Abstract
Selv om CD133 har blitt rapportert å være en lovende tykktarmskreft stamcelle markør, de biologiske funksjonene CD133
+ tykktarm kreft celler forblir kontroversiell. I denne studien undersøkte vi de biologiske forskjellene mellom CD133
+ og CD133
– tykktarmskreftceller, med et særlig fokus på deres samspill med kreft-assosiert fibroblaster, spesielt CD10
+ fibroblaster. Vi brukte 19 primær tykktarm kreft vev, 30 primærkulturer av fibroblaster avledet fra tykktarm kreft vev og 6 tykktarm kreft cellelinjer. Vi isolert CD133
+ og CD133
– subpopulasjoner fra tykktarm kreft vev og dyrkede celler.
In vitro
analyser avslørte at de to populasjonene viste lignende biologiske atferd i deres spredning og kjemosensitivitet.
In vivo
analyser viste at CD133
+ celler viste signifikant større tumorvekst enn CD133
– celler (
P
= 0,007). Videre, i cocultures med primære fibroblaster avledet fra tykktarm kreft vev, CD133
+ celler viste betydelig mer invasive atferd enn CD133
– celler (
P
0,001), spesielt i cocultures med CD10
+ fibroblaster (
P
0,0001). Videre
in vivo
analyser viste at CD10
+ fibroblaster forbedret tumorvekst av CD133
+ celler betydelig mer enn CD10
– fibroblaster (
P
0,05) . Disse data viser at
in vitro
invasive egenskaper og
in vivo
tumorvekst av CD133
+ tykktarmskreftceller er forbedret i nærvær av spesifikke kreft-assosiert fibroblaster, CD10
+ fibroblaster, noe som tyder på at samspillet mellom disse spesifikke cellepopulasjoner har viktige roller i kreft progresjon. Derfor kan disse spesifikke interaksjoner være lovende mål for nye tykktarm kreft terapi
Citation. Cui L, Ohuchida K, Mizumoto K, Moriyama T, Onimaru M, Nakata K, et al. (2010) fremad Isolerte Kreft-Associated CD10
+ fibroblaster har sterkere Interaksjoner med CD133
+ Colon kreft celler enn med CD133
– kreftceller. PLoS ONE 5 (8): e12121. doi: 10,1371 /journal.pone.0012121
Redaktør: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 8 mars 2010; Godkjent: 15 juli 2010; Publisert: 12. august 2010
Copyright: © 2010 Cui et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet i del av en Grant-in-Aid fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan, og et stipend fra Takeda Science Foundation, den japanske Society of Gastroenterology, den Uehara Memorial Foundation, og Nakajima Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest største årsaken til kreft-dødsfall i den vestlige verden og dens forekomst øker i asiatiske land som følge av endringer mot et vestlig diett [1]. Nylig har konseptet av kreft stamceller (cscs) vært fokusert på i biologi av tykktarmskreft. Tykktarmskreft viser en markert grad av morfologisk og funksjonell heterogenitet i sine celler. Blant disse cellepopulasjoner, er cscs særlig blitt rapportert å ha tumorigen og behandlingsresistente aktiviteter [2]. Derfor kan isolering og karakterisering av kolon cscs hjelpe mot utvikling av nye diagnostiske og terapeutiske prosedyrer [3].
Menneske prominin-en (PROM1, CD133) er en 5-trans glykoprotein av 865 aminosyrer med en total molekylvekt på 120 kDa. Det ble opprinnelig beskrevet som et spesifikt overflate-antigen av humane hematopoietiske stamceller [4], [5] og en markør for murine neuroepithelial celler og flere andre embryoniske epitelceller [6]. Selv om de biologiske funksjoner av CD133 er fortsatt ukjent [7], blir CD133 alene eller i kombinasjon med andre markører i dag brukes for å isolere stamceller fra en rekke vev [4], [5], så vel som prostata [8], lever [9 ] og bukspyttkjertel [10], [11]. Nylig, CD133 ble rapportert å være en CSC markør i tykktarmskreft [3], [12]. IETA et al. [13] videre rapportert at CD133
+ celler avledet fra tykktarmskreft cellelinjer stille høyere karsinogent potensial enn CD133
– celler. Imidlertid Shmelkov et al. [14] viste at CD133 er allment uttrykt av humane primære tykktarmskreft epitelceller, og at både CD133
+ og CD133
– metastatisk tumor subpopulasjoner er i stand til langsiktig tumorigenesis
in vivo
. Derfor konsekvensene av CD133 som CSC markør fortsatt kontroversielle.
Det har vært antydet at samspillet mellom kreftceller og omkringliggende stromale fibroblaster har viktige roller i tumorinvasjon og metastase [15], [16]. Selv bulk svulster er kjent for å bestå av heterogene kreftceller med forskjellige spredning, invasjon og metastase aktiviteter, det er ingen rapporter som fokuserer på heterogenitet av kreft-assosiert fibroblaster. I de fleste tidligere studier [17], [18], [19], [20], har bare to eller tre primærkulturer av kreft-assosiert fibroblaster blitt anvendt for undersøkelser. Derfor, for en bedre forståelse av kreftcelle-stromale celleinteraksjoner, er det viktig å fokusere på heterogenitet av kreft-assosiert fibroblaster, i likhet med heterogeniteten av kreftceller, slik som cscs.
I den foreliggende undersøkelse undersøkte vi de biologiske konsekvensene av CD133
+ tykktarmskreftceller ved å analysere CD133 uttrykk i menneskelige primær tykktarm kreft vev og evaluere biologiske atferd av CD133
+ og CD133
– celler avledet fra tykktarmskreft cellelinjer
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi fant signifikante forskjeller i invasivitet mellom disse to populasjoner i cocultures med primære fibroblaster avledet fra tykktarm kreft vev, spesielt i cocultures med fibroblaster positive for CD10, en membran metalloendopeptidase. Tatt sammen tyder disse data på at CD133
+ tykktarmskreftceller er mer invasive i nærvær av spesifikke kreft-assosiert fibroblaster, spesielt CD10
+ fibroblaster, og at disse cellepopulasjoner kan være lovende mål for inhibering av metastase og tumor tilbakefall.
Resultater
CD133 uttrykk i kirurgisk resected primære tykktarm kreft vev
Hittil har inkonsistente data er rapportert om CD133
+ og CD133
– cellepopulasjoner i grunnskolen tykktarm kreft vev [3], [14]. Vi undersøkte prosentandeler av CD133
+ og CD133
– cellepopulasjoner i grunnskolen tykktarm kreft vev ved flowcytometri. Vi brukte 26 primær tykktarm kreft vev og 24 normale tykktarm epitelvev fra 26 pasienter. Vi analyserte CD133
+ populasjoner i disse kolon vev etter eksklusive CD45
+ og CD31
+ celler. Alle tykktarmskreft prøvene inneholdt både CD133
+ og CD133
– celler (Tabell 1; CD133
+ celler: 2-54%). Vi har også oppdaget CD133
+ celler på 0-5% i normale kolon vev. For å kunne vurdere de kliniske implikasjonene av CD133 uttrykk, undersøkte vi sammenhengen mellom CD133 uttrykk og clinicopathological funn, for eksempel svulst klasse, Dukes klassifisering, lymfeknutemetastaser, lymfatisk invasjon og venøs invasjon (tabell 2). Vi fant signifikante sammenhenger mellom CD133 uttrykk og Dukes klassifisering (
P
= 0,010) og mellom CD133 uttrykk og lymfeknutemetastase (
P
= 0,023).
Sammenligninger av ondartede atferd mellom sorterte CD133
+ og CD133
– tykktarm kreft celler
Ved hjelp av flowcytometri, undersøkte vi tilstedeværelsen av CD133
+ populasjoner i seks tykktarm kreft cellelinjer . Vi fant ut at alle cellelinjene besatt CD133
+ celler (6-91%; figur 1A). Spesielt har vi oppdaget at to distinkte populasjoner, en som består av bare CD133
+ celler, og den andre består av bare CD133
– celler, i DLD-1-celler, mens de andre cellelinjene som syntes å ha en populasjon bestående av både CD133
+ og CD133
– celler. Vi sortert DLD-1-celler på basis av CD133 ekspresjon og reanalyses viste effektiv seleksjon (CD133
+: 98%; CD133
-: 100%; figur 1B). Deretter undersøkte vi de tidsavhengige endringer i CD133 uttrykk på usorterte DLD-1 foreldre celler og sortert CD133
+ og CD133
– celler. Som vist i figur 1B, sortert CD133
+ celler viste betydelige tidsavhengige endringer i CD133
+ og CD133
– populasjoner under lang tid kultur, mens prosentandeler av CD133
+ og CD133
– populasjoner ikke endre i foreldrecellene og sortert CD133
– celler. Deretter å sammenligne biologiske atferd av sortert CD133
+ og CD133
– celler, brukte vi DLD-en og HCT116-celler og undersøkt deres celleproliferasjon, kolonidannelse evne og chemoresistance til 5-fluorouracil (5-FU) og doxorubicin (DOX). Vi fant ingen signifikante forskjeller i disse celle atferd mellom CD133
+ og CD133
– celler (Tall S1, S2, S3, S4)
(A) CD133
+ populasjoner i en. panel av menneskelig kolon kreft cellelinjer. Flowcytometri analyser ble utført for å undersøke CD133
+ populasjoner i seks tykktarmskreft cellelinjer. (B) Analyse av CD133
+ befolkningen i foreldre DLD-1 celler og reanalyses av sortert CD133
+ celler (98%) og CD133
– celler (100%) (øverste panelene). De tidsavhengige endringer i CD133
+ populasjoner i usortert foreldre og sortert CD133
+ og CD133
– DLD-1 celler er også vist (nedre panel). Den sorterte CD133
+ celler viser betydelige tidsavhengige endringer i CD133
+ og CD133
– populasjoner under lang tid kultur, mens prosentandeler av CD133
+ og CD133
– populasjoner endrer ikke på foreldrecellene og sortert CD133
– celler. (C) Tumorvekst ble evaluert på en måned etter injeksjon av 5 × 10
6 CD133
+ eller CD133
– DLD-1 celler inn i 6 SCID-mus, henholdsvis. Representative fotografier er vist i det øvre panelet (venstre: CD133
– cell-avledet tumor, høyre: CD133
+ celle-avledet tumor). Scale bar = 1 cm. Den CD133
+ celle-stammer svulster er betydelig større enn CD133
– celle-stammer svulster (
P
= 0,007; nedre panel). Data representerer gjennomsnitt ± SD
For å evaluere karsinogent potensial og
in vivo
tumorvekst av CD133
+ og CD133
-. DLD-1 celler, vi transplantert serienummer CD133
+ og CD133
– celler i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus. Selv om det var en trend mot tidligere påvisning av tumordannelse hos mus injisert med CD133
+ celler sammenlignet med mus injisert med CD133
– celler, idet forskjellene var ikke signifikant (Tabell 3). På 10 uker etter transplantasjon, injeksjon av mer enn 5 × 10
6 CD133
+ eller CD133
– celler generert synlige svulster i alle mus. Men når tumorstørrelsene ble sammenlignet, de CD133
+ celle-avledede tumorer var signifikant større enn den CD133
– celle-avledede tumorer. (
P
= 0,007; figur 1C)
Kreft-assosiert fibroblaster forbedre invasivitet av CD133
+ celler mer effektivt enn for CD133
– celler
for å belyse hvilke faktorer som forårsaker forskjellene i
in vivo
tumorvekst mellom CD133
+ og CD133
– celler, undersøkte vi effekten av cocultures med kreft-assosiert fibroblaster på invasivitet av disse cellene. Vi fant at det ikke var noen forskjell i invasivitet mellom CD133
+ og CD133
– celler når cellene ble dyrket alene (figur 2A). I kontrast, når cellene ble cocultured med kreft-assosiert fibroblaster, CD133
+ celler viste signifikant større invasivitet enn CD133
– celler og foreldre celler (
P
0,001 for begge; Figur 2A). Vi undersøkte effekten av 12 primære kulturer av fibroblaster på invasivitet av CD133
+ -celler, og funnet at effekten av cocultured celler på CD133
+ celle invasjon varierte fra 0,88-ganger til 1,76 ganger (tabell 4 ).
(A) Invaderende celler ble målt etter 48 timer med monokultur eller coculture med kreft-assosiert fibroblaster (f11). CD133
+ celler cocultured med kreft-assosiert fibroblaster viser betydelig større invasivitet enn CD133
– celler og foreldreceller (
P
0,001). Skala barer = 100 mikrometer. (B) Den prosentandeler av CD10
+ cellepopulasjon og aktivitetene til disse cellene for å indusere invasjonen av cocultured tykktarmskreftceller ble undersøkt i 12 primære kulturer av fibroblaster. Det er en signifikant positiv sammenheng mellom styrking av CD133
+ celle invasivitet og prosentandelen av CD10
+ cellepopulasjonen (
P
0,0001). (C) Flowcytometri analyser ble utført for å undersøke CD10
+ populasjoner i primær tykktarm kreft vev. Det er en signifikant sammenheng mellom prosentandeler av CD133
+ og CD10
+ populasjoner i tykktarm kreft vev (
P
= 0,015).
korrelasjoner mellom prosenter av celleoverflate markør-positive populasjoner i kreft-assosiert fibroblaster og deres forbedring av kreft invasjon
for å karakterisere de primære kulturer av kreft-assosiert fibroblaster, vi undersøkte uttrykk for stromal celle-forbundet overflate markører CD10, CD105, CD44 og CD54 på 32 primære kulturer av fibroblaster ved flowcytometri (tabell 4). Vi deretter undersøkt sammenhengene mellom forbedring av CD133
+ celle invasivitet og prosenter av positive populasjoner for disse overflatemarkører. Vi fant en signifikant korrelasjon mellom forbedring av CD133
+ celle invasivitet og prosentandelen av CD10
+ befolkningen (
P
0,0001, ρ = 0,928; figur 2B, tabell 5). Som vist i tabell 4, hvor stor andel av CD10
+ befolkningen i primærkulturer av kreft-assosiert fibroblaster etablert fra colontumorer varierte fra 0,39% til 73,33%. Vi har også funnet en betydelig invers korrelasjon mellom de prosentandeler av CD10
+ og CD105
+ populasjoner (
P
0,0001; tabell 5), så vel som en betydelig invers korrelasjon mellom ekstra av CD133
+ celle invasivitet og prosentandelen av CD105
+ befolkningen (
P
= 0,0268; tabell 5).
Deretter undersøkte vi CD10 uttrykk i kirurgisk resekterte primære vev og funnet ut at 0,4 til 25% av celler avledet fra tykktarmskreft vev var CD10
+ (tabell 1). Vi deretter undersøkt sammenhengene mellom andelen av CD10
+ befolkningen og clinicopathological funn. Vi har funnet trender mot positive korrelasjoner mellom prosentandelen av CD10
+ -populasjonen og Dukes klassifisering og mellom prosentandelen av CD10
+ -populasjonen og lymfeknutemetastase, selv om de ikke var statistisk signifikant (Tabell 2). Vi har også undersøkt sammenhengene mellom celleoverflatemarkører i de samme pasientene og fant en signifikant sammenheng mellom prosentandeler av CD133
+ og CD10
+ populasjoner (
P
= 0,015; ρ = 0,4063 ;. Figur 2C)
CD10
+ fibroblaster forbedre
in vitro
invasjon og
in vivo
svulst vekst av CD133
+ kreftceller
for å undersøke funksjonelle forskjeller mellom CD10
+ og CD10
– fibroblaster, vi sortert CD10
+ og CD10
– fibroblaster (figur 3A) fra primærkulturer av kreft-assosiert fibroblaster. Nivåene av
CD10
mRNA i disse to populasjonene var i samsvar med nivåene av CD10 celleoverflate-protein ekspresjon (figur 3A). Ved hjelp av disse to populasjoner av fibroblaster, undersøkte vi deres effekt på invasivitet av CD133
+ og CD133
– kreftceller. CD10
+ fibroblaster forbedret invasivitet av CD133
+ kreftceller betydelig mer enn CD10
– fibroblaster (
P
0,0001, HCT116 cellene, figur 3B; DLD-1 celler, figur 3C). CD10
+ fibroblaster også litt forbedret invasivitet av CD133
– kreftceller flere enn CD10
– fibroblaster, men betydelig mindre enn deres effekt på invasivitet av CD133
+ kreftceller (
P
0,001; figur 3C). For å evaluere effekten av CD10
+ og CD10
– fibroblaster på
in vivo
tumorvekst, cotransplanted vi CD133
+ eller CD133
– HCT116 kreftceller og CD10
+ eller CD10
– fibroblaster i SCID-mus. CD10
+ fibroblaster forbedret tumorvekst av CD133
+ kreftceller betydelig mer enn CD10
– fibroblaster (
P
0,05, figur 3D)
(. A) Analyse av primærkulturer av tykktarm kreft-assosiert fibroblaster (venstre panel) og reanalyses av sortert CD10
+ celler (midten øvre panel) og CD10
– celler (midten nedre panel).
CD10
mRNA nivåer i den sorterte CD10
+ og CD10
– fibroblaster ble målt ved QRT-PCR (høyre panel). (B, C) Den invasivitet av CD133
+ og CD133
– kreftceller cocultured med CD10
+ eller CD10
– fibroblaster ble evaluert. Representative fotografier er vist (B, HCT116 cellene, C, DLD-1 celler). Skala barer = 100 mikrometer. CD10
+ fibroblaster forbedre invasivitet av CD133
+ kreftceller betydelig mer enn CD10
– fibroblaster (
P
0,0001). (D) Virkningene av CD10
+ og CD10
– fibroblaster på
in vivo
tumorvekst ble evaluert etter 4 uker etter cotransplantation av CD133
+ eller CD133
– HCT116 kreft celler og CD10
+ eller CD10
– fibroblaster i SCID-mus (
n
= 6 for hver gruppe). Representative fotografier er vist (øvre panel). Scale bar = 1 cm. CD10
+ fibroblaster øke tumorvekst av CD133
+ HCT116 kreftceller betydelig mer enn CD10
– fibroblaster (
P
0,05, nedre panel). Data representerer gjennomsnitt ± SD.
Effekt av CD10 knockdown i CD10
+ fibroblaster om invasjonen av cocultured tykktarmskreftceller
For å undersøke om CD10 protein i fibroblaster funksjonelt bidrar til forbedring av invasjonen av cocultured kreftceller, fibroblaster transfektert med
CD10
for målretting for små interfererende RNA (siRNAs) (siRNA-1 og siRNA-2) eller en kontroll siRNA ble brukt til invasjonen analyser. Begge de
CD10
for målretting sirnas hemmet 90% av
CD10
mRNA uttrykk. Knockdown av CD10 uttrykk i CD10
+ fibroblaster bemerkelsesverdig redusert invasivitet av cocultured CD133
+ HCT116 kreftceller (
P
0,001; figur 4), men hadde en begrenset effekt på invasivitet av CD133 .
– kreftceller
knockdown av CD10 uttrykk i CD10
+ fibroblaster bemerkelsesverdig reduserer invasivitet av cocultured CD133
+ HCT116 kreftceller (
P
0,001) , men har en begrenset effekt på invasivitet av CD133
– kreftceller. Representative fotografier (øverste panelene) og grafer (nedre panel) er vist. Skala barer = 100 mikrometer
Differensial uttrykk profilering av CD10
+ og CD10
-. Fibroblaster
For å belyse viktige molekyler involvert i CD10
+ fibroblast-mediert forbedring av
in vitro
invasjon og
in vivo
tumorvekst av CD133
+ tykktarm kreft celler, utførte vi microarray-analyser ved hjelp av CD10
+ og CD10
– primær-kultivert fibroblaster avledet fra colontumorer. Sammenligninger av microarray data mellom CD10
+ og CD10
– primær-dyrkede fibroblaster identifisert 20 gener som ble oppregulert ved 2 ganger i CD10
+ fibroblaster (Tabell S1). For å validere disse microarray data, ble QRT-PCR utføres. Vi valgte
ALDH1A1
,
GPNMB
,
MMP3 Hotell og
IGFBP2
fra genene er oppført i tabell S1 fordi disse genene har blitt rapportert å være involvert i kreftcelle invasjon og colonic stamceller ble også rapportert å uttrykke ALDH1 [21], [22], [23], [24], [25]. De validerte data var i samsvar med microarray data (figur S5).
For å evaluere effekten av
CD10
knockdown på uttrykk for de fire invasjonsassosierte gener (
MMP3
,
ALDH1A1
,
GPNMB Kjøpe og
IGFBP2
) i CD10
+ fibroblaster, CD10
+ fibroblaster ble transfektert med
CD10
for målretting eller kontroll sirnas, og uttrykk for de fire invasjonsassosierte gener ble undersøkt. Det var ingen signifikante endringer i uttrykket av disse fire genene (figur S6).
Diskusjoner
I denne studien, våre
in vitro
eksperimenter viste at CD10
+ fibroblaster avledet fra tykktarm kreft vev betydelig forbedret invasjonen av CD133
+ kolon kreftceller sammenlignet med CD10
– fibroblaster. Vi har også funnet ut at knockdown av CD10 i CD10
+ fibroblaster delvis redusert invasivitet av cocultured CD133
+ tykktarmskreftceller. Videre vår
in vivo
analyser viste at cotransplantation av CD10
+ fibroblaster betydelig økt tumorvekst av CD133
+ kolon kreftceller sammenlignet med cotransplantation av CD10
– fibroblaster. Samlet utgjør disse data tyder på at en bestemt undergruppe av tykktarm kreft celler, CD133
+ celler, har viktige interaksjoner med en bestemt undergruppe av kreft-assosiert fibroblaster, CD10
+ fibroblaster. Dette er den første rapporten til å beskrive kreftcelle-stromal celle interaksjoner mellom prospektivt sortert bestemte undergrupper av tykktarm kreft celler og kreft-assosiert fibroblaster.
cscs har blitt isolert fra tykktarmskreft på grunnlag av deres uttrykk av cellen men da overflaten CD133 [3], [12], [26]. Selv om flere forskere har nylig publiserte rapporter om CD133
+ tykktarmskreftceller [3], [12], [26], var det inkonsekvente data vedrørende tumor-initiering evne CD133
+ tykktarmskreftceller. I denne studien fant vi karsinogent potensial i både CD133
+ og CD133
– tykktarm kreft celler, i samsvar med resultatene av Shmelkow et al. [14]. Videre fant vi ingen signifikante forskjeller mellom disse to cellepopulasjoner i sin
in vitro
celleproliferasjon, kolonidannelse og chemoresistance. Men den nåværende
in vivo
analyser viste at CD133
+ celler generert betydelig større svulster enn CD133
– celler. For å forstå konsekvensene av de inkonsekvente resultater mellom
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter, fokuserte vi på kreftcelle stromal celle-interaksjoner, som er kjent for å ha viktige roller i kreft progresjon [ ,,,0],27]. I cocultures med flere primærkulturer av kreft-assosiert fibroblaster, invasivitet av CD133
+ tykktarm kreft celler ble betydelig økt sammenlignet med den CD133
– celler, mens primærkulturer av andre kreftassosierte fibroblaster ikke synes å har et slikt potensial til å forbedre den invasivitet av kreftceller. Derfor preges vi disse primærkulturer av kreft-assosiert fibroblaster, og funnet ut at CD10
+ fibroblaster spilte en betydelig rolle i forbedringen av CD133
+ kreftcelle invasivitet i
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter
i denne studien brukte vi CD133
+ og CD133
– celler isolert fra dyrkede cellelinjer fordi vi klarte ikke å få reproduserbare resultater for tumorigenitet analyser og coculture eksperimenter når vi brukte CD133
+ og CD133
– celler isolert fra pasientenes svulster i en forstudie. Det er imidlertid viktig å undersøke de biologiske atferd av CD133
+ og CD133
– subpopulasjoner isolert fra pasientenes svulster. Derfor er ytterligere undersøkelser er nødvendig for å avklare forholdet mellom primærtumor-avledet CD133
+ kreftceller og CD10
+ fibroblaster. Men vi trenger å forbedre våre metoder for primærkulturer av kreftceller før slike undersøkelser kan utføres. I tillegg har vi brukt subkutane modeller i denne studien på grunn av vanskelighetene i vurderingen av tumorstørrelse i ortotopiske modeller. Men tatt i betraktning viktigheten av vevet mikromiljøet, studier ved hjelp av ortotopiske modeller bør utføres som det neste trinn.
CD10 er et 90-100 kDa-celleoverflate sinkavhengig metallprotease som er mye uttrykt av cellene i forskjellige vev, slik som lymfoide stamceller, korg celler og stromale celler fra normal benmarg og endometrium [28], [29], [30], [31]. I tillegg ble CD10 rapportert å være en markør for å kategorisere akutte leukemier og subclassifying maligne lymfomer [32]. Nyere immunhistokjemiske studier viste at hyppigheten av positive CD10 stromal ekspresjon i tumorer ble signifikant korrelert med prognosen for pasienter med brystkreft [18] samt invasjon og metastasering av gastriske cancere [19]. Ogawa et al. [31] utførte en immunhistokjemisk undersøkelse av tykktarmskreft og rapporterte at uttrykket av CD10 i stromale celler ble oftere påvist i invasive svulster enn hos ikke-invasive svulster. Resultatene av disse tidligere immunhistokjemiske studier er sammenfallende med de av våre nåværende funksjonell studie.
De foreliggende resultatene viste at knockdown av CD10 uttrykk i CD10
+ fibroblaster delvis, men betydelig redusert invasiv evne cocultured CD133
+ tykktarmskreftceller. Våre microarray data identifisert flere gener som er involvert i invasjonen av kreftceller, men knockdown av CD10 uttrykk påvirket ikke uttrykk for disse genene. Dataene kan tyde på at CD10
+ fibroblaster har både CD10-avhengig og CD10-uavhengige mekanismer for å fremme invasjonen av cocultured CD133
+ tykktarmskreftceller, men ytterligere undersøkelser er nødvendig for å belyse de detaljerte mekanismene for disse interaksjonene.
i konklusjonen, dagens funksjonelle analyser tyder på at interaksjoner mellom CD133
+ tykktarmskreftceller og kreft-assosiert CD10
+ fibroblaster har viktige roller i tykktarm kreft progresjon. Disse interaksjonene kan være lovende mål for tykktarmskreftbehandlingen.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Studiet ble godkjent av etikkomiteen av Kyushu University (godkjenningsnummer, 19 -13) og gjennomført i henhold til de etiske retningslinjene for human Genome /Gene Forskning vedtatt av den japanske regjeringen. Alle pasientene forutsatt signert informert samtykke godkjenne bruk av sine vev for uspesifiserte forskningsformål. For alle forsøk med mus, ble dyrene plassert i laminær-flow skap under spesifikke patogen-frie forhold i anlegg som er godkjent av Kyushu University (godkjenningsnummer, A020-018-0).
Cells og reagenser
menneske~~POS=TRUNC cellelinjer (DLD-en, RCM1 og Colo201) ble kjøpt fra den japanske Innsamling av forsknings Bioressurser (Osaka, Japan). De LoVo og Colo205 cellelinjer ble oppnådd fra Riken (Tsukuba, Japan), og HCT116-cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Vi etablerte 32 primærkulturer av tykktarm kreft-assosiert fibroblaster avledet fra resected colontumorer fra 26 pasienter som tidligere beskrevet [33]. Cellene ble dyrket i DMEM supplementert med streptomycin (100 ug /ml), penicillin (100 U /ml) og 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktet miljø av 90% luft og 10% CO
2. Alle forsøkene ble utført ved anvendelse av celler dyrket i medium supplert med 10% FBS. Alle vevsprøver de ble oppnådd på tidspunktet for kirurgi ved Kirurgisk avdeling I, Kyushu universitetssykehus (Fukuoka, Japan). Erfarne patologer utført histologiske undersøkelser av alle vev ved siden av prøvene.
5-Fu og DOX ble vennlig levert av Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan) og Nippon Roche K.K. (Kamakura, Japan), henholdsvis.
Flowcytometri
De vevsprøver ble vasket grundig med fosfat-bufret saltvann (PBS), hakket i ca 1 mm
3 kuber ved hjelp av saks og dissosiert til enkeltceller ved fordøyelse med kollagenase (Wako Pure Chemical Industries). De dissosierte celler ble ført gjennom et filter. Primære celler avledet fra den resekterte vev og dissosierte DLD-1-celler ble suspendert i iskald 1% FBS i PBS ved 1 x 10
6 celler /100 ul. Hver suspensjon ble inkubert med et antistoff på is i 40 min. De merkede celler ble analysert ved bruk av et EPICS ALTRA strømningscytometer (Coulter Beckman Inc., Fullerton, CA) utstyrt med to lasere som ga eksitasjonsbølgelengdene av 488 nm for den fluoresceinisotiocyanat (FITC), fykoerytrin (PE) og propidiumjodid (PI) signaler og 635 nm for de (APC) signaler allofykocyanin. De resulterende fluorescens utslipp ble samlet inn ved hjelp båndpassfiltersett på 525 ± 15 nm for FITC, 575 ± 10 nm for PE, 610 ± 12 nm for PI og 675 ± 25 nm for APC. EXPO32 flowcytometri programvare (Beckman Coulter Inc.) ble brukt til å kvantifisere fluorescens signaler og å sette de logiske elektroniske-gating parametere. De primære antistoffer som brukes for FACS analysene er oppført i tabell S2.
QRT-PCR
Totalt RNA ble utvunnet fra dyrkede og /eller sorterte cellene ved hjelp av en høy Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics , Mannheim, Tyskland) med DNase i (Roche Diagnostics) behandling, i henhold til produsentens instruksjoner. Vi har utformet spesifikke primere (tabell S3) og utført BLAST søker å sikre det som særpreger disse primere. Ett-trinns QRT-PCR ble utført ved hjelp av en QuantiTect SYBR Grønn Reverse Transcription-PCR Kit (Qiagen KK, Tokyo, Japan) og en Chromo4 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), som beskrevet tidligere [ ,,,0],34]. Hver prøve ble kjørt i triplikat, og ekspresjon av hvert gen ble presentert som forholdet mellom ekspresjonen av hver målgen mRNA og den til
18S rRNA
.
CD10
sirnas
Hemming av
CD10
genekspresjon ble oppnådd ved RNA interferens med sirnas mot
CD10 plakater (siRNA-1: forstand, 5′-GGUUGAAUUUCACAAAUGATT-3 «, antisense, 5»-UCAUUUGUGAAAUUCAACCAG-3 «, siRNA-2: forstand, 5′-GUGUGGUGUGGAACCUAUATT-3′, antisense, 5»-UAUAGGUUCCACACCACACCT-3 «, Qiagen, Poison Information Center Mainz, Tyskland) som tidligere beskrevet [35]. For å verifisere spesifisitet av knockdown effekter, brukte vi en kontroll siRNA (Qiagen).
