Abstract
Ingenol mebutate er godkjent for aktuell behandling av aktiniske keratoser og kan til slutt også finne verktøyet i behandling av hudkreft. Her viser vi at tilbakefall av subkutan B16 melanom svulster behandlet lokalt med ingenol mebutate var ikke signifikant forskjellig i C57BL /6 og Rag1
– /- mus, noe som tyder på B og T-celler ikke spiller en viktig rolle i den anti-kreft effekten av ingenol mebutate. Tilbakefall var imidlertid signifikant økt i MyD88
– /- mus og C57BL /6 mus behandlet med anti-IL-1-middel, anakinra. Ingenol mebutate behandling induserer en markert infiltrasjon av nøytrofiler, noe som har vist seg å ha anti-canceraktivitet i mus. Heri vi dokumentere at IL-1 fremmer nøytrofile rekruttering til svulsten, reduserer apoptose av infiltrere nøytrofile og øker nøytrofile svulst drap aktivitet. Disse studiene tyder på IL-1, via sin handling på nøytrofile, fremmer anti-kreft effekt av ingenol mebutate, med ingenol mebutate behandling forårsaker både IL-1β induksjon og IL-1α løslatt fra keratinocytter
Citation. Le TT, Skak K, Schroder K, Schroder WA, Boyle GM, Pierce CJ, et al. (2016) IL-1 Bidrar til Anti-Cancer Effekt av Ingenol Mebutate. PLoS ONE 11 (4): e0153975. doi: 10,1371 /journal.pone.0153975
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 07.10.2015; Godkjent: 06.04.2016; Publisert: 21 april 2016
Copyright: © 2016 Le et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. forskningen ble i hovedsak utført ved QIMR Berg Medical Research Institute og ble i stor grad finansiert av Leo Pharma, og delvis av et stipend fra Australian National Health Medical Research Council (APP1043104). Leo gitt støtte i form av lønn for TTL og forbruksvarer, var involvert i den første studien design, men var ikke involvert i datainnsamling og analyse. Leo var involvert i beslutningen om å publisere, men gitt minimal innspill til skriving av manuskriptet. K. Schroder er støttet av en australsk Forskningsrådet Future Fellowship (FT130100361), og Queensland Smart Futures Fund. AS er en Principal Stipendiat med National Health Medical Research Council, Australia (APP1058391)
Konkurrerende interesser. K. Skak er ansatt i Leo Pharma. AS var en betalt konsulent for Leo Pharma i 2011. AS er en oppfinner på en rekke patenter som dekker ingenol mebutate (Picato), men mottar ingen royalties eller økonomiske (eller andre) fordeler som resultat. Disse kommersielle bevisn endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Ingenol mebutate (Picato
®) er et godkjent aktuell medikament for feltbehandling av aktiniske keratoser (AKS) [1,2,3]. AKs er lesjoner vanligvis finner på sol-eksponert hud forårsaket av UV-stråling og er preget av unormalt prolifererende keratinocytter [4]. I ca 8% av tilfellene, kan AKs utvikle seg til invasiv plateepitelkarsinom (SCCS) [5], den nest vanligste formen for hudkreft. Fjerning av AKs og muterte keratinocytter av ingenol mebutate behandling søker dermed å redusere påfølgende risiko for å utvikle SCCS [1,6,7,8]. Ingenol mebutate kan til slutt også finne verktøyet i behandling av annen hudkreft [9,10], med effekt vist i studier på mennesker for SCCS og basalcellekreft [11,12,13]. Ingenol mebutate er avledet fra saft av
Euphorbia peplus Hotell og aktiverer protein kinase C (PKC) [14,15].
In vivo
aktuell narkotika søknad induserer primære nekrose av (i) keratinocytter, inkludert oppdateringer av keratinocytter bærer p53 mutasjoner og (ii) subkutane svulster celler som vokser under behandlingsstedet [16,17]. Aktuell behandling hos mennesker [7,18,19] og mus [16] gir en hurtig innsettende forbigående erytem og en markert rekruttering av nøytrofile [17,20,21]. Nøytrofile rekruttert og stimulert av ingenol mebutate synes også å mekle anti-kreft aktivitet ved å redusere tumor-tilbakefall i musetumormodeller, inkludert B16 melanoma modell [21].
For å undersøke hvilken rolle adaptive og medfødt immunresponser mot anti-kreft effekt av ingenol mebutate, vi undersøkt tilbakefall etter lokalbehandling av subkutane B16 svulster med ingenol mebutate i en serie av genmodifiserte mus. Selv T- og B-celle responser ikke synes å spille en viktig rolle, gir vi bevis for at IL-1 spiller en betydelig rolle i anti-kreft effekt av ingenol mebutate.
Materialer og metoder
animal etikk uttalelse
Alle mus arbeidet ble utført i samsvar med god dyr praksis som definert av National Health and Medical Research Council of Australia. Musen arbeidet ble godkjent av QIMR Berg Medical Research Institute dyreetikk komité. Musene ble avlivet når tumorer nådde 100 mm
2, en svulst størrelse som ikke forårsaker overdreven nød til dyrene.
Mus, tumorinokulasjon og ingenol mebutate behandling
hunnmus, 8 -12 uker gammel ble injisert med B16 melanomceller (4-5×10
5 celler /mus i 50 ul medium) av grunne sc injeksjon. B16-celler ble erholdt fra ATCC (CRL-6322) passaged ikke mer enn 10 ganger, og vist å være Mycoplasma negativ ved MycoAlert
™ Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Basel, Sveits) og Hoechst farging [22]. Når gjennomsnittlig tumorstørrelse nådde 10-20 mm
2 (2-4 dager etter injeksjonen) mus ble valgt slik at hver gruppe hadde et tilsvarende midlere tumorstørrelse og tumorstørrelsesfordeling; mus med tumorstørrelser som ikke kunne være hensiktsmessig matchet ble fjernet. Tumor områder ble deretter behandlet lokalt gang med 10 mL placebo eller 0,1% ingenol mebutate gel daglig i 2 dager (behandlingsstart anses som dag 0). Når tumorer nådde 100 mm
2 mus ble avlivet ved hjelp av karbondioksidgass. 0,1% gelen består av 1 mg /g ingenol-3 angelate i et hjelpestoff inneholdende isopropylalkohol, hydroksyetylcellulose, sitronsyre monohydrat, natriumsitrat, benzylalkohol og renset vann. Denne dosen og tidsplan ble valgt som tidligere arbeid hadde vist det gitt en 50-100% regresjon satsen i B16 musemodell [16,21].
C57BL /6 mus ble kjøpt fra ARC, Perth, Australia. MyD88
– /- (B6.129P2 (SJL) –
MyD88
TM1
1Defr Twitter /J.), Rag1
– /- (B6.129S7-
Rag1
tm1Mom Twitter /J) og μMT (B6.129S2-
Igh
-6
tm1Cgn
/J) mus på en C57BL /6 bakgrunn ble hentet fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA), og ble avlet in-house på QIMR B. FcR-felles gammakjedemangelfull mus (FcγR
– /-.) (B6.129P2-
Fcer1g
tm1Rav
N12) på en C57 /BL6 bakgrunn ble kjøpt fra Taconic (Hudson, NY, USA)
anakinra behandling
Kineret (anakinra) SOBI (Swedish Orphan Biovitrum) ble gitt ip ved 1 mg /mus (i 100 pl i PBS) ble daglig, dag 0 (3-4 timer før ingenol mebutate behandlingsstart) gjennom til dag 7. Det samme volum av PBS ble gitt til kontrollmusene.
Histologi og immunhistokjemi
Hematoxylin og eosin (H E), ApoTag farging (ApoTag Plus Peroxidase
In situ
apoptose Detection Kit, Millipore) og anti-Ly6G flekker (ved hjelp av rotte anti-mus Ly6G; katalognummer NMP-R14, Abcam, Cambridge, MA, USA) ble gjennomført som beskrevet tidligere [23,24]. Lysbilder ble digitalt skannet ved hjelp av en Scan ScopeXTdigital lysbilde skanner (Aperio, Vista, CA) og bildeanalyse av seksjonene i duplikat ble foretatt ved hjelp av Aperio ImageScope programvare (V10) og den positive Pixel Count v9 algoritmen bruker standardinnstillingene.
Killing assays
B16-celler (5×10
3) ble sådd på 96-brønners flate plater i 100 ul DMEM supplert med 5% føtalt kalveserum og 10 mM HEPES pH 7,2. Den neste dag (dag 1) benmargceller ble samlet opp, vasket en gang og tilsatt i løpet av 45 minutter etter prøvetaking ved den angitte effektor og mål-forhold med 6 replikater. Anakinra (100 ug /ml sluttkonsentrasjon) eller IL-1β (Shenandoah Biotechnology Inc., Warwick, PA, USA) (40 ng /ml sluttkonsentrasjon) ble deretter tilsatt, etterfulgt av ingenol mebutate (40 ng /ml endelig). Den neste dag (dag 2) suspensjons celler ble fjernet ved å snu platene på silkepapir og friskt medium ble tilsatt. Etter ytterligere 2 dagers inkubering (dag 4), ble mediet fjernet ved å snu platene på silkepapir og cellen ble fiksert og farget med krystallfiolett. Platene ble tørket, 100 ul metanol tilsatt per brønn og absorbansen målt ved 595 nm. Dreping ble beregnet i forhold til B16-celler uten effektorer etter subtraksjon av bakgrunnen.
IL-1 a og IL-1 p proteinmålinger
Mus med B16-tumorer ble behandlet med ingenol mebutate dag 0 og 1, behandlings områder ble skåret ut ved de angitte tider, homogenisert (ved hjelp Precellys24 vev-homogenisator og keramiske perler) i PBS supplert med 0,1% Igepal CA-630 ikke-ionisk detergent (Sigma) og protease-inhibitor cocktail (Roche). IL-1a og IL-1 nivåene ble målt i supernatantene ved hjelp av BD ™ cytometri Bead Array Flex Set reagenser (BD Biosciences).
keratinocyte kulturer og anti-IL-1α immunoblotting
Menneskelig voksen epidermale keratinocytter (Heka-APF, Cascade Biologics, OR, USA) ble dyrket i henhold til leverandørens anbefalinger om lag matrise og i lav kalsium medium (EpiLife med S7) uten serum (Gibco). Celler vi dyrket til konfluens i 6 brønners plater, kalsium ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mM og cellene dyrket i 48 timer. Cellene ble så behandlet med de angitte konsentrasjoner av ingenol mebutate i 16 timer i 1 ml EpiLife medium inneholdende 1 mM kalsium. Supernatantene ble høstet, sentrifugert ved 1000 g i 5 minutter, og proteinene i supernatanten ble utfelt ved bruk av metanol som beskrevet [25]. Bunnfall ble så analysert ved Western blotting ved å bruke et anti-IL-1α antistoff (Abcam; katalognummer 9614) og geite-anti-kanin HRP-sekundært antistoff (Merck Millipore). Blottene ble skannet med Imagequant LAS 500.
statistikker
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av IBM SPSS Statistics (version19). Overlevelse og tilbakefall er representert som Kaplan-Meier plott, med statistisk signifikans bestemmes av log-rank (Mantel-Cox) tester. For andre data angir t-test ble anvendt hvis forskjellen i avvikene var mindre enn 4, skjevhet var -2, og kurtosis var mindre enn 2; hvor data ble ikke-parametriske og forskjell i avvik var mindre enn 4, ble Mann-Whitney U-test anvendt, hvis 4 den Kolmogorov-Smirnov test ble brukt. En 2-veis ANOVA ble brukt for ApoTag flekker, med data som viser en parametrisk fordeling og forskjeller i varians. 4
Resultater
tilbakefall hos mus som mangler T og B-celle responser
Både anti-kreft-T-celler og anti-kreft-antistoffer induseres etter topisk ingenol mebutate behandling (og regresjon) av et antall subkutant dyrket tumorer i mus [9,10,21]. Eksperimenter som bruker LK2 plateepitelkarsinom linjen vokst i
Foxn1
nu
mus også foreslå en rolle for antistoffer og antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) for å forebygge tilbakefall [21]. For å undersøke ytterligere bidrag av adaptive immunresponser mot anti-kreft aktivitet av ingenol mebutate, ble B16 svulster dyrket subkutant til 10-20 mm
2 i Rag1
– /- mus (C57BL /6 bakgrunnen), som er ikke i stand til å generere adaptiv B- eller T-celle responser, og i kontroll C57BL /6 mus. Tumorseter ble deretter behandlet to ganger topisk (dag 0 og dag 1) med ingenol mebutate eller placebo gel, og tumorvekst ble overvåket over tid. Tilbakefall var ikke signifikant forskjellig mellom Rag1
– /- og C57BL /6 mus (Figur A i S1 File), noe som tyder på hverken B eller T-celler spiller en viktig rolle i anti-tumor effektiviteten ingenol mebutate i B16-modellen .
Ytterligere eksperimenter for å undersøke rollen til (i) ADCC [21] med Fc-reseptor vanlige gammakjeden manglende mus (FcγR
– /-) mus (figur B i S1-fil) og (ii) antistoffer ved hjelp av B-celle mangel μMT mus (Figur C i S1 File), var mangelfulle som vekstrater på B16 (i fravær av ingenol mebutate behandling) var annerledes i disse musene.
Økt tilbakefall i MyD88
– /- mus
for å undersøke dette nærmere bidrag av medfødte immunresponser [21] til anti-kreft effekt av ingenol mebutate behandling, ble B16 celler dyrket subkutant til 10-20 mm
2 i MyD88
– /-. og C57BL /6 mus og ble deretter behandlet to ganger (dag 0 og dag 1) med ingenol mebutate eller placebo gel, og tumorvekst følges over tid
tilbakefall i MyD88
– /- mus var signifikant høyere (84%) enn i C57BL /6 mus (50%) etter ingenol mebutate behandling (fig 1 A), med en påfølgende vesentlig reduksjon i overlevelse fra 50% i C57BL /6 til 16% i MyD88
– /- mus (fig 1B)
(A) tilbakefall følgende (i) ingenol mebutate behandling av B16 svulster dyrket i MyD88
-. /- mus (n = 25), ( ii) ingenol mebutate behandling av B16 tumorer dyrket i C57BL /6 mus (n = 21), (iii) placebo-behandling av B16 tumorer dyrket i MyD88
– /- mus (n = 18) og (iv) med placebobehandling av B16 tumorer dyrket i C57BL /6 mus (n = 19). Mus ble scoret positivt når en svulst var klart synlig (≥1-2 mm i diameter). Data fra to uavhengige forsøk. Ingenol mebutate behandlingsgruppene var signifikant forskjellig p = 0,021, log-rank (Mantel-Cox) test. (B) Overlevelse av de samme musene som beskrevet i A; Musene ble avlivet når tumorer nådde 100 mm
2. Ingenol mebutate behandlingsgruppene var signifikant forskjellig p = 0,018, log-rank (Mantel-Cox) test.
I motsetning til en tidligere rapport [26], observerte vi ingen signifikante forskjeller i veksten av B16 i MyD88
– /- og C57BL /6 mus i placebo mus (Figur D i S1 File). Overlevelse var faktisk marginalt (men ikke vesentlig) økte i MyD88
– /- mus sammenlignet med C57BL /6 i fravær av ingenol mebutate (figur 1B, sammenlign placebogruppen). De to sistnevnte observasjoner tyder på at de økte tilbakefall i MyD88
– /- mus legge ingenol mebutate behandling var ikke på grunn av iboende mer robust vekst av B16 svulster i MyD88
– /-. Mus
anakinra behandlingen økte tilbakefall
MyD88 er involvert i signaltransduksjon for både Toll-lignende reseptorer og IL-1-reseptoren, og IL-1β mRNA blir indusert i mus etter topisk ingenol mebutate behandling [21]. Keratinocytter uttrykker høye nivåer av IL-konstitutiv 1α, som frigjøres etter topisk applikasjon av forbolester [27]; forbolester, som ingenol mebutate, aktiverer PKC [14]. Anvendelse av IL-1-manglende mus kompliseres av de meget forskjellige vekstrater B16 i disse dyrene sammenlignet med villtype-mus [28]. Således for å undersøke rollen til IL-1, ble musene behandlet med anakinra, en rekombinant IL-1-reseptorantagonist anvendt ved behandling av reumatoid artritt. Anakinra behandling økte signifikant tilbakefall fra 0% til 50% (figur 2A) og redusert overlevelse fra 100% til 0% (figur 2B), noe som tyder på at IL-1 spiller en rolle i anti-tumor effekt av ingenol mebutate. Anakinra behandling ikke påvirke veksten av etablerte B16 svulster
in vivo plakater (figur E i S1 File), i samsvar med tidligere funn [29,30,31].
(A) tilbakefall etter C57BL /6 mus med B16 svulster ble behandlet med ingenol mebuate eller placebo, og fikk daglige injeksjoner av PBS eller anakinra, dag 1-7. (N = 9-12 mus per gruppe). Mus ble scoret positivt når en svulst var klart synlig (≥1-2 mm i diameter). Statistikk sammenlignet + anakinra med + PBS i ingenol mebutate behandlede grupper ved hjelp av log-rank (Mantel-Cox) test. (B) Overlevelse av musene som er beskrevet i A; Musene ble avlivet når tumorer nådde 100 mm
2. Statistikk som i A.
Anakinra og nøytrofile rekruttering og apoptose
Aktuelt ingenol mebutate behandlingsresultater i en markert rekruttering av nøytrofile til behandlingsstedet [9,17,20,21] som her ble kvantifisert ved hjelp av anti-Ly6G antistoff farging, immunhistokjemi og bildeanalyse (Aperio Positiv Pixel teller). Som forventet ble det observert betydelig rekruttering av nøytrofile til behandlingsstedet (peaking på dag to etter behandlingsstart) (figur 3A, behandlingsstedet, sammenligne dag 0 med dag to PBS). Selv om IL-1 har vist seg å fremme nøytrofile rekruttering i flere innstillinger [32,33,34] anakinra behandling påvirket ikke rekruttering til behandlingsstedet (figur 3A, behandlingsstedet, sammenligne dag 2, PBS versus anakinra). Men i seksjoner hvor tumoren kunne sees tydelig, tettheten av nøytrofiler innenfor ≈200 um av tumormassen var marginalt (mer enn to ganger), men betydelig lavere i anakinra behandlede dyr (figur 3A, Innenfor ≈200 um av svulst, sammenlign dag 2, PBS versus anakinra). Eksempler på sistnevnte er vist i figur 3B, med nøytrofiler flekker brun og tumormassen lett identifiserbare ved de sorte Melanosomer (figur 3B, hvite ovaler). Anakinra således ut til å redusere neutrofil rekruttering til tumoren, med tumor-avledet IL-1β tidligere rapportert å rekruttere anti-kreft nøytrofiler til tumoren [35].
(A) Neutrofil rekrutteringen til behandlinger sider (venstre tverr diagram) og innen ≈200 mikrometer tumor (høyre stolpediagram). Behandlingssteder; dag 2 etter oppstart av ingenol mebutate behandling, ble behandlingssteder skåret ut og behandlet for immunhistokjemi og farget med nøytrofile markør, anti-Ly6G. Lysbilder ble skannet og analysert av Aperio Pixel teller programvare for brune flekker (standardinnstillinger) eksklusive områder med svulst (som melanosomer gi et falskt positivt signal). To snitt per mus, 6 mus per gruppe. Statistikk etter Kolmogorov-Smirnov tester (forskjeller i varians mellom gruppene var 4). Innenfor ≈200 mikrometer svulst; i seksjoner hvor tumormassen kan bli lett identifisert (ved tilstedeværelsen av sorte melanosomer), ble brune flekker som omgir svulsten (innen ≈200 um) kvantifisert som ovenfor. En del per mus, 4-5 mus per gruppe. Statistikk etter Mann Whitney U test (ikke-parametrisk data fordeling og forskjeller i varians 4). (B) illustrerer den reduserte tettheten av anti-Ly6G fargings nøytrofiler (brun flekk) innenfor ≈200 um av tumormassen i anakinra versus PBS behandlede mus. Svulstene blir angitt med hvite linjer og identifiseres ved tilstedeværelsen av sorte melanosomer. Seksjoner er orientert med huden (ikke vist) i toppen, sammen med de tumorer som ligger i dermis. (C) ApoTag farging av delene som er beskrevet i A. Seks mus per gruppe, 2/3 snitt per mus, statistikk ved 2-veis ANOVA (parametrisk data fordeling og forskjeller i varians 4, narkotika og mus som faste faktorer, 2 /3 seksjoner per mus som avhengige variabler). (Eksempler på fargingen er vist i figur F i S1-fil).
IL-1 er blitt rapportert å hemme nøytrofil apoptose [36,37,38]. Parallelle seksjoner til de som er beskrevet ovenfor ble derfor farget med ApoTag og bildeanalyse (som over) av nøytrofile rike områder forpliktet seg til å måle omfanget av apoptose. Eksempler på Apotag farging er vist i figur F i S1 fil. Anakinra behandling mer enn doblet ApoTag farging tettheten i nøytrofile rike områder i behandlingssteder i dermis 2 dager etter ingenol mebutate behandlingsstart (Fig 3C), noe som tyder på IL-1 fremmer overlevelsen av nøytrofile rekruttert av ingenol mebutate behandling.
Ingenol mebutate og IL-1β fremme drap av B16 celler
in vitro
Vi har tidligere vist at menneske nøytrofile viser forbedret avliving av humane melanomceller
in vitro
i nærvær av ingenol mebutate [21]. For å undersøke dette nærmere evne ingenol mebutate å fremme svulst drap av nøytrofile, utviklet vi et muse-systemet med B16-celler og benmargsceller, som omfatter ≈40% nøytrofile, ≈40% B-celler, ≈ 10% monocyttiske celler og et lite antall av andre celletyper. Ingenol mebutate var konsekvent i stand vesentlig til å fremme drap av B16 celler ved disse cellene ved ≥ 2 ganger (figur 4A, p = 0,005 og 0,002). Dette dreping ble ikke inhibert i nærvær av anakinra (figur 4A, stiplede linjer), og antyder at hverken ingenol mebutate-stimulerte neutrofiler [39] eller B16-celler utvikle tilstrekkelig IL-1 til å stimulere svulstcelledrepende [35]. Imidlertid, i nærvær av eksogent tilsatt IL-1β, drepte var marginalt, men konsekvent, og ofte betydelig økt både i nærvær og fravær av ingenol mebutate (figur 4B). Disse data understøtter det syn at IL-1 forbedrer anti-cancer aktiviteten til neutrofiler
in vitro
, i samsvar med tidligere rapporter som viser at IL-1 kan fremme degranulering og respiratorisk utbrudd-aktivitet i humane neutrofiler [40,41] . (Vi klarte ikke formelt å utelukke at andre celler i benmargen var ansvarlige for den anti-kreft celle aktivitet, som rensing av murine nøytrofile resultert i inkonsistente resultater).
(A) benmargceller (≈ 40% neutrofiler) ble inkubert med B16-celler i 96-brønners plater (6 replikat) ved den angitte effektor og mål-forhold og celledreping beregnet i forhold til B16 celler med intet medikament eller effektorer. Statistikk etter Kolmogorov-Smirnov (forskjell i variansen 4) p = 0,005, og Mann Whitney U test (ikke-parametrisk fordeling og forskjell i variansen 4) p = 0,002. Ingenol mebutate (40 ng /ml sluttkonsentrasjon) og /eller anakinra (100 ug /ml sluttkonsentrasjon) var til stede i løpet av analysen. (B) Når det gjelder A, bortsett fra et stort utvalg av effektor og mål-forhold (dvs. 15: 1 til 250: 1) ble anvendt og IL-1β (40 ng /ml sluttkonsentrasjon) ble tilsatt. Statistikk etter Kolmogorov-Smirnov (for datasett der forskjell i variansen var 4) og t-tester (for datasett med parametrisk fordeling og forskjeller i varians 4).
IL-1 protein nivået~~POS=HEADCOMP ved ingenol mebutate behandlingssteder
de data så langt støtter den oppfatning at IL-1 fremmer anti-kreft effekt av ingenol mebutate ved å fremme nøytrofile anti-kreft aktivitet, med MyD88 nødvendig for IL-1 reseptoren signal transduksjon [42]. For å få ytterligere innsikt i IL-1 produksjon, ble vev IL-1α og IL-1 proteinnivåer på behandlingssteder kvantifisert før og etter ingenol mebutate behandling. IL-1a proteinnivåer ved behandlingssteder var høye før behandling (figur 5A), med IL-1α uttrykk begrenset til huden i stedet for B16 tumor (figur G i S1 File). Denne observasjonen er i overensstemmelse med kjent høy konstitutive pro-IL-1α proteinekspresjon i keratinocytter [27]. IL-1a protein nivåer falt betydelig (≈3 fold) etter behandling (figur 5A), sannsynligvis i forbindelse med omfattende keratinocyte nekrose indusert innen 6-24 timer etter ingenol mebutate behandling [17]. Dette mønsteret av IL-1α protein uttrykk var lik i MyD88
– /- mus (Fig 5A, MyD88
– /- Figur G i S1 File).
(A, B) C57BL /6 og MyD88
– /- mus med B16 tumor ble behandlet topisk med ingenol mebutate dag 0 og 1, behandlingssteder ble skåret ut og IL-1 a og IL-1-nivåer ble målt i ekstrakter ved bruk av BD BD ™ cytometrisk Bead Array ( n = 6 mus per gruppe og tidspunkt). Statistikk etter Kolmogorov-Smirnov tester (forskjeller i varians 4). (C) Cultured voksne humane keratinocytter ble behandlet med den angitte konsentrasjon av ingenol mebutate i 16 timer og supernatantene ble analysert ved Western ved hjelp av et anti-IL-1α antistoff. Pilen indikerer posisjonen til 18 kDa bioaktive formen av IL-1α.
IL-1β proteinnivåer i C57BL /6 mus var lave før ingenol mebutate behandling og øket (≈3 ganger) etter ingenol mebutate behandling, med denne økning rekkende betydning på dag 6 (figur 5B, C57BL /6) var i overensstemmelse med tidligere mRNA data [21]. På dag 6 IL-1β protein-nivåer var også signifikant høyere i ingenol mebutate behandlede C57BL /6-mus sammenlignet med ingenol mebutate behandlet MyD88
– /- mus (figur 5B, dag 6). Dermed MyD88
– /-. Mus har en defekt i IL-1β protein induksjon etter ingenol mebutate behandling, i samsvar med den MyD88 avhengige IL-1β induksjon sett i flere innstillinger [43,44]
bead basert IL-1-analyser, som anvendes her på vev lysatene, er i stand til å skille mellom inaktive (pro-IL-1) og spaltet aktivt IL-1-arter, med nyere data tyder på pro-IL-1α også trenger å bli spaltet til 18 kDa-formen være aktivt ved fysiologiske konsentrasjoner [45]. Dermed IL-1α løslatt fra keratinocytter [27] og /eller IL-1β induksjon kan gi IL-1 etter ingenol mebutate behandling.
Ingenol mebutate fører IL-1α utgivelse fra keratinocytter
in vitro
betydelig høyere nivåer av IL-1α, sammenlignet med IL-1β (fig 5A vs 5B), kan hevde at IL-1α er en stor aktør i denne innstillingen. Fallet i totale IL-1α nivåer etter ingenol mebutate behandling (figur 5A) (samtidig med keratinocyte nekrose [17]) tyder keratinocyte IL-1α kan frigis, gitt at andre topikalt PKC aktivatorer føre IL-1α utgivelse fra keratinocytter [27 ]. Keratinocytter konstitutivt uttrykker høye nivåer av intracellulære pro-IL-1α [27], som er bundet til IL-1 reseptoren 2 (IL1R2) [46], med IL1R2 faktisk oppregulert etter ingenol mebutate treament [15]. Fremstilling av fysiologisk aktive IL-1α antas å kreve at (i) frigjøring av pro-IL-1α fra IL-1R2, en prosess mediert av caspase-1-formidlet kløyving av IL-1R2, og (ii) etterfølgende spaltning av det frigjorte pro-IL-1α av kalpain å generere fysiologisk bioaktive 18 kDa IL-1α [45].
for å avgjøre om ingenol mebutate behandling av keratinocytter fører til frigjøring av IL-1α, dyrkede primære humane keratinocytter ble behandlet med ingenol mebutate
in vitro
i 16 timer, og supernatanten analyseres med hensyn til nærværet av de 18 kDa arter av IL-1α ved Western. Behandling med ingenol mebutate 50 ug /ml, men ikke 20 eller 5 ug /ml, førte til frigjøring av 18 kDa IL-1α (figur 5C, pil). 50 pg /ml konsentrasjon fører til økninger i cytosolisk kalsium, men ligger like under den konsentrasjon som forårsaker overt cytotoksiske påvirker i keratinocytter [47]; (Vi også observert noen åpenlys celledød i disse kulturene).
Diskusjoner
Heri vi gi bevis for at anti-kreft effekt av aktuell ingenol mebutate behandling krever både MyD88 og IL-1. Økte tumor tilbakefall ble sett i MyD88
– /- mus, og i C57BL /6-mus etter anakinra (anti-IL-1) behandling, med MyD88 nødvendig for IL-1-reseptoren signalering [42]. Topisk ingenol mebutate behandling er kjent for å forårsake en utpreget rekruttering av nøytrofiler til behandlingsstedet [9,17,20,21], sammen med IL-1 tidligere vist å fremme anti-kreft-aktivitet av nøytrofiler i B16-modellen [35,48 ]. (IL-1β ikke har noen direkte effekt på B16 vekst [35]). Nøytrofile celler er også kjent for å mediere anti-kreft-aktivitet i andre systemer [49,50]. Vi viser her at IL-1 påvirker tre aspekter av nøytrofile atferd følgende ingenol mebutate administrasjon; (I) øket rekruttering til tumoren (figur 3B), i samsvar med den mye rapportert rollen som IL-1 for å fremme neutrofil rekruttering [32,33,34,35,51,52,53], (ii) redusert nøytrofil apoptose ( figur 3C), sammen med IL-1 som tidligere er rapportert å hemme nøytrofil apoptose [36,37,38], og (iii) øket tumor dreping, i samsvar med den rapporterte rollen som IL-1 for å fremme nøytrofil-aktivering [40,41]. IL-1 og IL-1 reseptoren signaliserer dermed ut til å spille en rolle i å redusere tilbakefall legge ingenol mebutate behandling ved å fremme anti-kreft aktiviteter nøytrofile.
Behandling av keratinocytter
in vitro
, med en dose på ingenol mebutate som er i stand til å øke intracellulært kalsium [47], resulterte i frigjøring av den 18 kDa bioaktive formen av IL-1α. Keratinocyte-avledet IL-1α kan dermed (i hvert fall i utgangspunktet) være en viktig kilde til IL-1 etter ingenol mebutate behandling. Lavere ingenol mebutate doser fremkalte ikke IL-1α frigivelse, noe som tyder på PKC-aktivering (som forekommer ved konsentrasjoner så lave som 10 ng /ml [21]) ikke er tilstrekkelig for IL-1α frigivelse. Øket intracellulært kalsium [16] kan forventes å aktivere kalpain [54], med aktiv kalpain er nødvendig for spaltning av pro-IL-1α til 18 kDa IL-1a arter [45]. Imidlertid må pro-IL-1α først frigjøres fra IL-1R2, en prosess som antas å være formidlet av caspase-1-formidlet kløyving av IL-1R2 [45]. Offentliggjøring av 18 kDa IL-1α meldingen kan foreslå aktivering av keratinocyte caspase-1 og caspase en induksjon og aktivering kan påvises i huden etter ingenol mebutate behandling (figur H i S1 File). Videre kan permeabiliseringen av plasmamembranen være tilstrekkelig for inflammasome (og således caspase 1) aktivering [55], med ingenol mebutate i stand til å indusere plasmamembranen permeabilization [16,47]. Men aktivering av keratinocyte caspase-1 (og kanskje pyroptosis [56]) etter lokal ingenol mebutate behandling gjenstår å formelt demonstrert, og kompliseres av overflod av nøytrofile, som også uttrykker caspase 1.
keratinocyte avledede IL-1α kan være involvert i (MyD88-avhengige) induksjon av IL-1β (figur 5B), med IL-1β induksjon ved IL-1 rapportert tidligere [57,58] og tumor-avledet IL-1β også vist rekruttere nøytrofiler til tumoren [35]. Som B16 cellene ikke gjøre IL-1 [35], ikke-maligne celler i /rundt tumoren (f.eks stromale celler, fibroblaster og /eller makrofager) kan representere en kilde av IL-1β. Etter ingenol mebutate behandling
in vivo product: (i) B16 tumorvev viser et ≈1.5 gangers induksjon av IL-1β mRNA [21] og (ii) tumorbehandlingssteder viser et ≈2.5 gangers økning i IL-1β protein nivåer (fig 5B). Stimulert nøytrofile kan også gjøre IL-1β [39,59]. Toll-like receptor engasjement kan også være involvert i IL-1β induksjon [43,44], med induksjon av primær nekrose og blødning i tumor (tydelig etter ingenol mebutate behandling i mus [60], se også figur jeg i S1-fil) potensielt gi selv avledet Toll-like receptor agonister [61].
Tidligere data som viser økt tilbakefall av LK2 svulster i SCID-mus (som gjør lite eller ingen immunoglobulin) versus
Foxn1
nu
mus (som beholder evnen til å gjøre IgM), foreslo en rolle for anti-kreft antistoffer og nøytrofile ADCC i å redusere tilbakefall [21]. Men dataene som presenteres her bruker B16 svulster dyrket i Rag1
– /- mus, antyder verken antistoffer (eller T-celler) spiller en viktig rolle i å redusere tilbakefall.
