Abstract
Økt metabolisme er et krav for svulst celleproliferasjon. For å forstå avhengighet av tumorceller på fettsyremetabolisme, evaluerte vi forskjellige noder av fettsyrer pathway. Ved å bruke RNAi vi har vist at uttømming av fettsyresyntese pathway enzymene SCD1, FASN, eller ACC1 i HCT116 tykktarmskreftceller resulterer i cytotoksisitet som er reversibel ved tilsetning av eksogene fettsyrer. Dette betinget fenotype er mest uttalt når SCD1 er oppbrukt. Vi brukte denne fettsyre redning strategi for å karakterisere flere små-molekyl hemmere av fettsyrer, inkludert identifisering av TOFA som en potent SCD1 inhibitor, som representerer en tidligere ubeskrevet aktivitet for denne forbindelsen. Referanse FASN og ACC-hemmere viser cytotoksisitet som er mindre uttalt enn for TOFA og fettsyrerednings profiler i samsvar med sine foreslåtte enzymsystemer. To referanse SCD1 hemmere viser lav nanomolar cytotoksisitet som er motvirket av minst to størrelsesordener av eksogene oleat. En av disse inhibitorer forsinker veksten av HCT116 xenograft tumorer. Våre data skissere en effektiv strategi for avhør av on-mekanisme potens og sti-node-spesifisitet av fettsyresyntesehemmere, etablere en entydig sammenheng mellom fettsyresyntese og kreft celle overlevelse, og peker mot SCD1 som et viktig mål i denne veien.
Citation: Mason P, Liang B, Li L, Fremgen T, Murphy E, Quinn A, et al. (2012) SCD1 Hemming forårsaker kreft celledød ved reduserende Mono-umettede fettsyrer. PLoS ONE 7 (3): e33823. doi: 10,1371 /journal.pone.0033823
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 13 oktober 2011; Godkjent: 17 februar 2012; Publisert: 22 mars 2012
Copyright: © 2012 Mason et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. forfatterne er ansatte i Genzyme Corporation. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
fettsyreinnholdet i cellene i kroppen er avledet fra kostholdet og fra
de novo
syntese. Hurtig prolifererende kreftcellene har ofte en robust program av fettsyresyntese ledsaget av ekspresjon på høyt nivå av gener assosiert slik som fettsyre syntase [1]. På grunn av sin relative overflod i kreftceller, har fettsyre syntase blitt ivaretatt som en onkologi mål [2]. Det er imidlertid uklart om fettsyre syntase representerer hastighetsbegrensende komponent i fettsyresyntesen veien.
Long-fettsyrer er avgjørende for den raske membranen syntese krav i kraftig voksende celler og spill viktige roller i ulike signal ordninger [3]. I tillegg er en egnet balanse av kjedelengder og graden av metning kritisk for opprettholdelse av membranfluiditet og kurvatur [4]. Det har blitt rapportert at inhibering av ulike trinn i fettsyresyntese pathway forårsaker hemming av kreft cellevekst, enten på grunn av mangel på nedstrøms fettsyrer
per se
, eller på grunn av oppbygging av toksiske spredningsveier mellomprodukter så som malonyl-CoA, eller begge deler [5].
Ved hjelp av en kombinasjon av siRNA og små molekyl hemmere, kombinert med en «fettsyre complementation» strategi, har vi identifisert stearoyl-CoA desaturase en som et enzym i fett syre syntese vei som er viktig for kreftcelle levedyktighet. Den «komplementering» strategi tillot karakterisering av både SCD1, så vel som spesifisiteten av forskjellige fettsyresyntesehemmere, og klargjør den mekanismen som SCD1 hemming begrenser cancer celleproliferasjon. Våre data skissere en entydig sammenheng mellom fettsyresyntese og kreft celle overlevelse.
Resultater
Kreftceller er følsomme for tap av SCD1 funksjon
For å undersøke effekten av avbrudd av fettsyresyntese på kreftcellelevedyktigheten, vi brukte siRNA bassenger å utarme tre noder i reaksjonsveien for syntese av langkjedede fettsyrer (figur 1A). Som vist i figur 1B, uttømming av acetyl-CoA-karboksylase (ACC1), fettsyre syntase (FASN), eller stearoyl-CoA-desaturase (SCD1) resulterer i redusert levedyktighet (eller cellulær metabolisme) (som målt ved hjelp av cellulære ATP-nivåer ved hjelp Celle- titer Glo) i HCT116 tykktarmskreftceller, med 30%, 30% og 70%, respektivt, sammenlignet med en ikke-målsøkende siRNA kontroll, som ble betegnet som 100% levedyktighet i hvert tilfelle ble mRNA knockdown bestemt ved sanntids-RT -PCR å være ca 80% (ikke vist). Vi antok at dersom denne cytotoksisiteten er virkelig gen-bundet og på målet, og hvis avbrytelse av fettsyresyntese reaksjonsveien resulterer i redusert cellelevedyktighet på grunn av en mangel på nedstrøms fettsyrer i motsetning til oppbygging av toksiske spredningsveier mellomprodukter, så cytotoksisiteten forårsaket ved uttømming av forskjellige spredningsveier noder må være rescuable, eller forebygges, ved tilsetning av eksogene fettsyrer nedstrøms for den noden. Som vist i figur 1B, ACC1 uttømming og FASN uttømming er rescuable av palmitat, stearat og oleat, som alle er nedstrøms for både ACC1 og FASN. SCD1 uttømming er ikke rescuable ved -palmitat eller -stearat (som er oppstrøms for SCD1), men SCD1 uttømming er betydelig reddet av oleat (som er nedstrøms for SCD1). Redusert celleviabilitet forårsaket av utarming av to essensielle gener av urelaterte mekanisme, er PSMD14 og RNA polymerase II (Pol II) ikke reddet av en hvilken som helst av de fettsyre behandlinger. Dette tyder på at redusert cellelevedyktighet forårsaket av behandling med disse sirnas er helt tilskrives uttømming av målgenet, og at det er forårsaket av en mangel på syntese av fettsyrer, i motsetning til en opphoping av giftige spredningsveier mellomprodukter i den normale dyrkingsbetingelser .
En
de novo
syntese av mono-umettede fettsyrer. B HCT116 tykktarmskreftceller (ATCC) dyrkes i RPMI-1640 (Cambrex) inneholdende 2% FBS sådd ut ved en tetthet på 4000 celler per brønn i 100 ul media i 96-brønners plater ble transfektert med siRNA bassenger (Dharmacon, 50 nM) som målretter tre fettsyrer-synteseveien noder, eller to ubeslektede overlevelses gener, ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 16 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 25 uM fettsyrer (Sigma, 100 x aksjer oppløst i 10% MeOH /0,9% BSA /PBS) som angitt, og levedyktigheten ble bestemt 72 timer etter transfeksjon (Cell Titer Glo, Promega). Resultatene er uttrykt som prosent levedyktigheten i forhold til celler transfektert med et ikke-målsøkende kontroll siRNA (betegnet 100% levedyktighet) ble behandlet med den samme fettsyre. C DU145 prostata kreft celler, HCT116 tykktarmskreftceller, og MIA PaCa2 bukspyttkjertelkreftceller (ATCC) dyrket i RPMI-1640 som inneholder 2% FBS ble behandlet med enkle sirnas målretting SCD1 eller PSMD14 (Dharmacon, 25 nM), etterfulgt 16 timer senere av behandling med oleat som angitt. Levedyktigheten ble bestemt 72 timer etter transfeksjon. Resultatene er uttrykt som prosent levedyktigheten i forhold til celler transfektert med et ikke-målsøkende kontroll siRNA (betegnet 100% levedyktighet) ble behandlet med den samme fettsyre. D HCT116 tykktarmskreftceller sådd ut ved en tetthet på 1000 celler per brønn i 25 ul media i 384-brønns plater ble behandlet med små-molekyl-inhibitorer for ACC1 (CP640186, Pfizer), FASN (# 10v, Merck), eller SCD1 (# 7n, Abbott), i medium inneholdende fettsyrer som er angitt, 72 timer før bestemmelse levedyktighet. Inibitors ble syntetisert på Genzyme (Waltham, MA).
For å undersøke omfanget av SCD1 engasjement i kreftcelleoverlevelse, ble flere kreftcellelinjer utsatt for SCD1 eller PSMD14 RNAi behandling, i begge tilfeller ved hjelp av en enkelt siRNA. Levedyktigheten til DU145 prostatakreftceller, tykktarmskreftceller HCT116 og MIA PaCa2 bukspyttkjertelcancerceller er redusert (i forhold til en ikke-målsøkende kontroll siRNA) ved fjerning av begge gener som vist i figur 1C. I alle tilfeller, er SCD1-uttømming-mediert cytotoksisitet rescuable ved supplering av mediet med oleat, mens i alle tilfeller PSMD14 uttømming er ikke. Dette tyder på at en rekke kreftceller er avhengig av
syntese av mono-umettede fettsyrer
for celle-levedyktighet, og at SCD1 er en kritisk node i den bane som kan være et egnet terapeutisk mål.
den fettsyrer veien har blitt studert i sammenheng med både metabolsk sykdom [6] og kreft [7]. Derfor er en rekke fettsyresyntesehemmere er tilgjengelige. Vi dro ut for å bruke fettsyre redning strategi med flere slike forbindelser, som et middel til både å teste hypotesen om at syntesen av fettsyrer, og SCD1 aktivitet i særdeleshet, er nødvendig for kreftcelle levedyktighet, og også med mål om bedre forståelse on- og off-mekanisme aktiviteter i fettsyresyntesen hemmere seg. Som vist i figur 1D, referanse inhibitorer for ACC1 (Pfizer # CP640186 [8]), FASN (Merck # 10v [9]), og SCD1 (Abbott # 7n [10]) alle skjerm cytotoksisitet og rednings profiler i overensstemmelse med den veien stilling av målet. Toksisitet på grunn av ACC1 og FASN hemming blir reddet av palmitat, talkum, og oleat, mens toksisitet på grunn av SCD1 hemming blir reddet bare av oleat. Det er også verdt å merke seg at styrken av disse inhibitorene reflekterer den observasjon med siRNA. Til tross for det faktum at referanse inhibitorer er av tilsvarende potens i biokjemiske analyser på sine respektive mål, ACC1 og FASN inhibering dannelse av en beskjeden reduksjon levedyktighet, mens fenotypen med SCD1 hemning er mer uttalt, noe som tyder på at SCD1 er en spesielt verdifull, kanskje sats- begrensende node i denne veien. Disse observasjoner tyder også på at referanse inhibitorer er fri fra dominerende (non-rescuable) off-mekanisme toksisitet i dette cellesystem. De mettede langkjedede fettsyrer som anvendes i redningsbanen selv produserer en beskjeden reduksjon levedyktighet ved de konsentrasjoner som benyttes. Det er bemerkelsesverdig at disse mettede fettsyrer er synergistisk med den SCD1 inhibitor (figur 1D). Dette tyder på at mens mesteparten av levedyktigheten innvirkning sett på SCD1 inhibering er på grunn av uttømming av mono-umettede fettsyrer, SCD1 hemming også reduserer cellenes evne til å dempe virkningene av unaturlige, eksogene mettede fettsyrer, antagelig ved «avgiftning» å oleat eller palmitoleat.
Inhibitor aktivitet avklaring av komplemente
Vi har testet tre kommersielle utbredte historiske hemmere av fettsyresyntese veien ved hjelp av «fettsyre redde» strategi. Cerulenin og C75 er FASN inhibitorer [11], [12], og TOFA er en ACC1 inhibitor [13]. Som vist i figur 2A, cerulenin og C75 begge hemme HCT116 tykktarmskreft cellelevedyktighet som forventet. Imidlertid er ingen av disse inhibitorer som reagerer på palmitat, stearat eller oleat, noe som tyder på at begge disse inhibitorer har dominant, ikke-mekanisme-baserte cytotoksisitet i dette cellesystemet, og at reduksjon i celleviabilitet drevet av disse forbindelsene er relatert til inhibering av fettsyresyntese.
A HCT116 tykktarmskreftceller ble behandlet med små-molekyl-inhibitorer FASN C75 og Cerulenin (Sigma), eller ACC-inhibitoren TOFA (Sigma), i media inneholdende fettsyrer som er anført, 72 timer før levedyktighet besluttsomhet. B-HCT116-celler ble behandlet med oleat ved forskjellige tidspunkter i forhold til tidspunktet for TOFA tilsetning. Cellelevedyktigheten ble bestemt 72 timer etter behandling TOFA. C HCT116-celler behandlet med forbindelsene i media som mangler eller inneholder oleat, etterfulgt av levedyktighet bestemmelse etter 72 timer. D HCT116 tykktarmskreftceller dyrket i en tetthet på 1 x 10
6 celler per 1 ml medium per brønn i 12-brønners plater ble forbehandlet med TOFA i en time, fulgt av 13C-Palmitat eller 13C-stearat eller 13C acetat (Sigma) behandling i fire timer. Merkede fettsyrer og estere ble ekstrahert, forsåpet, og analysert ved hjelp av LC /MS /MS ved anvendelse av enten en API 5000 eller API 4000 trippel kvadrupol massespektrometer (AB Sciex, Forster City, CA) bindestrek med et Agilent 1100 HPLC system (Agilent, Santa Claire, CA). LC-separasjonen ble utført ved å bruke Xbridge fenyl 2,1 x 100 mm kolonne (Waters, Milford, MA). Mobil fase A bestod av 5 mM ammoniumformiat i avionisert vann. Mobil fase B bestod av 5 mM ammonium-formiat i metanol. Prøven ladningsbuffer bestod av 30% buffer A og 70% buffer B. En lineær gradient ble anvendt for separeringen (70% til 100% B i 5 min). Prøvene ble ionisert av ESI i negativ ion modus og oppholdstiden for MRM var 75 ms.
I denne analysen, TOFA toksisitet blir reddet effektivt ved oleat, men ikke av palmitat eller stearate (Figur 2A), i motsetning til forventning om en spesifikk hemmer av ACC1. Dette mønsteret av fettsyre redning er i samsvar med TOFA hemming av SCD1. Alternativt kan TOFA-drevet cytotoksisitet være helt off-target (unrescuable ved palmitat eller stearat), og TOFA kunne i prinsippet fysisk kontakt med oleat i kulturmediet slik at oleat bare hindrer TOFA fra å komme inn i cellene. For å teste denne muligheten, la vi oleat på ulike tider i forhold til den tiden av TOFA tillegg og målte levedyktighet i alle tilfeller på 72 timer etter TOFA behandling. Som vist i figur 2B, oleat tillegg opp til 8 timer etter TOFA tillegg gir en grad av «redde» som ikke kan skilles fra det tilfelle hvor oleat tilsettes før TOFA tilsetning. I dette tilfellet har TOFA timer for å trenge gjennom cellen og inhiberer målet, før innføring av oleat. Dette er i strid med oleat forhindrer bare TOFA fra å komme inn i cellene. Når oleat ble tilsatt 24 timer etter TOFA tillegg er fenotypen reversering betydelig svekket. Derfor mellom 8 og 24 timer etter TOFA behandling, cellene gå forbi et «point of no return», og ikke svarer til oleat når analysert for levedyktighet på 72 timer.
I tillegg vurderte vi at oleat kan være en promiskuøse «cytotoksisitet-rescue-agent.» for å teste denne muligheten, testet vi en rekke cytotoksiske forbindelser i oleat-redning analysen. Som vist i figur 2C av en rekke inhibitorer for forskjellige mekanismer som ble testet (inkludert C75 og cerulenin), bare TOFA-drevet cytotoksisitet er rescuable ved oleat. Dette er i strid med oleat fungerer som en generell «rescue-agent.»
For å teste hypotesen om at TOFA «fettsyre redning profil» virkelig gjenspeiler TOFA hemming av SCD1, vi overvåket konvertering av stabil-isotop-merkede fettsyrer ved LC /MS /MS for fettsyre fluks i fravær eller nærvær av TOFA. Vi undersøkte SCD1-mediert desaturation av 13C-palmitat eller 13C-stearat til palmitoleat eller oleat, henholdsvis, og forlengelsen av 13C-palmitat til Stearate etter en 1 time TOFA eksponering. I tillegg til å måle ACC1 hemming, overvåket vi 13C-acetat innlemmelse i palmitate. Som vist i figur 2D, inhiberer TOFA både SCD1-mediert avmetning hendelser på en potens sammenlignes med sin celle-levedyktighet EC50, og kan sammenlignes med dets potens på ACC1. Omvendt er vesentlig høyere nivåer av TOFA nødvendig for å bevirke den (ikke-SCD1-drevet) forlengelse av palmitate til stearat. Derfor, basert på fettsyreprofil redning og den direkte måling av SCD1 hemning i levende celler, hemmer TOFA SCD1, som er en tidligere ubeskrevet aktivitet for TOFA.
I tilfellet med både TOFA og SCD1 inhibitor # 7n (Tall 1D og 2A), forsterker eksogene palmitate virkningen av SCD1 hemming. Utover det faktum at i denne analysen innstillingen palmitate viser noen iboende celleviabilitet hemming, Palmitate også venstre-skift EC50 for TOFA og # 7n, noe som tyder på at kombinasjonen av unaturlig forhøyet palmitat, og manglende evne til å behandle den i oleat, forbedrer levedyktighet hemming av kreftceller.
Kreft celle levedyktighet hemming spor med inhibitor potens og SCD1 representerer den eneste essensielle desaturation ruten
for å teste troskap og korrelasjon av våre fettsyre-redning levedyktighet studier og mobil SCD1-hemming LC /MS /MS-analyse, undersøkte vi tre SCD1 inhibitor molekyler: TOFA, Abbott # 7N, og Abbott # 28c [14]. Som vist i figur 3A, er # 7n flere ganger mer potent enn TOFA, og mer oleat-rescuable, i den celle-levedyktighet analysen, og likeledes er mer potent enn TOFA i direkte cellulære SCD1 inhiberingsanalysen. Tilsvarende er # 28c vesentlig mer potente enn # 7 N i den direkte cellulære SCD1 inhiberingsanalysen, og også i celleviabilitet analysen, mens fullstendig beholder oleat-rescuability.
A HCT116 celler ble behandlet og analysert for cellenes levedyktighet eller cellulær inhibering SCD1 (LC /MS /MS) som beskrevet ovenfor. B HCT116 ble behandlet med DMSO eller inhibitor SCD1 # 28C i nærvær av forskjellige fettsyrer (25 uM) (Biomol, # 2803) i 72 timer og analysert for cellenes levedyktighet. Data vises som et varmekart kontinuum fra grønne (levende celler) til rødt (døde celler). C HCT116-celler behandlet i 36 timer med forskjellige doser av SCD1 inhibitorer som angitt. Cellene ble lysert i LDS lasting fargestoff (Invitrogen) og analysert ved western blotting for PARP cleavage (Cell Signaling). Staurosporin, et bredspektret kinase inhibitor, ble inkludert som en positiv kontroll for PARP cleavage. D HCT116 celler ble behandlet som i C, i nærvær eller fravær av eksogent oleat, etterfulgt av analyse av PARP spalting.
Vi betraktet at andre umettethet arrangementer kan være tilgjengelig for å støtte kreftcellelevedyktighet, via desaturaser annet enn SCD1, hvis celler er gitt tilstrekkelig tilførsel av mettet substrat. For å utforske denne muligheten, samt for ytterligere å karakterisere spesifisiteten av # 28 c SCD1 inhibitor vi undersøkt av et panel av fettsyrer med varierende kjedelengder og metningstilstander for deres evne til å «utfylle» (forhindre virkningen av) SCD1-inhibitor- mediert levedyktighet reduksjon. Som vist i figur 3B, mens ikke alle umettede fettsyrer komplettert, har alle «sammenfallende» fettsyrer inneholder minst en umettet binding. På den annen side er alle mettede fettsyrer ikke klarte å utfylle, noe som tyder på at umettethet er absolutt nødvendig for komplementering, og at alternative desaturase aktivitet kan ikke anvendes.
Vi undersøkte TOFA, # 7n, og # 28c for induksjon av apoptose kaskade. HCT116 cellene ble behandlet med sammensatte doser tilsvarende, eller ti ganger over, deres cytotoxocity IC50. Som vist i figur 3C, er alle tre fettsyresyntesehemmere indusere PARP-spaltning i en doseavhengig måte, noe som tyder på at avbrytelse av fettsyresyntese i disse cellene fører til apoptose. Induksjonen av PARP-spaltning korrelerer med celledød ved at den er vendbar med eksogen oleat (figur 3D). PARP cleavage er en markør for apoptose [15].
SCD1 hemming bremser tumorvekst og er ikke universelt giftig
Virkningen av SCD1 utarming på flere kreftcellelinjer øker muligheten for at SCD1 hemming vil være universelt giftig. Vi testet eggstokkreft cellelinje SKOV3 for følsomhet for et referanse SCD1 inhibitor. Som vist i figur 4A, har SCD1 inhibitoren begrenset innvirkning på SKOV3 celleviabilitet, mot HCT116, til tross for at tilsvarende inhiberende effekt på cellulær omdannelse av stearat til oleat (SCD1 aktivitet). Vi vurderte at SKOV3 kan generelt være ufølsom overfor forskjellige giftstoffer. Som vist i figur 4B, SKOV3 og HCT116 er forholdsvis følsomme for en rekke av mekanistisk-distinkte toksiske forbindelser, slik som dimethylsphingosine og daunorubicin, mens i tilfellet med SCD1 inhibitorer, er SKOV3 ganske ufølsom i forhold til HCT116. Dette tyder på at SKOV3 har noen spesifikk ufølsomhet for fettsyresyntese-inhibering, og som SCD1 inhibering ikke vil være universelt toksiske.
A HCT116 eller SKOV3-celler ble behandlet og analysert for cellenes levedyktighet eller cellulær inhibering SCD1 (LC /MS /MS) som beskrevet ovenfor. B HCT116 eller SKOV3-celler ble behandlet og analysert for celle-levedyktighet. Tabell uttrykker forholdet av SKOV3 EC50 versus HCT116 EC50. C, D Nude mus husing passasje fem 200 mm3 HCT116 svulster (passeres som Trocar fragmenter) (n = 10 per gruppe) ble dosert ved oralt inntak to ganger daglig med 160 mg /kg # 28c i 20 dager eller med intravenøs CPT11 på tre dager starter når tumorer nådde 200 mm3. Tumorvekst (C) og kroppsvekt (D) ble overvåket og plottet som middelverdi +/- standardavvik.
SCD1 inhibitor # 28c ble nylig beskrevet av Abbott [14] som et potent, orally- tilgjengelig SCD1 inhibitor med gunstige farmakokinetiske egenskaper. Derfor dette molekylet gir et verktøy for
in vivo
SCD1 mål validering for kreft. Vi behandlet mus med 200 mm3 HCT116 svulster to ganger daglig med nummer 28c ved oralt inntak (versus IV CPT11 på en optimal dosering) i 20 dager og overvåkes tumorvekst og kroppsvekt. Som i figur 4C, # 28c viser moderat vekst-forsinkelse av HCT116 tumorer. Mens SCD1 inhibitoren gjorde redusere oleat innholdet av tumorer skåret ut (ikke vist), betydelig oleatet forble i tumorvev, øke muligheten for at kosten oleat kan være begrensende for effekten av SCD1 inhibitor. Behandling med SCD1 inhibitor ble ledsaget av vekttap nærmer seg 20%, eller reduksjon fra 20 g til ca 16 g, på dosering dag 10 (studiedag 26) (figur 4D) som ble gjenopprettet etter opphør av dosering (studiedag 36). Det er uklart om dette vekttapet er på mekanisme for dette hemmer (som kan forventes fra en hemmer av lipid syntese), eller som ikke er relatert til SCD1 hemming.
Diskusjoner
Kreftceller er tydelig hvorav fra ikke-ondartede celler basert delvis på deres unike metabolske status, er ett element en uvanlig behov for fettsyresyntese [16]. Således fettsyresynteseveien har vært et attraktivt mål kreft i noen tid, og det primære oppmerksomhet har vært fokusert på fettsyre syntase, som markerer punktet for produksjon av langkjedede fettsyrer [17]. Våre eksperimenter og andre [18] tyder imidlertid på at det hastighetsbestemmende trinn i syntese av mono-umettede fettsyrer er ved punktet for de-metning (ved SCD1), og at SCD1 representerer en særlig utsatt node i denne reaksjonsvei. Ved hjelp av både siRNA og referanse hemmere, har vi vist at tap av SCD1 aktivitet gir uttales levedyktighet hemming av ulike kreftceller
in vitro
. Det faktum at dette levedyktighet inhibering er reversibel når oleat blir tilsatt til cellekulturmediet hevder at fenotypen er på-mekanisme, og som skyldes en SCD1-inhibering-mediert oleat mangel, i motsetning til oppbygging av intracellulært palmitat eller andre oppstrøms pathway komponenter. Vi foreslår at dette fettsyre redning strategi er en enkel, bredt nyttig mekanisme for karakterisering av fettsyrer hemmer spesifisitet, noe som gjenspeiles av vår karakterisering av SCD1 hemmende aktivitet i TOFA.
HCT116 tumorvekst er forsinket på behandling med et kraftig, oralt tilgjengelig SCD1 referanse inhibitor. Imidlertid er tumorvekstforsinkelse moderat, faller betraktelig mindre enn det som ble sett med CPT11, som tjente som en positiv kontroll. Det er bemerkelsesverdig, men at en optimalisert doseringsregime ikke blitt påvist for de SCD1 inhibitor. Tumorvekstforsinkelse ble ledsaget av vekttap, og redusert kroppsvekt ble opprettholdt i løpet av dosering. SCD1 ble opprinnelig undersøkt som et mål for metabolske forstyrrelser, og det ville ikke være overraskende hvis noen del av den observerte vekttap skyldes bred hemming av
mono-umettet
fettsyrer. I tillegg, mens SCD1 knockout-mus er levedyktig [19], mus har flere SCD isoformer, som kan være overflødig. Hvis toksisitet (vekttap) sett i denne studien skyldes fettsyrer hemming, kan dette være knyttet til SCD1 inhibitor rettet mot flere murine SCD isoformer. Dette ble ikke testet. Likevel, i prinsippet dette ville differensiere inhibitor-drevet toksisitetsprofilen fra genetisk SCD1 knockout. Alternativt kunne vekttap sett være nettoeffekten av SCD1-hemming drevet redusert fedme og økt energiforbruk, kan sammenlignes med det man ser i SCD1 knockout [19], [20].
Mono-umettede fettsyrer syre modning og bearbeiding, etter produksjon av SCD1, er et komplekst nettverk som fører til en rekke forskjellige kjedelengder, metning stater, og subcellulære distribusjons skjebner. Det kan være at mens SCD1 representerer en endelig, hastighetsbegrensende «point-of-innsnevring» i reaksjonsveien, en nedstrøms enzym mål, langs en av en rekke mono-umettede fettsyreprosesserings sub-trasé, kan representere en node som er spesielt nødvendig for kreftcellelevedyktighet, og unnværlig for normal cellefunksjon. Det kan også være slik at SCD1 hemming kan være produktiv i en co-behandling scenario, ved lave doser i forbindelse med en tradisjonell agent.
Materialer og metoder
Cell Culture
HCT116 DU145, og MIA PaCa2 kreftceller ble oppnådd fra ATCC og opprettholdt i RPMI1640 (Cambrex) supplert med penn-strep (ATCC) og 5% FBS (Hyclone). For analyser, ble cellene sådd ut i RPMI1640 mangler penn-strep og inneholdende 2% FBS ved en tetthet på 4000 celler /100 ul /brønn i 96-brønners plater for siRNA behandling og levedyktighet bestemmelse, eller ved en tetthet på 1000 celler /25 ul /brønn i 384 brønns plater for behandling med forbindelsen og levedyktighet bestemmelse, eller en tetthet på 1 x 10
6 celler /1 ml /brønn i 12-brønners plater for behandling med forbindelsen og LC /MS /MS-analyse av merket fettsyrer fluks . Alle celler ble dyrket som et monolag i 95% luft /5% CO
2, og en enkelt rekke av ikke-delipidert FBS ble anvendt for alle forsøk
Fatty Acid Fremstilling
Fett syrer (Sigma) ble oppløst i metanol til en konsentrasjon på 25 mM. 25 mM aksjer ble deretter fortynnet ti ganger i PBS (Cambrex) som inneholder 0,9% BSA (A9576, Sigma). Disse 2,5 mm (100X) aksjer ble grundig blandet og inkubert i en 37 graders vannbad i en time før alikvoteringsprosessen og frysing ved -20 grader. Fettsyre panelet fra Biomol (# 2803) ble oppløst i DMSO.
LC /MS /MS-analyse
Alle forsøkene ble utført ved hjelp av en API-5000 eller API 4000 trippel kvadrupol massespektrometer ( AB /MDS Sciex, Concord, Canada) og en Agilent 1100 HPLC pumpe (Agilent, Andover, MA). Kolonner var Xbridge fenyl 2,1 x 100 mm (Waters, Milford, MA). Buffer A var vann med 5 mM ammoniumformiat; buffer B var metanol, 5 mM ammoniumformiat; og lasting buffer var 30% buffer A pluss 70% buffer B). En 5-min gradient (70% til 100% buffer B, lineær) ble anvendt med MRM-innhentingstiden på 75 msek ved hjelp av negativ modus. Fettsyrer bestemmelser ble uttrykt enten som produkt /(produkt + substrat) (i tilfelle av stearat, palmitoleat, oleat og syntese), eller som rå produkt normalisert til umerket linolsyre (i tilfelle av syntese palmitat).
siRNA transfeksjon
ON-Target-PLUS eller siGENOME lager sirnas (gen-spesifikk eller ikke-måls kontroller) ble kjøpt fra Dharmacon, og transfektert (50 nM (12,5 nM per hver av fire sirnas) i Ved siRNA bassenger (Smartpools), eller 25 nM i tilfellet med enkelt sirnas ved hjelp av Lipofectamine 2000. SCD1 enkelt siRNA sekvens var.: 5′-GAACAGUGCUGCCCACCUC-3 «den PSMD14 enkelt siRNA sekvens var: 5»-GGCAUUAAUUCAUGGACUA-3- «. Seksten timer etter transfeksjon, 1/100
th volum på 100 x BSA-kompleks fettsyre (palmitat, stearat eller oleat) (100X = 2,5 mM) eller bærer alene ble tilsatt. syttito timer etter transfeksjon 25 ul celle-titer Glo ble tilsatt, og platene ble analysert for cellelevedyktighet i henhold til produsentens (Promega) anbefaling. Alle analyser ble utført i duplikat eller tre eksemplarer, ved flere anledninger med liknende resultater, og fremstilles grafisk som gjennomsnitt ± SD av en enkelt representant eksperiment.
Små-molekyl hemmer behandling
C75, cerulenin , og TOFA ble kjøpt fra Sigma. ACC inhibitor CP640186 (Pfizer), FASN inhibitor # 10V (Merck), og SCD1 hemmere # 7n og # 28c (Abbott) ble syntetisert ved Genzyme (Waltham, MA). Forbindelser ble oppløst i DMSO og lagret ved -20 grader. I tilfellet med både BSA-kompleks fettsyre (eller bærer) og små-molekyl-inhibitorer (eller DMSO), midler ble for-fortynnet i analysekulturmedium til 7 x sluttkonsentrasjon. 5 ul stykket av 7 × bestander av to aktuelle agenter ble lagt inn i 25 ul medium, for 35 ul endelig volum. 72 til 96 timer senere ble 7,3 ul celle-titer Glo tilsatt, og platene ble analysert for celle-levedyktighet. Alle analyser ble utført i duplikat eller tre eksemplarer, ved flere anledninger med liknende resultater, og fremstilles grafisk som gjennomsnitt ± SEM av en enkelt representant eksperiment.
HCT116 Xenotransplantat
Dyrestudier (# GENZ100507- 20) ble utført etter godkjenning av Genzyme Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). HCT116 svulster ble passert som Trocar fragmenter i
nu /nu
mus. Dyr som bærer passasje fem svulster ble behandlet med nummer 28c (160 mg /kg to ganger daglig oral dosering i 20 dager) eller CPT11 (en gang daglig intravenøs dosering i tre påfølgende dager) når tumorer nådde 200 mm3.
