Abstract
Bakgrunn
apoptose spiller en sentral rolle i patogenesen av kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), og denne prosessen kan reguleres ved mitokondriell transkripsjonsfaktor A (mtTFA). Epigenetikk er involvert i reguleringen og modifikasjon av de involverte i lungekreft og KOLS gener. I denne studien, bestemt vi uttrykk for mtTFA og dens metylering nivåer i KOLS-pasienter med lungekreft.
Metoder
Tjueen squamous celle lunge kreftpasienter, 11 med kols og 10 uten KOLS, gjennomgår pneumonectomy ble registrert. Den apoptotiske indeks (AI) av pulmonale vaskulære endotelceller ble analysert ved transferase-mediert deoksyuridin trifosfat-biotin nick ende merkingsassay. Ekspresjonen av mtTFA mRNA og protein ble målt ved anvendelse av PCR, immunohistokjemi og Western-blot. Metylering av
mtTFA
arrangøren ble oppdaget ved hjelp bisulfite sekvensering av PCR.
Resultater
I forhold til ikke-kols gruppen, AI var høyere, og uttrykk for mtTFA mRNA og protein var lavere i KOLS-gruppen (
P
0,001). Uttrykk av mtTFA protein var positivt korrelert med FEV
1 /Pre (
r
= 0,892,
P
0,001), og negativt korrelert med AI (
r
= -0,749,
P
0,001) og røyk indeks (
r
= -0,763,
P
0,001). Andel
mtTFA
promoter metylering i KOLS-pasienter var betydelig høyere sammenlignet med ikke-KOLS-pasienter (
P
0,05).
Konklusjon
Disse resultatene tyder på at ekspresjon av mtTFA mRNA og protein er nedregulert i lungevev fra KOLS pasienter med squamous celle lungekreft, og nivået av mtTFA protein er knyttet til apoptose av pulmonale vaskulære endotelceller. Avvikende
mtTFA
metylering kan også spille en viktig rolle i patogenesen av KOLS
Citation. Peng H, Yang M, Chen Z-y, Chen P, Guan C-x, Xiang X-d, et al. (2013) uttrykk og metylering av mitokondrie transkripsjon faktor A i kronisk obstruktiv lungesykdom Pasienter med lungekreft. PLoS ONE 8 (12): e82739. doi: 10,1371 /journal.pone.0082739
Redaktør: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, Frankrike
mottatt: 28. mars 2013, Godkjent: 28 oktober 2013; Publisert: 18.12.2013
Copyright: © 2013 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 30800503, nr 30770931 og nr 81070039) og Natural Science Foundation National i Hunan-provinsen (No. 09JJ3036). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) er en av de vanligste kroniske sykdommer. Den globale utbredelsen hos voksne over 40 år er anslått til å være 10% [1]. Mange mekanismer som kronisk inflammasjon, proteinase /anti-proteinase ubalanse, og oksidativt stress er involvert i patogenesen av COPD [2], og de kommuniserer med hverandre i løpet av utviklingen av sykdommen. Nyere data fra både dyremodeller og studier på mennesker [3] – [6] antyder en viktig rolle for endothelial apoptose i de patologiske prosesser av KOLS
Mitokondrietranskripsjonsfaktor A (mtTFA, TFAM) er en kjerne-kodet. protein som binder oppstrøms for lys tråd promoter (LSP) og tunge tråd promoter (HSP) av mitokondrie DNA (mtDNA). mtTFA fremmer transkripsjon av mtDNA og regulerer mtDNA replikering [7]. Forstyrrelse av
mtTFA
genet i mus resulterer i nedbryting av mtDNA, tap av mitokondrielle transkripsjoner, nedskrivning av kjeden respirasjon, celle apoptose, og reduksjon av mtDNA-kodet polypeptider [8], [9]. På den annen side kan overekspresjon av mtTFA lindre nedgangen i mtDNA kopiantall og apoptose i transgene (Tg) -mus [10]. Remels et al [11] fant at mengden av mtTFA protein var signifikant lavere i quadriceps muskelen av pasienter med moderat til svært alvorlig KOLS enn i kontrollene. De rapporterte også at mengden av mtTFA mRNA og protein var signifikant lavere hos pasienter med cachectic KOLS forhold til at både ikke-cachectic pasienter og kontrollpersoner [11]. Disse observasjonene tyder på at avbrudd av mtTFA er assosiert med muskel unormalt i pasienter med KOLS skjelett. Imidlertid har uttrykket av mtTFA i lungen av KOLS-pasienter ikke blitt studert, og de underliggende mekanismer er ikke blitt klarlagt.
Epigenetikk refererer til arvelige forandringer i gen-funksjon som oppstår ved endringer i kromatinstruktur uten noen endring i DNA-sekvensen. En av de viktigste epigenetiske mekanismene er DNA-metylering, som undertrykker gentranskripsjon, og modifiserer kjernen histoner på nedsatt DNA i kromosomet. DNA-metylering kan resultere i enten aktivering eller represjon av gener [12]. Opp til nå, er det meste av forskningen på dette området fokusert på kreft, celleutvikling og differensiering. Men det er økende bevis for at epigenetikk kan også spille en viktig rolle i reguleringen av gener involvert i astma og KOLS [13]. Demeo et al fant at variabelen DNA metylering er forbundet med KOLS og lungefunksjonen [14]. De fant også at
Alu Hotell og LINE-en hypometylering er forbundet med lavere lungefunksjon og /eller rask lungefunksjon nedgang i eldre pasienter [15]. Derfor presenterer epigenetisk etiologi en roman mål for behandling av astma og KOLS [16].
Sigarettrøyk er en viktig risikofaktor for KOLS. Tallrike studier har vist at røyking kan endre DNA metylering. En tidligere rapport viste at det var minst en avvikende genet metylering i 32 prosent av bronkial penselprøve fra personer med røyking historie [17]. Kikuchi et al [18] fant også TSLC1 /IGSF4 metylering var korrelert med røyking indeksen. Sigarettrøyking og tidsintervall på avholdenhet er forbundet med differensial DNA metylering over det menneskelige genom [19]. Sekvensanalyse viste at det er 67 potensielle CpG metylering loci mellom -2246 bp og 132 bp av humant
mtTFA
promoter, noe som tyder på at cytosin-metylering kan spille en rolle i reguleringen av mtTFA uttrykk. Choi et al [20] fant luciferasepreparater aktiviteter pGL2-hTfam i forbigående transfekterte HepG2 celler hemmes av stedsspesifikk metylering. Dette
in vitro
studien viste at metylering av kjernefysisk luftfaktor 1 (NRF-1) bindende regionen hemmet sterkt aktiviteten til
mtTFA
promoter i forbigående transfekterte HepG2 celler.
i denne studien har vi testet hypotesen om at endringer i uttrykket av mtTFA og avvikende
mtTFA
metylering kan spille viktige roller i patogenesen av KOLS.
Materialer og metoder
Ethic Uttalelse
Denne studien ble godkjent av institusjonelle etiske komité av Second Xiangya Hospital of Central-South University og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag før påmeldingen inn i studien.
pasienter og deres generelle informasjons
studie~~POS=TRUNC besto av 11 squamous celle lungekreftpasienter (stadium II) med KOLS og 10 squamous celle lungekreftpasienter (stadium II) uten KOLS som gjennomgikk pneumonectomy. Lungevev 5 cm fra tumor margin ble anvendt i våre studier. Alle KOLS-pasienter led av kronisk luftveisobstruksjon, definert som en post-bronkodilator forsert ekspiratorisk volum i ett sekund i løpet av forsert vitalkapasitet (FEV
1 /FVC) er 70%, i fravær av alternative årsaker. Alle pasientene hadde ikke fått lungetransplantasjon, strålebehandling, cellegift eller inhalert kortikosteroid behandling. De deltakere inkludert ikke har noen andre confoundable medisinske tilstander som mage, nyre, endokrine, metabolske og inflammatoriske sykdommer. FEV
1 og FVC ble vurdert fra strømnings-volum-kurven oppnådd ved bruk av en spirometer (Sensormedics AutoBox-6200D, USA). Lungefunksjonsparametere ble uttrykt som en prosentandel av referanseverdier. Generelle pasientkarakteristika er vist i tabell 1. Det var ingen forskjell i alder eller kjønn mellom de to gruppene (
P
0,05). Sammenlignet med den ikke-KOLS gruppe, røyking indeksen for KOLS gruppen var signifikant høyere (
P
0,001), mens begge FEV
1 /Pre (%) (prosentandel av FEV
en faktisk av FEV
en betinget) og FEV
1 /FVC (%) var lavere i KOLS-gruppen (
P
. 0,001)
Metoder
Histologiske studier.
parafininnstøpte deler av menneske lungevev ble deparaffinized og rehydrert med xylen og etanol. Seksjonene ble kort vasket, farget i Harris hematoxylin løsning i 5 til 10 minutter, differensiert i 1% syre alkohol i 30 sekunder, og deretter vasket. Seksjonene ble deretter motfarget i eosin-phloxine oppløsningen i 30 sekunder til ett minutt, dehydrert med 95% alkohol og 2 forandringer av absolutt alkohol i 5 minutter hver, fjernet i 2 endringer xylen 5 minutter hver, og montert med xylen basert monteringsmedium . Histologi ble vurdert av en patolog blindt. Som emfysem er en strukturell forstyrrelse karakterisert ved ødeleggelse av de alveolære vegger og utvidelse av alveolarområdene, ble forstørrelse av alveolarområdene bestemt ved å kvantifisere den midlere lineære skjæringspunktet (MLI) og ødeleggelse av alveolære vegger ved å måle den destruktive indeks (DI). Den MLI, et mål for inter-alveolar vegg hold, ble bestemt ved lysmikroskopi ved en total forstørrelse på 100 x. Felt som inkluderte store luftveiene eller fartøy ble ekskludert fra analysen. Den MLI ble definert som den totale lengde av den tverslinje dividert med antallet av alveolære vegger som krysser testlinjer, som beskrevet av Xu et al [21]. DI ble beregnet som et mål for parenchymal ødeleggelse ved hjelp av et mikroskopisk punkt-teller teknikk [22]. Analysen ble utført i duplikat ved tilfeldig telle mer enn 3000 alveolene fra 50 HE seksjoner fra hver pasient ved en forstørrelse på 200 ×.
Måling av apoptose.
Terminal Deoxynucleotidyltransferase-mediert dUTP Nick End merking (TUNEL) analyse ble anvendt for å måle apoptose av endotelceller i lungene til KOLS-pasienter. Kryostat vevssnitt av lungen ble fiksert i 1% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. TUNEL farging ble utført med
In Situ
celledød Detection Kit-POD (Roche). TUNEL-positive og negative celler på hele delen ble talt av en patolog på en blindet måte, og den apoptotiske indeksen ble beregnet som antall TUNEL-positive endoteliale celler /hele endotelceller.
revers transkriptase-polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR).
Total RNA ble ekstrahert ved bruk av Trizol reagens ett-trinns ekstraksjon metode (Invitrogen, USA). RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av et spektrofotometer, og kvaliteten ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. RNA (2 mg per prøve) ble reverstranskribert for å lage komplementært DNA (cDNA) i henhold til produsentens instruksjoner (RT kit, FERMENTAS, USA). cDNA ble PCR forsterket ved hjelp av Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, Breda, Nederland) på en termosykler apparat (Applied B PE4500, USA). Termisk sykling betingelser ble konstruert som følger: initial denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 35 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder og 55 ° C i 45 sek, og et forlengelsestrinn på 5 min ved 72 ° C. Primerene anvendt for PCR var som følger: 5′-TATCAAGATGCTTATAGGGC-3 «og 5′-ACTCCTCAGCACCATATTTT-3′ for mtTFA (amplikon forventet størrelse 441 bp); 5»-ACCCACACTGTGCCCATCTAC-3 «og 5′-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3» for β-aktin (amplikon forventet størrelse 103 bp). Transkript nivå av den konstitutive husholdningsgenet β-actin ble kvantitativt målt som en kontroll for RNA lasting. Genekspresjon ble kvantifisert og uttrykt i vilkårlige enheter (AU).
Real-time RT-PCR (QRT-PCR).
Isolert RNA ble revers transkribert til cDNA ved RT-PCR. cDNA ble PCR-amplifisert ved å bruke platina Taq DNA-polymerase (Invitrogen, Breda, Nederland) på en Bio-Rad iCycler apparat (Bio-Rad, USA). Termisk sykling betingelser ble konstruert som følger: initial denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 10 sekunder og 57 ° C i 20 sekunder, og et forlengelsestrinn på 5 min ved 72 ° C. Primerene anvendt for PCR var som følger: 5′-GAACAACTACCCATATTTAAAGCTCA-3 «og 5′-GAATCAGGAAGTTCCCTCCA-3′ for mtTFA; 5»-CCAACCGCGAGAAGATGA-3 «og 5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3» for β-aktin. Forventet amplicon størrelser var 95 bp og 97 bp. Spesifisiteten av amplifiseringen ble bekreftet ved smeltekurve analyse og evaluering av effektiviteten av PCR-amplifikasjon. Transkripsjonsnivåer av den konstitutive rengjøring genproduktet β-actin ble kvantitativt målt for kontroll av lastingen. Relative endringer i karakter overflod ble uttrykt som A C
T-verdier (A C
T = A C
T henvisning -ΔC
T mål), hvor higherΔC
T verdier indikerer høyere karakterutskrift hopetall.
Western blot-analyse.
i alt 40 ug av protein fra hver prøve ble separert på 12% SDS-polyakrylamidgel og elektrooverført til en polyvinylidenfluorid membran. Membranen ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk i PBS inneholdende 0,05% Tween (PBST) i 1 time. Etter vasking med PBST, ble membranen inkubert med en kanin monoklonalt antistoff mtTFA (1:100; Abcam, USA) over natten ved 4 ° C. Membranen ble vasket fire ganger og inkubert med pepperrotperoksydase konjugert sekundært antistoff (anti-kanin, 1:10,000, Santa Cruz, CA) i 1 time. Filmen ble utviklet av forsterket kjemiluminescens deteksjon system (ECL, BestBio Pharmacia Biotech). Nivåene av den konstitutive rengjøring genproduktet β-actin ble også målt som kontroll av lasting. Proteinet uttrykket ble kvantifisert og uttrykt i vilkårlige enheter (AU).
Immunohistochemistry.
Parafin-embedded deler av human lungevev ble deparaffinized og rehydrert med xylen og etanol. Antigen gjenfinning ble utført ved å bruke mikrobølge metoden med sitrat-buffer i 20 minutter. Avidin og biotin blokk ble utført, og endogen peroksidase ble stanset med 3% hydrogenperoksyd. Etter blokkering med 5% normalt geiteserum, ble et kanin-anti-humant antistoff mtTFA (1:100) (Abcam, USA) påføres over natten ved 4 ° C. Snittene ble vasket med PBS med 0,05% Tween og inkubert med biotinylert geit antikanin IgG (1:10,000, Santa Cruz, CA). Etter vasking, ble seksjonene farget med ABC Vectastatin reagenser (Wuhan BOOSTER Bioteknologi Corporation, Ltd) og DAB (Beijing Zhong Shan-Golden Bridge Bioteknologi Corporation). Seksjonene ble deretter scoret av en patolog blindt (antall mtTFA-positive endotelceller /100 endotelceller per sak) for mtTFA flekker i kapillærene, små /mellomstore arterier.
Bisulfite Sequencing PCR (BSP).
Genomisk DNA ble isolert fra lungevev ved hjelp av DNeasy DNA isolasjonskit (Qiagen, Valencia, CA), etterfulgt av EcoRI-fordøyelse. Bisulfite modifikasjon av genomisk DNA ble utført ved hjelp av EZ DNA Metylering-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA) etter produsentens anvisninger. I korthet, 1 ug av renset DNA (20 ul) ble inkubert i 130 ul CT Conversion reagens ved 98 ° C i 10 min og 64 ° C i 2,5 timer, noe som resulterer i omdannelse av unmethylated cytosines til uracil. Etter DNA-rensing ble bisulfitt-modifiserte DNA amplifisert ved anvendelse av PCR. Primerne ble utformet ved hjelp av den elektroniske program MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/): PCR-primere, 5′-TATTAGAATTTGTTAAATTTTGGGGAAT-3 «og 5′-ACAAACAATCCTACATCCAAAACC-3». PCR-betingelsene var som følger: 3 min ved 94 ° C; 35 sykluser på 30 sek ved 94 ° C, 30 sek ved 56 ° C, og 40 sekunder ved 72 ° C; og et forlengelsestrinn på 5 min ved 7 ° C. PCR-produktene ble renset ved hjelp av elektroforese på 1% agarosegeler (QIAquick gel ekstraksjon kit, Qiagen), gjenvinnes eller ved hjelp av etanolpresipitering, og deretter klonet ved anvendelse av ligering inn i pCR 2.1-TOPO kloning av vektorer med et TA-kloningssett (Takara, USA) fulgt ved hjelp av DH5a kompetente bakterier (menneskelig Key Laboratorium for medisinsk Epigenomics, Second Xiangya Hospital, Central-South University). Plasmid DNA isolert fra minst fem kloner for hver PCR-reaksjonsprodukt ble underkastet DNA-sekvensanalyse ved Shanghai Bioteknologiske Company. Sammenlignet med den opprinnelige genomiske mtTFA DNA-sekvens, ble metylering av CpG bestemt som vises uomdannede cytosines i CpG områdene i bisulfitt-modifiserte DNA.
Statistisk analyse.
Statistisk analyse ble utført med SPSS versjon 13.0. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SD. T testsammen forskjellen mellom gruppene. Lineær korrelasjonsanalyse ble utført ved bruk av Pearson produkt moment korrelasjoner. Forskjeller ble ansett statistisk signifikant hvis
P
. . 0,05
Resultater
Histologisk analyse av lunge vev
Den patologiske endringer i lungevevet
det var signifikante patologiske forskjeller mellom de ikke-KOLS-gruppen og KOLS-gruppen. Morfologien av lungevev var normalt i den ikke-KOLS gruppe. Alveolar septa var intakt, og det var lite inflammatorisk celleinfiltrasjon (figur 1A). Men i KOLS-gruppen, det var alvorlig inflammatorisk infiltrasjon i både luftveier og alveolene. Som vist i figur 1B, ble cilium defluxion og slimcelleformering observert i luftveiene, i mellomtiden ødeleggelse og vakuum, ble oppdaget i alveolene av KOLS-pasienter. Sammenlignet med ikke-kols gruppen, MLI og DI var signifikant høyere i KOLS-gruppen (MLI. 70 ± 23 mikrometer
vs
43 ± 6 mikrometer,
P
0,001; DI: 55 ± 4%
vs
16 ± 3%,
P
0,001)
photomicrographs av lungevev fra den ikke-KOLS gruppe (panel.. A) og KOLS-gruppen (panel B) (forstørrelse: 100 ×). Gjennomsnittlig lineære skjæringspunktet (MLI) og den destruktive indeks (DI) i KOLS gruppen var signifikant høyere i forhold til den ikke-KOLS gruppe (
P
0,001).
patologiske forandringer av lunge blodkar.
Den morfologi av pulmonal blodkar mellom de ikke-KOLS og KOLS-gruppene var annerledes. Lunge blodkar var normalt, og det var lite inflammatorisk celleinfiltrasjon i den ikke-KOLS-gruppen (Figur 2A). Men i COPD gruppe, beholderveggene var mye tykkere, særlig på glatt muskulatur lag. Lumen ble redusert som følge av økt tykkelse av vaskulær vegg i KOLS-gruppen (figur 2B).
photomicrographs av lunge fartøyer fra den ikke-KOLS (panel A) og KOLS-gruppen (panel B) (forstørrelse: 100 ×). Den histologiske presentasjon av pulmonal blodkar mellom KOLS-gruppen og ikke-kols gruppen var annerledes.
Den pulmonal vaskulær endotelial apoptose
apoptose av lunge vaskulære endotelceller i den ikke-kols og KOLS grupper ble analysert ved TUNEL assay. De apoptotiske positive celler ble farget i gul brun i TUNEL analysen. Den apoptotiske indeksen for lunge vaskulære endotelceller i KOLS gruppen var mye høyere enn i den ikke-KOLS gruppe (
P
0,001). (Figur 3 og Tabell 2)
positive celler ble farget i gul brun av TUNEL analysen. Mikrofotografier av TUNEL farget lungevev av den ikke-KOLS gruppe (panel A) og KOLS gruppen (panel B) (forstørrelse: 400 x). Antallet Tunel positive lunge vaskulære endotelceller i KOLS gruppen var mye høyere enn i den ikke-KOLS-gruppen.
Uttrykk for mtTFA mRNA og protein i lungevev fra ikke-kols og KOLS-pasienter
Lung vev
mtTFA
mRNA detektert ved RT-PCR og QRT-PCR.
Vi analyserte uttrykk for
mtTFA
mRNA i lunge vev ved semi-kvantitativ RT-PCR. Agarosegelelektroforese viste uttrykk for
mtTFA
mRNA i lungevev fra KOLS-pasienter var lavere i forhold til det fra de ikke-KOLS-pasienter (figur 4A). Videre er ekspresjon av
mtTFA
mRNA i lungevevet ble også bestemt ved QRT-PCR. Den relative mengden av
mtTFA
mRNA uttrykk i KOLS-pasienter var lavere enn i de ikke-KOLS-pasienter (KOLS-gruppen: 0,59 ± 0,07
vs
ikke KOLS-gruppen:. 0,78 ± 0,09,
P
. 0,001) (figur 4B)
uttrykk for lunge
mtTFA
mRNA målt ved RT-PCR (panel A). Linje 1, 2 og 3 var de ikke-KOLS-pasienter og linje 4, 5 og 6 var de KOLS-pasienter. Nivået av mtTFA mRNA i lungevev fra COPD gruppen var lavere sammenlignet med den ikke-KOLS gruppe. Uttrykk for lunge
mtTFA
mRNA målt ved QRT-PCR (panel B). Boksplott vise omfanget og fordelingen av data med de øvre, nedre kvartiler, og median av maksimal forskjell på
mtTFA
mRNA i den ikke-KOLS-gruppen og KOLS-gruppen. Median for hvert datasett er også indikert ved midtlinjen. Expression of mtTFA protein (panel C): Linje 1 og 2 var de ikke-KOLS-pasienter og linje 4 og 5 var de KOLS-pasienter. Kvantitativ analyse av proteintetthet er også vist (panel D).
Uttrykk av mtTFA protein av lungevev i ikke-KOLS og KOLS-pasienter.
neste målt uttrykk av mtTFA protein i lungevev ved Western blot. Den relative mtTFA protein uttrykk i KOLS gruppen var lavere enn i den ikke-KOLS-gruppen (KOLS: 0,32 ± 0,07
vs
ikke-KOLS. 0,55 ± 0,09,
P
0,001) (Figur 4C 4D). For ytterligere å karakterisere lokaliseringen av pulmonal mtTFA protein, ble immunhistokjemisk farging på lunge vevssnitt ved hjelp av et antistoff som er spesifikt for mtTFA utført. mtTFA protein ble hovedsakelig lokalisert i endotelceller i blodkar, og i samsvar med Western blot resultat av dets ekspresjon var lavere i KOLS gruppen sammenlignet med den ikke-KOLS gruppe (figur 5).
mtTFA protein ekspresjon av den ikke-KOLS gruppe (panel A) og KOLS gruppen (panel B) (forstørrelse: 400 x). mtTFA protein var gul brun i DAB farging. Når sammenlignet med ikke-KOLS-gruppen, et uttrykk for mtTFA protein var lavere i KOLS-gruppen.
Den metylering status for
mtTFA
promoter i lungevev av ikke-kols
vs
. KOLS-pasienter
Vi videre bestemmes status for
mtTFA
promoter metylering i lungevev fra den ikke-KOLS og KOLS pasient ved BSP og DNA sekvensanalyse.
mtTFA
arrangøren metylering mønster av lunge vev fra ikke-KOLS og KOLS-pasienter er vist i figur 6A og 6B. Prosentandelen av
mtTFA
promoter metylering (%) hos KOLS-pasienter var høyere sammenlignet med ikke-KOLS-pasienter (KOLS. 38,6 ± 14,7
vs
ikke-kols 27,8 ± 8,8;
P
. . 0,05) (figur 7)
modellen av mtTFA metylering av den ikke-KOLS gruppe (panel A) og KOLS-gruppen (panel B)
Skap tomter vise ytterpunktene, øvre og nedre kvartil, og median av maksimal forskjell i de ikke-KOLS og KOLS grupper. Medianen for hvert datasett er angitt med senter
P
verdien av metylering prosentandel av
mtTFA
arrangøren var 0,013 mellom de ikke-KOLS og KOLS-gruppen.
korrelasjonsanalyse
korrelasjonen analyse av endotelceller apoptose med lungefunksjon og røyking indeksen.
endotelceller apoptotiske indeksen ble negativt korrelert med FEV
1 /FVC (
r
= -0,796,
P
0,001) og FEV
1 /Pre (
r
= -0,827,
P
0,001) (Figur 8A 8B) og positivt korrelert med røyking indeks (
r
= 0,703,
P
0,001) (figur 8C)
scatterplot av korrelasjonsanalyse av endothelial. celle apoptotisk indeks og FEV
1 /FVC (
r
= -0,796,
P
0,001) (panel A). Den scatterplot av korrelasjon analyse av endotelceller apoptotisk indeks og FEV
1 /Pre (
r
= -0,827,
P
0,001) (panel B). Den scatterplot av korrelasjon analyse av endotelceller apoptotisk indeks og røyking indeks (
r
= 0,703,
P
0,001). (Panel C)
The korrelasjonsanalyse av lungevev mtTFA protein og FEV
1 /Pre, røyking indeks, endotelceller apoptotisk indeks.
Expression of mtTFA protein av lungevev var positivt korrelert med FEV
1 /Pre (
r
= 0,892,
P
0,001) (figur 9A), negativt korrelert med vaskulær endotelceller apoptotisk indeks (
r
= -0,749,
P
0,001) og røyking indeks (
r
= -0,763,
P
0,001) (Figur 9B . 9C)
scatterplot av korrelasjonsanalyse av lunge vev mtTFA protein og FEV
1 /Pre (
r
= 0,892,
P
0,001) (panel A). Den scatterplot av korrelasjon analyse av lungevev mtTFA protein og endotelceller apoptotisk indeks (
r
= -0,749,
P
0,001) (panel B). Den scatterplot av korrelasjon analyse av lungevev mtTFA protein og røyking indeks (
r
= -0,763,
P
0,001). (Panel C)
diskusjon
i denne studien fant vi at det vaskulære endotelceller apoptotisk indeks i KOLS-pasienter var mye høyere sammenlignet med ikke-KOLS-pasienter, og det var negativt korrelert med FEV
1 /Pre, men positivt korrelert med røyking indeks. Vi viste at 1) uttrykk for mtTFA mRNA og protein var lavere i lungevev hos KOLS-pasienter med plateepitel lungekreft i forhold til plateepitel lungekreft pasienter uten KOLS; 2) uttrykk for mTFA var positivt korrelert med vaskulær endotelceller apoptotiske indeksen; 3) men var negativt korrelert med sigarettrøyking indeksen. Vi fant også at andelen av
mtTFA
promoter metylering var høyere i KOLS gruppen sammenlignet med ikke-KOLS-gruppen.
KOLS er en ledende årsak til kronisk sykelighet og dødelighet over hele verden, og det har forårsaket en betydelig økonomisk og sosial byrde [23]. Mange mekanismer som er involvert i patogenesen av sykdommen. De inkluderer 1) inflammatorisk infiltrasjon; 2) ubalansen mellom proteolytisk og anti-proteolytisk aktivitet; 3) oksidativt stress; og 4) apoptose /proliferasjon ubalanse [3]. En av konsekvensene etter disse fremgangsmåter er cellulær apoptose, en kompleks og godt regulert prosess som fører til celledød. Nærvær av høyere apoptotisk nivå i den menneskelige lunge emphysematous er blitt rapportert [24], [25]. Det er blitt foreslått at epitel og endotel celle død på grunn av en nedgang i cellevedlikeholds faktorer kan være ansvarlig for utvikling av emfysem. I samsvar med dette begrepet, KOLS kan gjen produsert ved indusering av pulmonal endothelial apoptose i dyremodeller [26], [27]. I likhet med disse observasjonene, fant vi et økt antall apoptotiske lunge endotelceller i KOLS-pasienter i forhold til de ikke-KOLS-pasienter. Den apoptotiske indeksen ble positivt korrelert med FEV
1 /Pre, FEV
1 /FVC og røyking index [6], [28]. Disse resultatene indikerer at lunge endothelial apoptose kan spille en viktig rolle i patogenesen av KOLS.
mtTFA er en viktig faktor som regulerer mitokondrie biogenesis. Den aktiverer transkripsjon og replikasjon av mtDNA [29]. Det spiller en meget viktig rolle i reguleringen av mitokondriell respirasjon, anti-oksidativt stress og celle-apoptose. Forrige studie av Remels et al [11] foreslått at mtTFA kan være involvert i patogenesen av KOLS. Vi fant at uttrykket av mtTFA mRNA og protein ble redusert i de lunge vev fra KOLS-pasienter sammenlignet med ikke-KOLS-pasienter. Uttrykket av mtTFA var positivt korrelert med FEV
1 /Pre og FEV
1 /FVC, og negativt korrelert med røyking indeksen og vaskulære endotelceller apoptotisk indeks. I samsvar med tidligere observasjoner, tyder våre resultater også en rolle mtTFA i apoptose av pulmonale endotelceller og i patogenesen av COPD. Imidlertid er de underliggende mekanismer som er ansvarlig for denne dårlig forstått. Det er vist at epigenetikk kan spille en viktig rolle i patogenesen av enkelte luftveissykdommer som astma og COPD [13]. Interessant, fant vi at andelen av
mtTFA
promoter metylering i lungevev av squamous celle lungekreft pasienter med KOLS er mye høyere i forhold til plateepitel lungekreft pasienter uten KOLS, noe som tyder epigenetisk regulering kan være ansvarlig for uttrykk for mtTFA.
KOLS og lungekreft er begge viktigste årsakene til sykelighet og dødelighet på verdensbasis. De deler en felles miljørisiko i sigarettrøyk eksponering og en genetisk predisposisjon. Risikoen for lungekreft hos pasienter med KOLS har blitt foreslått i over 30 år [30], og selv om tobakk eksponeringen som en viktig confounding variabel, foreligger en uavhengig forening sannsynlig. Punturieri et al [31] har foreslått at lungekreft og kols kan være to sider av samme sak. Fordi DNA-metylering, histon deacetylering, og protein-fosforylering er involvert i patogenesen av lungekreft [32] – [34], er det foreslått at epigenetiske modifikasjoner kan også attributt til patogenesen av COPD, enten alene eller når den er assosiert med lungekreft [ ,,,0],35], [36]. Demeo et al [14] fant at DNA metylering status på distinkt CpG loci var assosiert med både tilstedeværelse og alvorlighetsgrad av KOLS og lungefunksjonen, noe som tyder på at DNA metylering kan være en biomarkør av KOLS, og kan markere nye veier av KOLS patogenesen.
Aberrant metylering av promotorområdet av onkogener og tumorsuppressorgener spiller en viktig rolle i patogenesen av lungekreft og metylering status er nært knyttet til røyking [37], [38]. Det er mange kreftfremkallende i tobakksrøyk. I tillegg er tobakksrøyk en slimhinneirritasjonsmoment som forårsaker inflammasjon, noe som resulterer i genereringen av oksygen-frie radikaler. Videre øker røyking aktiviteten av DNA metyltransferase [39] som driver
de novo
hypermethylation av mottakelige loci [40]. Disse direkte eller indirekte vekselvirkninger kan være involvert i den forbedrede DNA metylering i storrøykere. To nyere studier rapportert molekylære forandringer i spontan oppspytt av kreftfrie storrøykere [41], [42]. Selv det er ulike meninger om effekten av røyk på DNA metylering [43] – [45].
