humane orale plateepitel carcinom-celler (HSC-3), i dette eksperimentet representerer et mer autentisk bilde av det som skjer i humant vev. Videre ble en celle cytotoksisitet /celleproliferasjonsanalyse utføres for å verifisere at enhver inhibering av invasjon observert var ikke et resultat av cytotoksisitet på den delen av aptamerer. Til slutt ble interaksjoner av aptamerer med serumproteiner undersøkt for å bekrefte både spesifisiteten til aptamerer og studere deres potensial transport av slike proteiner i blodet. Økende litteratur i DNA aptamer feltet har vist at disse molekylene har enorm terapeutisk potensial i kreftbehandling behandling, og har allerede blitt brukt som såkalte eskorte molekyler for å levere narkotika til kreftceller (anmeldt i [47]). AS1411 er et eksempel på en DNA aptamer som har kommet til klinisk utprøvning. Den aptamer i dette tilfellet er spesielt rettet mot nucleolin protein og har vært trialed med metastatisk, klar celle, nyrecellekreft pasienter som har vært resistente mot tidligere tyrosinkinasehemmere [48].
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneskelig tunge plateepitel karsinom celler, HSC-3 (JCRB 0623, Osaka National Institute of Health Sciences, Osaka, Japan), ble dyrket i vekstmedier: 50% DMEM 50% Hams F-12 (Sigma Aldrich) og i tillegg supplert med 50 ug /ml askorbinsyre, 250 ng /ml amfotericin B, 5 ug /ml insulin (bovin bukspyttkjertel), 0,4 ng /ml hydrokortison og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum. Kulturen supplement ble kjøpt fra Sigma Aldrich. Alle cellekulturer ble utført ved anvendelse av pre-oppvarmet reagenser. Celler ble inkubert i 95% luft /5% CO
2 ved 37 ° C. Celler ble passert ved å fjerne media og vasking med HBSS (Sigma Aldrich), og deretter tilsette 3 ml 1 x Trypsin-EDTA (Sigma Aldrich) og inkubering i 5 minutter. Den Trypsin-EDTA ble inaktivert ved å legge 7 ml vekstmedier og fjerne eventuelle celleklumper. 1 ml cellesuspensjon (pluss 24 ml friske vekstmedium) ble opprettholdt i kolben for vedlikehold av aksjer og de resterende 9 ml ble tellet og anvendt for eksperimenter.
organotypiske invasjon analyse og analyse av inhibitorene på invasjon
organotypiske invasjonen analysen og kvantifisering av resultatene ble utført som beskrevet i Nurmenniemi
et al
. (2009) [49]. Kort, 7 × 10
5 HSC-3 celler suspendert i media som inneholder den aktuelle aptamer (ikke er relatert, 1,5 M kort, 1,5 m lang, 3 M, rosa og gul) eller et antistoff mot heparanase (HPA Ab, 0,7 mm) . Også (2- {4 – [(E) -3- (4-bromfenyl) acryloylamino] -3-fluorfenyl} benzooxazol-5-yl) eddiksyre, forkortet til BAFB, ble anvendt, da dette viste seg å ha hemmende virkning ved heparanase i tidligere studier [29] (Tabell 1). Hver aptamer eller antistoff ble tilsatt ved 1 uM til HSC-3 cellesuspensjon i begynnelsen av studien og i den HSC-3 cellekulturmedium gjennom hele eksperimentet. Myom disker uten HSC-3-celler og HSC-3-celler uten inhibitor ble også inkludert i analysen som kontroller. Skivene ble inkubert i 14 dager ved 37 ° C med 5% CO
2 med media inneholdende de aktuelle inhibitorer. Mediene ble samlet, sentrifugert og ferske media med inhibitorer ble endret på dager 4, 7, 10 og 14. Fra de innsamlede medie supernatantene, nedbrytningsproduktene av myom vev type III kollagen ble analysert ved hjelp SP99 radioimmunoassay (RIA) for C- telopeptid (IIICTP), og N-terminale telopeptid (IIINTP) indirekte enzym-immunoassays (EIA) for N-terminale telopeptid ved å følge fremgangsmåtene beskrevet i Nurmenniemi
et al
. ([49] for RIA og [50] for EIA). På dag 14 ble de myom diskene fiksert i 4% paraformaldehyd og forberedt for analyse immunhistokjemi. Seks um histologiske snitt av myom skiver ble farget med monoklonalt pancytokeratin antistoff (DAKO, klone AE1 /AE3 ved en 1:150 fortynning) og sett under et mikroskop ved 100 x forstørrelse. Ni representative bilder ble tatt fra hvert av de tre gjentakelser av hver behandling. Bilder ble analysert som beskrevet i Nurmenniemi
et al. Product: (2009) [49]. Forskjeller i invasjonen området og dybden ble evaluert ved hjelp av en t-test og Mann-Whitney test og p-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Celleproliferering analysen
for å bestemme effekten av «1,5 M kort «aptamer på HSC-3 celleproliferasjon, vi brukte CellTiter 96 Aqueous celleproliferasjonsanalyse (Promega), en MTS-analyse. Omtrent 1 x 10
4 celler ble sådd ut i triplikat i en 96-brønns plate med 1 uM av den korte aptamer. Etter 24, 48 og 72 timer ble 20 ml CellTiter 96 Aqueous One Solution reagens tilsatt til hver brønn og cellene ble inkubert i 1 time ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Absorbansen registreres ved 490 nm på en plateleser FLUOstar Optima ble anvendt som en representasjon av det relative antallet levende celler i kultur.
Serum stabilitet assay
aptamerer «1,5 M kort», « 1,5 m lang «og» 3,0 M «ble inkubert ved en konsentrasjon på 5 uM med humane og museserum i 30, 60, 120, 180, 240 og 300 minutter ved 37 ° C. Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av 100 mM EDTA og produktene kjørte på en 12% polyakrylamidgel innfødt, sammen med et 25 bp DNA-markør stige. Geler ble farget med etidiumbromid og sett under UV-lys.
Serum albuminbinding
Bovine Serum Albumin (BSA) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Ltd (Gillingham, Storbritannia, produktkode A7030 10 g ). UV-eksperimenter ble utført på en Bio-Tek Uvikon XL med et Peltier Thermosystem for temperaturkontroll og omrøring anlegget, koblet til PC-bruk Lab Strøm Junior programvare for datainnsamling og analyse. Fluorimeter som ble benyttet var en Horiba Jobin Yvon Fluoromax-P er utstyrt med en fotonteller og Peltier system for temperaturregulering og omrøring i anlegget, koblet til en PC utnytte Datamax programvare for spektralanalyse. Innledende målinger ble tatt for å bekrefte tilstedeværelse eller fravær av fluorescensemisjonen fra begge aptamerer for eksitasjonsbølgelengde på 290 nm (selektiv for tryptofanrester) og emisjonsbølgelengder mellom 300 og 400 nm. Begge aptamerer ble titrert i vann og 10 mM fosfatbufferløsninger pH 7,4, ved 37 ° C. Den 1,5 M kort aptamer-konsentrasjonen varierte 0,3 til 8,0 uM, og den 1,5 m lange aptamer varierte 0,5 til 8,0 uM, og viser den indre fluorescens av disse aptamerer. Begge aptamerer present fluorescens emisjonsspekter i dette området. Tidligere forsøk viste at aptamer konsentrasjoner i området fra 0,1 ug /ml til 8 ug /ml forstyrrer ikke i evalueringen av albumin quenching [51]. Slukkings Målingene ble foretatt i 1 ml av 6 uM albuminer i fosfatbuffer pH 7,4. Emisjonsspektra ble registrert 300-400 nm bølgelengde, etter en reaksjonstid på 90 sekunder fra hverandre aptamer tilsetning. Både utslipp og eksitasjon båndbredde ble satt til 3 nm. Aptamer ble tilsatt fra en konsentrert stamløsning, slik at volumet tilveksten var ubetydelig. Forsøkene ble utført ved 37 ° C, pH 7,4.
For å evaluere eksisterende primære og /eller sekundære indre filtereffekter (IFEs), ble rettelse prosedyrer basert på absorbansmålinger løsninger utført ved eksitasjon og emisjonsbølgelengder av albumin . Denne virkning består i absorpsjon av spennende og /eller stråling som sendes ut av oppløste arter, inkludert fluoroforen i seg selv [52]. Absorbans måling av aptamerer /albumin løsninger på eksitasjon og emisjonsbølgelengder av albumin viste at indre filter effekt forårsaket av absorpsjon av stråling som sendes ut var ubetydelig.
Resultater
De anti-heparanase aptamerer hemme kreft celle invasjon
invasjonen av HSC-3-celler ble undersøkt med et menneskelig myom organotypiske modell [49] utsette carcinoma celler til ulike aptamerer (irrelevant, 1,5 M kort, 1,5 m lang, 3 M, rosa og gul) eller heparanase-antistoff (Ab Hpa) (fig. 1A). Virkningene av disse forbindelser sammenlignet med kontroll (uten inhibitor) på invasjon område (beregnet på grunnlag av den um-området av invasive celler) og dybden av invasjon (avstanden fra den nedre overflate av den ikke-invasive cellelaget til det dypeste invaderte celle) var analysert (fig. 1B og C). Aptamer 1,5 M Kort redusert betraktelig den totale invasjon området (p = 0,0001) i likhet med Hpa Ab, som ble anvendt som en positiv kontroll invasjon inhibitor [27]. Tvert imot, er ingen av de andre forbindelsene hadde en effekt på HSC-3-invasjon (figur 1). Invasjonsdybde betydelig redusert bare etter Hpa Ab behandling (p = 0,0001) (figur 1C). Basert på våre tidligere funn, nedbrytning av type III kollagen av HSC-3 celler måles med RIA topper fra dager 7-11 [49]. Tilsvarende media analysert ved hjelp av RIA fra dag 4 viste ikke forskjeller mellom noen av behandlingene (ikke vist). Mediene endring ved avslutning av forsøket på dag 14 viste kun statistisk signifikans fra behandling uten celler tilsatt (p = 0,001; ikke vist). Nedbrytning av type III kollagen uten inhibitorer var høyest ved dag 7 (ikke vist) og 10 (figur 2A-D). På dag 10, ved behandling med heparanase antistoffer inhiberte signifikant nedbrytning sammenlignet med ikke-relaterte kontroll (p = 0,07 i RIA, og p = 0,03 i EIA). På dag 10 var det en signifikant inhibering av 1,5 M Kort (p = 0,004 i RIA, og p = 0,007 i EIA) og 1,5 M Long (p = 0,02 i RIA, og p = 0,03 i EIA) sammenlignet med HSC-3 kontroll . Imidlertid, 3 M, Rosa, og Gul aptamerer, samt BAFB viste ingen signifikant reduksjon i mengden av kollagennedbrytningsprodukter, noe som indikerer at de ikke var vellykkede inhibitorer av invasjon
A:. Parafininnstøpte 14- dag myom organotypiske snitt ble farget for pancytokeratin markør AE1 /AE3 å analysere HSC-3 invasjon etter forskjellige behandlinger: ingen inhibitor, Hpa Ab, (det polyklonale heparanase-antistoff som en positiv kontroll), urelaterte aptamer, (utvalgt mot et mål som er involvert i Alzheimers sykdom), anti-heparanase aptamerer 1,5 M Short, 1,5 m lang og 3 M; linker peptid aptamerer rosa og gul. Scale bar er 100 mikrometer. Forskjellene i invasjon område (B) og invasjonsdybde (C) etter forskjellige behandlinger (n = 27 /behandling). Statistikken ble gjort som to-utvalg
t
-test og Mann-Whitney test
A:. EIA (IIINTP indirekte enzymimmunoanalyser) detektering N-terminal telopeptid fra kollagen type III nedbrytningsprodukter i dag 10 media endring. Økende absorbans betyr mindre kollagen nedbrytningsprodukt stede. Hpa Ab (p = 0,03), 1,5 M Kort (p = 0,007) og 1,5 M Long (p = 0,03) viste signifikant økning i absorbans sammenlignet med ingen inhibitor, noe som antyder at de har hemmet invasjon av HSC-3-celler. B: Grafen viser tidligere EIA verdier justert for negativ kontroll på dag 10 media endring. C: RIA (radioimmunoassay for type III kollagen) detektering av C-terminale telopeptid ved dag 10 endring av medium. Økende nivåer bety mindre kollagen nedbrytningsprodukt. Hpa Ab (p = 0,07), 1,5 M Kort (p = 0,004) og 1,5 M Long (p = 0,02). D: RIA har bekreftet EIA-analyser som viser betydelig lavere kollagen nedbrytningsprodukter enn at for vev uten inhibitor tilsatt, noe som indikerer at de var vellykkede hemmere av invasjonen
Den korte anti-heparanase aptamer viser ingen effekt. cytotoksisitet
cytotoksisiteten av de valgte aptamerer for HSC-3-celler ble studert, for å verifisere at inhibering av invasjon observert i organotypiske modellen var et resultat av inhibering av heparanase, som tidligere har bekreftet [46] og ikke celle cytotoksisitet. MTS Analysen ble utført i løpet av 72 timer, med en enkelt tilsetning av aptamer i begynnelsen av forsøket, og målinger i løpet av perioden intervaller på 24, 48 og 72 timer. Ingen endring i cellenes levedyktighet og cellevekst ble observert mellom cellene hvor aptamer tilsatt og kontroll (se figur 3). Bare de aptamerer som viste inhibering av invasjon ble testet for cytotoksisitet, for å undersøke om den hemmende effekt som observeres skyldes cytotoksisitet eller inhibering av heparanase. Aptamerer som ikke inhiberer celle invasjon åpenbart har ingen effekt på cellene, og derfor var det ingen grunn til å bli ytterligere undersøkt for cytotoksisitet.
Nærværet av aptamer ved 1 mM konsentrasjon ble funnet å ha noen effekt på den cellevekst i sammenligning med kontrollen.
den korte anti-heparanase aptamer binder ikke i vesentlig grad til serumproteiner
korte og lange aptamerer 1,5 M ble først titrert trinnvis over i vann og fosfat bufferoppløsning, pH 7,4 ved 37 ° C for å undersøke deres indre fluorescens. Begge aptamerer har indre fluorescens med topper ved 380 nm, noe som øker i fluorescensintensitet etter en tilsvarende økning av den aptamer-konsentrasjonen; den korte viser mindre fluorescens enn den lange aptamer (figur 4A og B). Vann ble benyttet som et fortynningsmiddel for å vise at den aptamer og ikke fosfatbufferoppløsning var årsaken til fluorescens, selv om den fluorescens for den korte aptamer øket ved å bruke fosfatbufferoppløsning som fortynningsmidlet. Dette var imidlertid sannsynligvis på grunn av en forskjell i pH-verdi som i fluorescens-spektroskopi pH-endringer har en betydelig innflytelse på resultatet.
Fluorescens økes ved å øke konsentrasjonen av aptamer i både fosfat og vann, som viser at selv om det er fluorescens høyere i fosfat, er aptamer faktisk årsaken og pH forskjellen i vann og PBS er den mest sannsynlige årsaken til økningen av fluorescens av aptamer i PBS.
den korte aptamer var i stand til å slukke fluorescensen av HSA ved 37 ° C med 1,5% (± 0,03%) og 9% (± 1,2%) ved 1:100 og 1:10 molforhold henholdsvis med slukking av 10% oppnådd ved en molar konsentrasjon 9,1 ganger lavere enn HSA (figur 5). Lang aptamer er i stand til å slukke fluorescensen av HSA med 10% ved en konsentrasjon 18,2 ganger lavere enn HSA, og med 2,4% (± 0,1%) og 16% (± 0,6%) ved 1:100 og 1:10 molforhold. Resultatene viser at begge aptamerer er i stand til å slukke fluorescensen av HSA, selv om den lange aptamer var mer effektiv. HSA leskende indikerer at aptamerer nå sub domene IIA, hvor den eneste tryptofan er plassert. Dette tryptofanrest er plassert på stedet 214 i underdomene IIA, innenfor hvilken det er en stor hydrofob hulrom med flere argininrester nær overflaten [53], som har blitt vist i forskjellige studier for å tjene som forankringspunkter for aptamerer [54].
Eksitasjon bølgelengde 290 nm, [HSA] = 6 mikrometer. Eksitasjonsbølgelengde på 290 mM i en oppløsning av natriumfosfat. Data er gjennomsnittet av seks verdier viser ikke større standardavvik enn 11%. Slukkeeffekten er mer vesentlig for lang enn kort aptamer.
For å få mer informasjon om hvilken type interaksjon oppstår mellom aptamerer og HSA, ble UV spektrometri titreringer utført ved titrering økende konsentrasjoner av kort og lange aptamerer og 6 pM HSA fortynnet i fosfatbuffer pH 7,4, som vist i figur 5. Tilsetningen av begge aptamerer for å fosfatbuffer og HSA øket den totale absorbansen, som viser at aptamer var ansvarlig for denne økning i stedet for HSA. Økningen var mer uttalt for den lange aptamer over korte aptamer, og begge produsert en forskyvning av den maksimale absorbans til venstre ved tilsetning av økende konsentrasjoner av aptamer.
skift observert fra den korte aptamer (figur 6A ) beveget 6 nm til venstre, noe som tyder på at bare en liten konformasjonsendring i proteinet ble forekommende [55], og derfor er mest sannsynlig på grunn av dynamisk bråkjøling HSA bråkjøling av denne aptamer. Imidlertid, i tilfelle av lange aptamer (figur 6B), ikke bare var der en betydelig forskyvning i den maksimale absorpsjon fra 20 nm til venstre, men en fullstendig forandring i formen på toppen ble observert, som omfatter toppen ved 260 nm aptamer, noe som tyder på at en kompleks ble dannet, og at bråkjøling var på grunn av den statiske bråkjøling fenomenet med lange aptamerer [55]. Således UV titreringene antydet at den korte aptamer ikke danner et kompleks med HSA og at interaksjonen skyldes dynamisk bråkjøling, mens den lange aptamer ble foreslått for å danne en grunntilstand kompleks med HSA, i motsetning til andre aptamerer tidligere er undersøkt, som også viser spesifisitet og kompleks formasjon bare med deres mål protein [56]. Dette arbeidet har blitt utvidet og interaksjoner av aptamerer med serumproteiner og den spesifikke plasseringen av deres interaksjon er beregnet og publisert separat, så det var ikke innenfor rammen av denne artikkelen [57].
aptamerer er stabile i humant serum
å vurdere aptamerer egnethet som terapeutiske midler, var det nødvendig å ha en forståelse av hvor stabile de umodifiserte aptamerer ville være i kroppen, som i blodet alene, er det mange nukleaser kan nedbryte aptamerer. Således, for å kontrollere stabiliteten av aptamerer i humant serum, har vi karakterisert eventuelle nedbrytningsprodukter av gelelektroforese. Sammenligning av bånd på geler i 1,5 M kort aptamer inkubert i forskjellige tidspunkter med humane og museserum, med det av aptamer bare viste at 1,5 M kort aptamer var ikke utsatt for nuklease-nedbrytning fra humant serum som båndene ikke viste noen utglidning eller avta i størrelse eller i intensitet sammenlignet med bare aptamer, og følgelig ble det ikke observert noen nedbrytning av den aptamer i mindre fragmenter (data ikke vist). Med mus serum, men det var en nedgang i primær bandet intensiteten på fem timers inkubasjonstid, noe som tyder på at nukleaser har degradert den aptamer innen den tid.
Diskusjoner
I denne studien har vi utforsket potensialet i tidligere valgte aptamerer mot heparanase som lovende diagnostiske og terapeutiske midler mot kreft i munnhulen. De aptamerer ble tidligere vist å ha høy affinitet mot heparanase og var funksjonelt i en Matrigel assay. På disse innledende studier ble det funnet at jo lenger aptamerer hadde en høyere affinitet for heparanase, og de hadde gode resultater i fluoriserende mikroskopi og Matrigel invasjons analyser. Men når vi undersøkte disse aptamerer på organotypiske invasjon analysen og analysert for deres evne til å blokkere invasjon, ble det funnet at den korte aptamer var langt bedre i stand til å gjøre det, sammenlignet med sin lange motstykker. Dette ble også bekreftet ved analyse ved hjelp av RIA og EIA av nedbrytningsproduktene av myoma vev, nemlig type III kollagen C- og N-terminale telopeptid respektivt. Den 1,5 M Kort og 1,5 m lange aptamerer bestå av den samme variable region og faktisk den korte ene er en forkortet versjon av den lange. Imidlertid ser det ut til at selv om det lenge man har en noe høyere affinitet, sannsynligvis på grunn av økt interaksjoner mellom proteinet og grunnings delene av aptamer, dette resulterte i reduksjon av evnen som disse aptamerer for å hemme invasjon vev. Tilstedeværelsen av forskjellige proteiner i selve vevet, sammenlignet med Matrigel eksperimentet tidligere utført, kan være årsaken til dette, som den lange aptamer kan danne andre interaksjoner med slike proteiner, eller primer-haler kan ha en sterisk hindring effekt på vev, som ikke er synlig i den enklere Matrigel modell. Dette, faktisk, ble bekreftet ved studier av interaksjonen mellom de to aptamerer og serumproteiner. I disse studiene ble det funnet at en lang aptamer dannet et kompleks med humant serum albumin, mens de korte aptamer ikke danne et kompleks og viste bare et begrenset dynamisk bråkjøling. I en annen studie [57], har vi modellert interaksjoner av korte og lange aptamerer med HSA og har identifisert at faktisk den lange aptamer danner et kompleks med serumalbuminer i en enkelt bindingssete, i nærheten av Trp 214 av HSA eller 212 av BSA, ved domenet IIA av disse proteiner, i en positivt ladet hulrom foret med lysin og arginin-rester [57]. Det er blitt vist at de kortere aptamer arten mangler evnen til å danne komplekser med serumproteiner og utstillinger dermed høyere spesifisitet for målet, som rettferdiggjør vårt valget mellom å bruke den i en hvilken som helst ytterligere terapeutisk eller diagnostisk utvikling, og er i overensstemmelse med de myoma dataene presentert i dette arbeidet. En ytterligere viktig trekk ved denne studien er demonstrasjonen som post-SELEX modifikasjoner kan være mer gunstig for aptamer utvalg enn innledende mot valgmåten, der dette er mulig. I en rekke studier med ulike metoder for diagnostisering, har aptamer affinitet for deres mål blitt sammenlignet med for albumin.
