Abstract
Bakgrunn
Tykktarmskreft (CRC) er en av de vanligste diagnosen kreft. Sirkulasjons microRNAs (mirnas) har blitt foreslått som potensielt lovende markører for tidlig deteksjon av CRC. Vi forsøkte å identifisere og evaluere et panel av miRNAs som kan være egnet for CRC tidlig deteksjon.
Metoder
mirnas ble profilert av TaqMan mikroRNA Array og skjermet for dette uttrykket i 5 bassenger av plasmaprøver av CRC pasienter (N = 50) og 5 bassenger av neoplasma frie kontroller (N = 50). Andre mirnas ble valgt ut fra en litteraturgjennomgang. Identifiserte kandidater ble vurdert i uavhengige valideringsprøvene i forhold til diskriminering av CRC pasienter (N = 80) eller avanserte adenom pasienter (N = 50) og neoplasma frie kontroller (N = 194). Diagnose ytelse av panelet av miRNAs ble vurdert ved multippel logistisk regresjon, ved hjelp av bootstrap analyse for å korrigere for overoptimisme.
Resultater
Fem mirnas identifisert til å være forskjellig uttrykt fra TaqMan mikroRNA Array (MIR -29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p), og syv mirnas rapportert å være forskjellig uttrykt i litteraturen (MIR-18a, ^ 20, -21, -92a, -143, -145 , -181b) ble valgt for validering. Ni av de tolv mirnas (MIR-18a, ^ 20, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145) ble funnet å være forskjellig uttrykt i CRC pasienter og kontroller i valideringsprøvene. Optimismen korrigerte arealet under kurven var 0,745 (95% konfidensintervall: 0,708 til 0,846). Ingen av de valgte mirnas viste signifikant differensialuttrykk ved bruk av avanserte adenom pasienter og neoplasma-frie kontroller.
Konklusjon
identifisert panel av mirnas kunne være av potensiell anvendelse i utviklingen av en multi-markør blodbasert test for tidlig påvisning av CRC. Virkning: Studien understreker den høye potensialet i plasma mirnas for forbedring av dagens tilbud av ikke-invasiv CRC screening
Citation. Luo X, Stock C, Burwinkel B, Brenner H (2013) Identifisering og evaluering av plasma microRNAs for tidlig deteksjon av tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (5): e62880. doi: 10,1371 /journal.pone.0062880
Redaktør: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia
mottatt: 22 desember 2012; Godkjent: 26 mars 2013; Publisert: 14. mai 2013
Copyright: © 2013 Luo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Med over 1,2 millioner nye tilfeller og 608,700 dødsfall per år, tykktarmskreft (CRC) er den tredje vanligste diagnosen kreft hos menn og den andre hos kvinner, og den fjerde vanligste årsaken til død av kreft på verdensbasis [1]. På grunn av sin vanligvis meget langsom utvikling over mange år, perspektiver for tidlig diagnose er mye bedre enn for mange andre former for kreft. Det har blitt anslått at over 95% av tilfellene av CRC ville ha nytte av kurativ kirurgi hvis diagnosen ble gjort på et tidlig eller premaligne polypp scenen [2], [3]. En rekke tidlig deteksjon prosedyrer har blitt utviklet og er i økende grad brukt, inkludert endoskopiske undersøkelser, stool- og blodbaserte tester. Blodbaserte tester ville synes å være spesielt attraktivt som de er minimal invasiv og kan få høye nivåer av tilslutning når den brukes som primær screeningtester i populasjonsbasert screening. Et stort antall blod markører er blitt foreslått og undersøkt, inkludert proteiner, cytologisk, mRNA og DNA-markører [4], [5], men diagnostiske resultater har for det meste vært utilstrekkelig for anvendelse som en primær verktøy i populasjonsbasert screening. Videre fleste studier støttet seg på små bekvemmelighet prøver fra kliniske omgivelser, og heller lovende resultater fra små studier har ofte ikke blitt replikert i påfølgende større skala valideringer.
microRNAs (miRNA) er 18~22 nukleotid ikke-kodende RNA at post-transcriptionally regulere genekspresjon og kontrollere ulike cellulære mekanismer [6]. Det er økende bevis for at mirnas er mye dysregulerte i kreft og kan ha potensial søknad om kreft diagnose, prognose og behandling [7]. Videre har siste utviklingen av miRNA mikromatriser gjort store profilerings studier hos kreftpasienter mulige.
Stabiliteten av cellefritt mirnas i kroppsvæsker muliggjør sirkulerende mirnas å være potensielle biomarkører for ikke-invasiv diagnostisering av kreft og andre sykdommer [8 ]. Flere nyere studier funnet noen sirkulerende mirnas som MIR-29a, MIR-92a og MIR-221, for å bli forskjellig uttrykt i CRC pasienter og derfor å være av potensiell bruk som ikke-invasive biomarkører for CRC screening [9] – [11 ].
Formålet med denne studien var å identifisere og evaluere et panel av plasma mirnas som kan tjene som biomarkører for tidlig deteksjon av CRC.
Materialer og metoder
studie~~POS=TRUNC og studiepopulasjonen
Saker med sporadisk CRC ble rekruttert før behandlingsstart ved University Clinic i Heidelberg i sammenheng med Dachs + studien, som er en satellitt studie for å Dachs, en pågående case-control studie gjennomført i Rhein-Neckar-regionen i Tyskland [12], [13].
Pasienter med avansert kolorektal adenom og kontroller gratis kolorektale svulster ble tilfeldig valgt fra deltakerne i screening koloskopi rekruttert i BLITZ studien, en pågående studien utviklet for å evaluere nye lovende markører for tidlig påvisning av CRC og tidligere beskrevet i detalj et annet sted [14] – [16]. Kort fortalt pasienter ble rekruttert, og blodprøver ble tatt ved gastroenterologer kontorer på et forberedende besøk, vanligvis omtrent en uke før screening koloskopi.
Både Dachs + og BLITZ studien ble godkjent av etikkomiteer i medisinsk fakultet ved Universitetet i Heidelberg og de medisinske styrene i Baden-Württemberg og Rheinland-Pfalz. . Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver deltaker
Undersøkelsen involverte to hovedfaser, en markør identifikasjon fase og en markør validering fase:
I markør identifikasjonsfasen, lovende mirnas ble undersøkt av TaqMan mikroRNA Array i sammenslåtte plasmaprøver fra 50 CRC pasienter og 50 neoplasma frie kontroller, ved hjelp av fem bassenger av plasmaprøver fra ti CRC pasienter hver, og fem bassenger av plasmaprøver fra ti neoplasma frie kontroller hver. I tillegg sju mirnas beskrevet til å være forskjellig uttrykt i CRC saker og kontroller i tidligere publikasjoner ble identifisert fra en systematisk litteraturgjennomgang (MIR-18a, ^ 20, -21, -92a, -143, -145, -181b) [17 ].
i markør valideringsfasen, var uttrykk for de identifiserte mirnas evaluert i uavhengige prøver av (i) 80 CRC tilfeller og 144 kontroller gratis kolorektale svulster og (ii) 50 pasienter med avansert adenomer og 50 kontroller fri for kolorektal svulster.
laboratorieprosedyrer
(i) for prøveopparbeidelse og RNA ekstraksjon.
blod~~POS=TRUNC prøvene~~POS=HEADCOMP ble samlet i EDTA-rør. Blodprøver fra kreftpasienter ble tatt før kirurgi eller annen behandling og blodprøver fra deltakerne som gjennomgikk screening koloskopi ble tatt før koloskopi. Blodprøvene ble sentrifugert ved 2123g i 10 minutter ved 4 ° C og supernatanten ble overført til nye rør. Plasmaprøvene ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. Total RNA inneholdende små RNA ble ekstrahert fra 200 ul (prøvene anvendt i identifisering fase) eller 115 pl (prøvene brukt i valideringen fase) plasma ved anvendelse av en kombinasjon av Trizol LS-reagens (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) og miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) samt 5 fmol /ul cel-MIR-39 som ekstern forberedelse kontroll som beskrevet før [18]. Prøvene ble eluert i et sluttvolum på 30 pl.
(ii) mikroRNA profilering fra plasmaprøver.
Profilering ble utført ved bruk av TaqMan mikroRNA Array (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) som muliggjør kvantifisering av 667 mennesker microRNAs. (tabell S1) Megaplex revers transkripsjon reaksjon og pre-forsterkning reaksjons ble utført av G-Storm GS2 termosykler (G-Storm, UK). Real-time kvantitativ polymerase chain reaction (QRT-PCR) ble utført ved hjelp 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Syklusen terskel (Ct) er definert som det antall sykluser som er nødvendig for det fluorescente signalet til å krysse terskelen i QRT-PCR. Raw Ct-verdier ble beregnet ved hjelp av SDS-programvare versjon 2.2 søknad automatiske baseline innstillinger og en terskel på 0,1 ble satt. Bare mirnas hvis Ct-verdien var lik eller under 33 i det minste enten saken eller kontrollgruppen ble tatt hensyn til ytterligere dataanalyse. Data normalisering ble gjort som beskrevet av Kroh et al. [19].
(iii) Real time kvantitativ PCR verifikasjon.
Valgte mirnas ble målt ved bruk av TaqMan mikroRNA Analyser (Applied Biosystems) i henhold til produsentens protokoll. Triplikater av QRT-PCR av hver prøve ble utført ved anvendelse av LightCycler 480 real-time PCR-system (Roche Applied Science, Tyskland). ΔCt ble beregnet ved å trekke Ct-verdier på interne kontroller fra Ct verdier av mirnas av interesse, og mener ΔCt-verdier ble sammenlignet mellom saker og kontroller. Multiplex analysene ble utført ved hjelp av forhåndsdefinerte bassenger av RT-primere (Tabell S2). Effektiviteten av hver miRNA s-analysen ble bestemt ved å konstruere en standardkurve ved anvendelse av en serie av total RNA fortynninger. Alle analyser viste god linearitet (R
2 0,96) mellom Ct verdier og loggen over start mengden av total RNA fra hver fortynning (data ikke vist)
Statistiske analyser
miRNA uttrykket nivåer ble sammenlignet mellom CRC pasienter og neoplasma frie kontroller og mellom avanserte adenom pasienter og neoplasma frie kontroller ved hjelp av Wilcoxon-Mann-Whitney-test (heretter: Wilcoxon test). Sammenligningen av miRNA ekspresjonsnivåer mellom CRC-pasienter og neoplasma-frie kontroller i den markør identifikasjonsfasen ble utført ved å bruke den nøyaktige versjon av Wilcoxon test. Alle testene var to-sidige og P-verdier på 0,05 eller mindre ble ansett for å være statistisk signifikant.
Multippel logistisk regresjon ble benyttet for å vurdere felles bruk av de identifiserte panel av miRNAs forutsi CRC i markør valideringsfasen . Mottaker som opererer karakteristiske (ROC) kurver ble konstruert og arealene under ROC-kurvene (AUC) ble beregnet både fra ujusterte (tilsynelatende) og justert ( «optimistisk korrigert») estimerer til å vurdere diskriminering av prediksjon modell mellom pasienter med og uten CRC. The.632 + bootstrap-metoden (med 1000 replikat) ble anvendt for å justere for overtilpassing av den tilsynelatende feilklassifisering feilen og over-estimering av AUC av den ujusterte anslagene [20], [21]. 95% konfidensintervall (KI) for de justerte og ujusterte estimatene ble oppnådd ved ordinære bootstrap analyser (med 1000 replikerer).
Korrelasjonen av plasma miRNA uttrykk nivåer på tvers av de 324 deltakerne i valideringsfasen ble vurdert ved Spearman korrelasjonskoeffisienter.
SAS versjon 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA) ble brukt til å utføre Wilcoxon tester og R-versjon 2.15.0 (R Foundation for Statistiske Computing, Wien, Østerrike) ble brukt å gjennomføre alle andre analyser. R-pakker «Daim» og «boot» ble ansatt for å utføre bootstrap analyser [22], [23].
Resultater
Studiepopulasjon
Totalt 424 personer ble inkludert (130 CRC pasienter, 50 avanserte adenom pasienter og 244 neoplasma frie kontroller) i studien. Demografiske karakteristikker av studiepopulasjonen og distribusjon av tumorstadier er oppsummert for markøren identifikasjon fase og markør valideringsfasen i tabell 1.
Identifikasjon av forskjellig uttrykt miRNAs i CRC Pasienter og Svulst-frie kontroller
i microarray analyser, fem mirnas ble funnet å være statistisk signifikant over uttrykt i plasma hos CRC pasienter sammenlignet med neoplasma frie kontroller (MIR-29a: p = 0,016, MIR-106B: p = 0,008, MIR -133a: p = 0,032, MIR-342-3p: p = 0,008, MIR-532-3p: p = 0,016, nøyaktig Wilcoxon test)
Evaluering av interne kontroller for real Time Kvantitativ PCR
.
i vår microarray data vi observerte ingen signifikant forskjell i forhold til de Ct-verdier på MIR-188-5p (p = 0,83, Wilcoxon test) og Mir-16 (p = 0,40, Wilcoxon test) mellom CRC og svulst-fri kontroller. RNU6B og MIR-16 har vært de mest brukte endogene kontroll miRNA for QRT-PCR i miRNA studier [8]. Derfor ble de navngitte tre mirnas anses som interne kontroller for miRNA kvantifisering. Men uttrykket nivåer av RNU6B og MIR-188-5p i plasma var for lav til kvantifiseres ved TaqMan mikroRNA-analysen (gjennomsnitts Ct-verdiene var større enn 35). Derfor ble MIR-16 valgt som intern kontroll som det viste høy overflod og mindre variasjon i uttrykket. Ingen signifikant forskjell ble observert i form av Ct-verdier av MIR-16 (p = 0,40, Wilcoxon test) mellom CRC og neoplasma frie prøver.
Validering i en uavhengig Eksempel på CRC Pasienter og Svulst-frie kontroller
For å bekrefte de fem mirnas (MIR-29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p) identifisert i microarray analyse og sju mirnas (MIR-18a, ^ 20, -21 , -92a, -143, -145, -181b) som tidligere var rapportert å være forskjellig uttrykt i CRC (unntatt MIR-92a, de var alle fra studier basert på vevsprøver) [17], QRT-PCR ble utført for å analysere uttrykk for de valgte miRNAs i vår valideringssett (224 plasmaprøver totalt fra 80 CRC pasienter og 144 neoplasma frie kontroller).
(i) uttrykk for miRNAs.
Ni mirnas ( MIR-18a, ^ 20, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145) viste høyere uttrykk i plasma av CRC pasienter enn hos neoplasma frie kontroller (MIR-18a: p 0,0001, MIR-20a: p = 0,001, MIR-21: p 0,0001, MIR-29a: p = 0,001, MIR-92a: p = 0,004, MIR-106b: p = 0,028, MIR-133a: p = 0,0002, MIR-143 0,0001, MIR-145: p = 0,0004, Wilcoxon test). Ingen miRNA ble funnet å være nedregulert. De tilsvarende uttrykk nivåer i plasma av CRC pasienter og neoplasma frie kontroller (normalisert i Mir-16) er vist i Figur 1.
Skap tomter med minste observasjon, lavere kvartil, median, øvre kvartil og største observasjon er vist. De Linjene utvides til de observasjonene som er ikke mer enn 1,5 ganger lengden av boksen (interkvartilt område) vekk fra boksen. Mer ekstreme observasjoner anses uteliggere. P-verdiene er basert på Wilcoxon-tester.
(ii) Forholdet mellom mirnas og clinicopathological funksjoner i CRC-pasienter.
Vi undersøkte sammenhengen mellom miRNA uttrykk nivåer og noen clinicopathological funksjoner. MiR-181b uttrykk nivået var høyere hos pasienter med lymfeknutemetastaser enn hos pasienter uten lymfeknutemetastase (p = 0,024, Wilcoxon test). Ingen av miRNAs viste noen sammenheng med svulst nettstedet eller svulst scenen. Likeledes ble ingen assosiasjoner sett med alderen, verken i tilfeller heller ikke i neoplasma frie kontroller (data ikke vist).
For å vurdere om uttrykket nivåer av de undersøkte mirnas er assosiert med utvikling av CRC ble pasientene stratifisert etter AJCC etapper. Generelt ekspresjonsnivåer var svært like i tidlig og sent stadium kreft. MiR-18a, 20a, 21, 29a, 133a, 143 og 145 ble funnet å være over-uttrykt i plasma hos pasienter CRC ved tidlige stadier sammenlignet med neoplasma-frie kontroller. MiR-18a, ^ 20, -21, -92a, -133a, -143, -145 og -181b viste høyere uttrykk nivåer i plasma av CRC pasienter ved sene stadier sammenlignet med neoplasma frie kontroller. MiR-181b viste høyere uttrykk i plasma fra sent stadium CRC pasienter enn tidlig stadium CRC pasienter (tabell 2).
(iii) multivariabel analyse.
Med panel av 12 mirnas (MIR-18a, ^ 20, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145, -181b, -342-3p, -532-3p), ROC analyser ga en ujustert AUC av 0,803 (95% KI: 0,774 til 0,888) og en justert, dvs. optimisme korrigert, AUC av 0,745 (95% KI: 0,708 til 0,846). De ROC-kurver er vist i figur 2. For hver miRNA blir ROC-kurver er vist i figur S1.
Justering for over-optimistisk ble gjort av the.632 + bootstrap-metoden. Forkortelser:. AUC, arealet under mottaker drift karakteristikk
Uttrykk av miRNAs i Avanserte adenom Pasienter og Svulst-frie kontroller
Avanserte kolorektale adenomer representerer en forløper stadium av CRC. For å vurdere potensiell bruk for tidlig deteksjon selv av avanserte adenomer ble identifisert 12 mirnas bestemmes av QRT-PCR i plasmaprøver fra 100 deltagerne (50 med avansert adenom og 50 neoplasma frie kontroller). Det ble ikke observert noen statistisk signifikante forskjeller i miRNA uttrykk nivåer i plasma av avanserte adenom pasienter og neoplasma frie kontroller.
Korrelasjoner av uttrykk nivåer av plasma mirnas
Blant deltakerne på valideringsfasen, sterk ble observert sammenhenger mellom uttrykk nivåer av MIR-18a og MIR-20a (r = 0,800, p 0,001), som begge er kodet i MIR-17-92 klynge; MIR-143 og MIR-145 (r = 0,762, p 0,001) som begge er kodet i MIR-143/145 klynge; og MIR-29a og MIR-106b (r = 0,694, p 0,001), to nært bosatt mirnas på kromosom 7q. Uttrykket nivåer av noen andre mirnas som ikke plasseres sammen i genomet ble også sterkt korrelert. På den annen side ble MIR-92a som også er kodet i MIR-17-92 klynge ikke er høyt korrelert med MIR-18a eller MIR-20a (r = 0,340 og 0,251 henholdsvis) (tabell S3).
diskusjon
i denne studien har vi sammenlignet uttrykket nivåer av tolv mirnas i plasmaprøver av CRC pasienter og neoplasma frie kontroller. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten på sirkulerende miRNA for CRC deteksjon ved hjelp TaqMan mikroRNA Array for miRNA profilering. Fem mirnas (MIR-29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p) ble identifisert fra microarray analyser og sju ble valgt ut fra litteraturen (MIR-18a, ^ 20, -21, -92a, -143, -145, -181b) for videre undersøkelser [17]. I vår valideringsstudie, ble uttrykket nivåer av MIR-18a, ^ 20, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143 og -145 funnet å være signifikant høyere hos CRC pasienter enn i neoplasm- gratis kontroller. ROC analyse av de identifiserte mirnas justert for over-optimisme av bootstrap ga en AUC på 0,745 (95% KI: 0,708 til 0,846). Dette resultatet sammenlignet med resultatene fra andre blodbaserte tester for CRC deteksjon [5].
Diagnostiske kjennetegn ved sirkulerende mirnas for CRC ble evaluert tidligere i to nye studier. Ng et al. rapporterte 0,89 sensitivitet og 0,70 spesifisitet på et bestemt cut-off point of Mir-92a, og en AUC på 0,885 (95% KI: 0,83 til 0,94) basert på 90 CRC pasienter (TNM stadium I /II /III /IV: 6 /34/23/27) og 50 kontroller [10]. Huang et al. rapporterte 0,830 sensitivitet og 0,847 spesifisitet, og en AUC på 0,883 (95% KI: 0,830 til 0,937) oppnådd i en multivariat analyse, inkludert MIR-29a og MIR-92a basert på 100 CRC pasienter (TNM stadium I /II /III /IV : 27/25/38/10) og 59 kontroller [9]. Dermed begge studiene fant høyere AUC estimater enn oppnådd i denne studien. Disse studiene hadde ikke justert for over-optimisme. Mens 95% konfidensintervall (0,774 til 0,888) av den ujusterte AUC i vår studie omfattet AUCene rapportert av Ng et al. og Huang et al., justering for over-optimisme svekket AUC med ca 6 prosent enheter. Likevel, selv vår ujusterte AUC anslaget var noe lavere enn de foregå rapportert seg, til tross for større antall inkluderte miRNAs. Faktorer som kan delvis står for disse forskjellene består scenen fordeling av CRC og sjansen. Prosentandelen av tidlig stadium CRC pasienter (AJCC stadium I og II) var høyere i vårt studium (59%) enn i de tidligere rapporterte studier (44% og 52%, respektivt), og sannsynligvis nærmere til scenen fordeling forventet i en screening innstilling [5]. Imidlertid ble det ikke observert noen stor forskjell på uttrykket nivåer av scenen i vår studie.
Kolorektal adenomer representerer en forløper stadium av adenocarinoma. En tidligere studie hadde rapportert at differensial uttrykk for plasma MIR-29a og MIR-92a kan også diskriminere avanserte adenom pasienter fra neoplasma frie kontroller selv om diskriminering var mindre markert enn for CRC pasienter [9]. I vår studie, ble ingen av de undersøkte mirnas funnet signifikant forskjellig uttrykt i de avanserte adenom pasientene i forhold til de neoplasma frie kontroller. Disse resultatene tyder på at de undersøkte mirnas ikke kan være nyttig for diagnose av avanserte adenomer. Imidlertid kan mangel på signifikante forskjeller også være på grunn av begrenset makt for å oppdage moderate forskjeller med utvalgsstørrelsen av vår substudien sammenligne bærere av avanserte adenomer og neoplasma frie emner Gitt den observerte mangelen på differensial uttrykk for individuelle miRNAs, en multivariat modell for prediksjon av avanserte adenomer ble ikke brukt.
Selv om differensial uttrykk for plasma MIR-18a, ^ 20, -21, -106b, -133a, -143, -145 og -181b i CRC pasienter ble undersøkt i noen vevsprøve baserte studier [24] – [27], dette er, så vidt vi vet, den første studien rapporterer på uttrykk for disse miRNAs i plasmaprøver av et stort antall pasienter med CRC og neoplasma frie kontroller. Statistisk signifikante forskjeller i uttrykket av alle analyserte mirnas unntatt MIR-181b, MIR-342-3p og MIR-532-3p ble observert. Intriguingly, våre data viste at uttrykket nivåer av MIR-133a -143, -145 og ble betydelig overuttrykt i plasma av CRC-pasienter sammenlignet med de neoplasma-frie kontroller, som synes å motsi data sammenhengende viser mindre ekspresjon av disse tre mirnas i kreft i vevsprøve baserte studier [28] – [34]. Videre studier med større antall pasienter og samtidige målinger av miRNA uttrykket i plasma og vev kan være nødvendig for å avklare dette spørsmålet.
Et vanlig problem i forskning om sirkulerende mirnas er at det ikke er etablert enighet internkontroll. Vi evaluerte MIR-16, MIR-188-5p og RNU6B, og på grunn av den konsistente, stabile og høy ekspresjon i alle plasmaprøver ble MIR-16 valgt som internkontroll i de plasmaprøve baserte tester, men flere empiriske validations som fremdeles er nødvendig for et konsensus om robuste og nøyaktige interne kontroller.
ni mirnas funnet å være overuttrykt i plasma av CRC pasientene i denne studien er også blitt undersøkt med hensyn til de andre sykdommer i tidligere forskning [9] , [10], [33], [35] – [48]. (Tabell 3) For eksempel, plasma MIR-21 ble funnet å være overuttrykt i mange forskjellige maligniteter, inkludert leverkreft, prostatakreft, og magekreft [35], [36], [42], [46] – [49]. Disse fellestrekk i MIR-21 uttrykk mønster i forskjellige kreftformer suggestes at Mir-21 kan fungere som et onkogen. Funksjonelle undersøkelser viste at Mir-21 mål tumorsuppressorgener som fosfatase og tensin homolog (PTEN) og omvendt regulerer uttrykk [50]. PTEN er rangert som det nest mest muterte tumor suppressor gen etter p53. Det kan inaktiveres ved mutasjon med tap av heterozygositet, promoter metylering, miRNA forstyrrelser og en del andre mekanismer i en rekke kreftformer, inkludert hjerne, prostata, livmorkreft [51]. Differential uttrykk for noen miRNAs i flere krefttyper støtte forslag som de bør vanligvis kombineres med flere mirnas når det brukes til påvisning av spesifikke kreftformer.
Det er noen begrensninger som må tas i betraktning når man tolker resultatene av denne undersøkelse. For det første er størrelsen på utvalget fortsatt liten, spesielt i markør fasen. For det andre, mye mirnas «hopetall i plasma er for lav til å være nøyaktig kvantifisert ved QRT-PCR, derfor noen potensielle relevante markører kan ikke bli vurdert. For det tredje er det fortsatt ikke bestemt i hvilken grad endret uttrykk nivåer av miRNAs funnet blant CRC pasienter i denne studien er CRC bestemt.
Konklusjoner
Plasma mirnas synes å være potensielt nyttige biomarkører for tidlig deteksjon og diagnostisering av CRC. Mens forskning på plasma basert miRNA profilering er fortsatt på et veldig tidlig stadium i forhold til forskning på vev basert miRNA profilering, kan det ha potensial til å bidra til utvikling av nye metoder for non-invasiv, blod basert CRC screening. Likevel, den diagnostiske utførelsen av de identifiserte panel av miRNAs kanskje ikke likevel være tilstrekkelig til å konkurrere med ytelsen til enkelte andre ikke-invasive tester, spesielt immun avføringen blodprøver [52]. Videre forskning på en multi-markør blodbasert test, kan potensielt inkludert panel av miRNAs identifisert i denne studien være en lovende metode for å øke repertoaret for non-invasiv kreft screening.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1 .
Mottaker opererer karakteristiske kurver ved hjelp av 12 utvalgte microRNAs (MIR-18a, ^ 20, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145, -181b, -342-3p og speil 532-3p) for diskriminering av 80 pasienter med kolorektal kreft og 144 neoplasma frie kontroller. Forkortelser: FPR, falsk positiv rate. TPR, sann positiv rate. . AUC, arealet under mottaker drift karakteristikk
doi: 10,1371 /journal.pone.0062880.s001 plakater (DOC)
Tabell S1.
667 menneskelige microRNAs testet ved hjelp av TaqMan mikroRNA Array
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062880.s002 plakater (DOC)
Tabell S2.
RT-primer bassenger som brukes for multiplex Real-Time kvantitativ PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062880.s003 plakater (DOC)
tabell S3.
Spearman korrelasjonskoeffisienter av microRNAs uttrykk nivåer blant 324 deltakere fra valideringen (p 0,001 hvis ikke kommentert)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062880.s004 plakater (DOC)
