Abstract
Mange epiteliale kreftformer, spesielt mage-tarmkanalen kreft, er fortsatt dårlig prognose sykdommer, på grunn av motstand mot kjemoterapi og lokal eller metastatisk tilbakefall. Vi har tidligere vist at apoptose inkompetente esophageal kreftceller indusere autophagy som respons på kjemoterapeutiske midler, og dette kan lette deres gjenvinning. Imidlertid kjente farmakologiske inhibitorer av autofagi kunne ikke forbedre cytotoksisitet. I denne studien har vi undersøkt to godt kjente, klinisk godkjent autofagi indusere rapamycin og litium, for deres virkninger på kjemosensitivitet i apoptose inkompetente kreftceller. Både litium og rapamycin ble vist å indusere autophagosomes i spiserøret og kolorektal kreft celler ved western blot analyse av LC3 isoformer, morfologi og FACS kvantifisering av Cyto-ID eller mCherry-GFP-LC3. Analyse av autophagic flux indikerer ineffektiv autophagosome behandling i litium behandlet celler, mens rapamycin behandlede celler viste effektiv forandring. Levedyktighet og gjenvinning ble bestemt ved klonogene analyser. Når den kombineres med det kjemoterapeutiske middel 5-fluoruracil, rapamycin var beskyttende. I motsetning til dette, litium viste sterk forbedring av ikke-apoptotisk celledød. Kombinasjonen av litium og 5-fluorouracil eller oksaliplatin ble deretter testet i syngeniske mus (Balb /c) colorectal cancer modell-CT26. Når enten kjemoterapeutisk middel ble kombinert med litium en signifikant reduksjon i tumorvolumet ble oppnådd. I tillegg ble overlevelses dramatisk økt i kombinasjonsgruppen (p 0,0001), med 50% av dyrene oppnå langsiktig kur uten re-forekomsten ( 1 år svulst gratis). Således kan kombinasjonsbehandling med litium vesentlig forbedre effektiviteten av kjemoterapeutiske midler i apoptose mangelfulle kreftceller. Induksjon av kompromittert autofagi kan bidra til dette cytotoksisitet
Citation. O’Donovan TR, Rajendran S, O’Reilly S, O’Sullivan GC, McKenna SL (2015) Litium modulerer autofagi i Esophageal og tykktarmskreftceller og Forbedrer effekten av Terapeutiske midler
In vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 10 (8): e0134676. doi: 10,1371 /journal.pone.0134676
Redaktør: Ilya Ulasov, svensk Neuroscience Institute, UNITED STATES
mottatt: 28 april 2015; Godkjent: 13 juli 2015; Publisert: 6. august 2015
Copyright: © 2015 O’Donovan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. det ble gitt av Helseforsk HRA_POR /2011/55
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Macro-autofagi er en evolusjonær bevart katabolsk prosess der en celle resirkulerer sine egne makromolekyler og organeller. Intra-cellemateriale blir innlemmet i doble membraned vesikler betegnes autophagosomes, som deretter trafikkerte til lysosome for degradering. Autofagi har nå dukket opp som en viktig prosess, som kan modulere tumorigenesis og effekten av behandlingen. Det kan være tumorundertrykkende som det fjerner skadede organeller og opprettholder integriteten til en celle under stress. Imidlertid, når en tumor er etablert, autophagy har vist seg å være en viktig overlevelsesreaksjonsveien som det beskytter mot en rekke forskjellige spenninger inkludert, hypoksi, metabolsk stress, anoikis og kjemoterapi [1]. I tillegg er det overdreven autophagy blitt rapportert å indusere Type II celledød som er et kritisk celledød bane og et mål for terapeutisk intervensjon, spesielt i tumorer som har mistet apoptose kompetanse [2] [3]. Autophagy er derfor en adaptiv respons som oppviser en høy grad av plastisitet, og har de kontekstavhengige roller i tumorcellebiologi. Det er fortsatt uklart hvordan best å modulere det for terapeutisk gevinst.
Vi har tidligere vist betydningen av autofagi i terapeutisk motstand i spiserørskreft. Vi undersøkte cellulære responser i uselekterte esophageal kreft cellelinjer som behandles med kjemoterapi (5-fluorouracil og cisplatin). Narkotika sensitive celler er apoptose kompetent og ikke komme seg etter seponering av medikamentet. I kontrast, mer resistente celler ikke klarte å indusere apoptose, men oppviste autophagy. Noen av disse cellene gjennomgikk en Type II-lignende dødsprosessen, men mange gjenfunnet etter seponering av medikamentet. Knockdown av autofagi regulatorer bekreftet viktigheten av autofagi for utvinning [4]. Dette bidraget av autofagi til kreft celle overlevelse er en stor utfordring i kjemoterapi. Gitt at mange primære kreft og trolig mest tilbakevendende kreft er mangelfull i apoptose signalering, må vi undersøke nye strategier for å begrense autophagic overlevelse og /eller indusere alternative celledød mekanismene.
Som autofagi har blitt rapportert å ha potensielt motstrid roller i svulstutvikling, er to terapeutiske strategier for tiden blir testet i kliniske studier. En strategi er å inhibere den cyto-beskyttende rolle autophagy, kombinert med konvensjonelle anti-kreft medikamenter for å sensitivisere kjemoresistent tumorceller til legemidler; den andre er å aktivere autophagic trasé og kjøre de apoptose-defekte tumorceller for å gjennomgå en annen eller «autophagic «celledød [5]. Autofagi indusere i kliniske studier inkluderer; mTOR-hemmere (inkludert rapamycin analoger, everolimus, teserolimus) og autofagi hemming er først og fremst å være målrettet med lysosomale hemmere klorokin eller hydroksyklorokin [1]. Et stort problem med begge strategiene er at autofagi veier er fortsatt dårlig forstått, som er den måten som bestemte kreftformer bruker dem. Vi har bare nylig begynt å forstå den høye grad av selektivitet i de forskjellige typer av autofagi og signalering er involvert. For mange av de aktuelle studiene, vil det være vanskelig å avgjøre hvilken rolle autophagy i suksess eller fiasko av regimet, som pålitelige molekylære markører for autophagic svar ikke er etablert. I tillegg, innenfor begrensede repertoar av hemmere og indusere, er det agenter med distinkte forskjeller i deres virkningsmekanismer (med mest å være indirekte hemmere /aktivatorer) og data er usannsynlig å være overførbar fra en autofagi inhibitor og /eller induser til en annen. Videre studier er derfor nødvendig for å bedre forstå handlingene til autofagi modulatorer i kreftceller.
I vår forrige undersøkelse, vi testet autofagi hemmere (3-MA og bafilomycin) for chemosentizing effekter i esophageal kreftceller. Ingen av disse agentene var effektiv som chemosensitizers [4]. Her undersøker vi effekten av to godt kjent, men mechanistically ulike autofagi indusere rapamycin og litium, på kjemosensitivitet i kreftceller. Begge disse legemidlene (eller deres analoger) er lisensiert for klinisk bruk. Vi viser at både agenter indusere autofagi i kreftceller. Rapamycin ikke forbedre stoffet følsomhet, mens litium viser sterk forbedring av toksisitet med
in vitro Hotell og
in vivo
modeller av gastrointestinale kreftformer.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC og reagenser
Etablert menneske esophageal kreft cellelinjer OE19, OE21 og OE33 ble hentet direkte fra den europeiske Innsamling av cellekulturer. KYSE450 celler var fra DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). Murine colon carcinoma cellelinje CT26 ble oppnådd direkte fra American Type Culture Collection (ATCC). OE19, OE21 og OE33 cellelinjer ble holdt i RPMI 1640 medium (Sigma R8758), ble KYSE450 cellene holdt i RPMI 1640 50:50: F-12 HAMS medium (Sigma N6658), og CT26 celler ble holdt i DMEM-medium (Sigma D6429 ). Alle kulturene ble supplementert med 1% penicillin /streptomycin (Gibco Life Technologies 15070-063), 10% (v /v) føtalt kalveserum (Sigma F7524) ved 37 ° C, 5% CO
2. Alle reagenser ble anskaffet fra Sigma, med mindre annet er angitt. Lithium chloride L9650, litiumkarbonat 255823, rapamycin R8781, 5-fluorouracil (5-FU) F6627, klorokin C66288. Oksaliplatin (Eloxatin 5mg /ml) var fra Sanofi Aventis.
Cyto-ID Autophagy deteksjon
Celler ble sådd i tre eksemplarer (3,0 x 10
4 celler /cm
2) og behandlet med litium (10-30 mM) eller rapamycin (100-300 nM) alene eller i kombinasjon med klorokin (10 uM) i 24 og 48 timer i brønner i en 6 brønners plate. Cellene ble høstet med trypsin og forberedt i henhold til produsentens instruksjoner. Den Cyto-ID assay (Enzo biovitenskap ENZ-51031-K200) har en 488 nm-hissige grønn fluorescerende deteksjonsreagensen som spesifikt fluoresces i autophagic blemmer. En økning i antall autophagic vesikler, som beis grønn registreres som en økning i fluorescens i FL-1 kanal. Celler ble inkubert i Cyto-ID (1 ul Cyto-ID /1 ml cellekulturmedium uten fenolrødt indikator) i 30 minutter og vasket før analyse ved strømningscytometri FACScan.
Western blotting og antistoffer
Totale celleproteinekstrakter ble fremstilt ved å skrape cellene inn i modifisert RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% natriumdeoksykolat, 1% Igepal, 1 mM EDTA, 1 x Pefabloc, 1x protease inhibitor cocktail , 1 mM Na
3VO
4, 1 mM NaF). Alle proteinprøver ble separert på NuPAGE 4-12% Bis-Tris geler og elektro overført til PVDF membran (Invitrogen Livet Technologies NP0322 og IB401001). Membraner ble inkubert med anti-LC3 (polyklonale kanin antistoff-MBL PD014, 1: 500 fortynning), anti-LAMP 1 (monoklonalt antistoff fra mus-Abcam ab25245, 1: 5000 fortynning), anti-LAMP 2 (polyklonale kanin antistoff-Abcam ab101325 , 1: 500 fortynning) eller anti-cathepsin B (mus monoklonalt antistoff-Abcam ab58802, 1: 500 fortynning) antistoff over natten ved 4 ° C og med anti-β-aktin (lasting kontroll) (Sigma A5441) i én time ved værelses temperatur. Proteinene ble visualisert ved hjelp av relevante IR-Dye konjugerte sekundære antistoffer (Rockland) på Odyssey IR imaging system (Li-Cor, Cambridge, Storbritannia).
Evaluering av morfologi
For å undersøke cellemorfologi , behandlede celler ble cytospun på glassplater og farget ved hjelp av Pro-Diff (Braidwood Laboratories BAPROD1 -Fast og farget med bufret eosin fulgt av metyl thionins). Apoptotisk celledød er karakterisert ved tilstedeværelsen av to eller flere av de følgende morfologiske egenskaper: celle krymping, kromatin kondensasjonsprodukter, DNA nedbrytning og fragmentering inn i «apoptotiske legemer «, innenfor et intakt plasmamembranen. Ikke-apoptotisk celledød ble identifisert ved tydelig tap av cytoplasmatisk materiale, pyknosis av kjernen og et intakt kjernemembranen. Cytospin bilder er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Bilder ble tatt med en DP70 digitalt mikroskop kamera og Olympus DP-Soft823 versjon 3.2 software (Mason Technologies Dublin, Irland). Alle bilder er representative for minst tre separate forsøk.
kolonidannelse assay
Evnen av celler for å komme seg fra behandlinger og danner kolonier som et monolag ble vurdert ved anvendelse av en kolonidannelsesbestemmelsen. Etter behandling ble alle adherente celler trypsinert, telles og levedyktigheten bestemt. Av de levedyktige celler, ble 1500 celler sådd på nytt inn i en brønn i en seks-brønns plate (in triplo). Celler ble tillatt å vokse holde og for mellom 10 til 14 dager. For å visualisere kolonier, ble mediet fjernet, cellene ble fiksert i 96% etanol i 10 minutter og farget med Prodiff oppløsning C (Braidwood Laboratories E310). Platene ble skannet med Odyssey IR imaging system (Li-Cor, Cambridge, Storbritannia) og kolonier kvantifisert. Resultatene er presentert som integrerte intensiteten ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. Når koloni tallene var svært lav, ble kolonier manuelt telles.
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B uttrykk
Celler ble transfektert med 1 mikrogram av pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B uttrykk plasmid (Addgene 22418) med TurboFect transfeksjon reagens (ThermoScientific R0531) som anbefalt av produsentene. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med litium (20-30 mM) eller rapamycin (200-300 nM) alene eller i kombinasjon med klorokin (10 uM) i 24 og 48 timer. For å vurdere nivåer av uttrykk for mCherry-EGFP-LC3 ble cellene analysert gjennom PE og 488 to kanaler med en BD LSRII flowcytometer (BD Bioscience, Oxford, Storbritannia). Mean fluorescens intensitet ble målt og data er presentert som gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter.
Dyr og tumorinduksjon
Alle dyreforsøk ble godkjent av dyreetikk Eksperimentering Committee (AEEC) ved University College Cork og Department of Health (Ethics nummer 2010/009), i henhold til retningslinjer fastsatt av europeiske fellesskap (Endring av grusomhet mot dyr handle 1876) regulering 2002 2005 (lisensnummer B100 /4499). Musene ble hentet fra Harlan Laboratories (Oxfordshire, England). De ble opprettholdt i patogenfrie forhold, ved en konstant romtemperatur (22 ° C) med en naturlig dag /natt lys syklus på konvensjonell dyr koloni. Standard laboratorie mat og vann ble gitt
ad libitum
. Før eksperimentene ble musene gis en tilpasningsperiode på minst 14 dager. BALB /c-mus av 6-8 uker gamle, med vekt på 18-22 g ble anvendt i alle forsøk. For rutine svulst induksjon, 1 × 10
6 CT26 (tykktarmskreft) celler suspendert i 200 ul serumfritt DMEM ble injisert subkutant i høyre flanke, etter anestesi (ip (IP) administrering av 200 mikrogram xylazin og 2 mg ketamin ). Alle mus ble avlivet ved halshugging etter overdose av anestesi.
In vivo
litiumkonsentrasjonen
Lithium-konsentrasjoner ble valgt basert på tidligere
in vivo
studier som er fokusert på nevrologiske undersøkelser. I studier på mennesker, har 0,6-0,8 mmol /L (mmol /L) er etablert som en trygg terapeutisk dose hos pasienter på lang sikt litium. Bivirkninger kan oppstå på nivåer under 1,5 mmol /L. Milde til moderate bivirkninger kan oppstå fra 1,5 til 2,5 mmol /L, og moderat til alvorlige reaksjoner kan sees på nivåer av 2,0 mmol /L og over [6]. Vi kan oppnå chemosensitization
in vitro
litiumnivåer lik 1,6 mmol /L-dette er i den øvre enden av skalaen for mennesker. Med hensyn til dyrestudier følgende konsentrasjonsområdet har tidligere blitt anvendt en sikker måte (60, 80, 100 og 250 mg /kg) [7-10]. I en studie som brukes sammenlignbare litiumkonsentrasjon som de som brukes i dette arbeidet, var plasmanivåer av litium rapportert å være 0,25 mM [11]. Dette er lavere enn det terapeutiske området hos mennesker (0,5-2,0). Vi satset på 200 mg /kg, etter en titrering for å vurdere toksisitet. Som lovende effekter ble oppnådd hos dyr ved denne konsentrasjon, uten toksisitet-vi ikke ytterligere å øke denne konsentrasjonen.
In vivo
medikamentavgivelse
Mus ble tilfeldig delt inn i eksperimentelle grupper. Mus ble behandlet ved et tumorvolum på ca. 100 mm
3 i volum (5-7 mm større diameter). Alle behandlingene ble levert i 50ul volum som er oppgitt enten direkte inn i svulsten, eller via IP-injeksjon hver tredje dag. Behandlingsgruppene var som følger; PBS (kontroll), litiumklorid (200 mg /kg) 5-FU (20 mg /kg), oksaliplatin (10 mg /kg) og kombinasjoner av enten litium og 5-FU (200 mg /kg, 20 mg /kg ) eller litium og oxaliplatin (200 mg /kg, 10 mg /kg). Litium ble rekonstituert i sterilt fosfatbufret saltvann. Fluorouracil ble levert av Hospira Irland (25 mg /ml injeksjonsvæske, oppløsning). Oksaliplatin ble levert av Sanofi-Irland (5 mg /ml). Alle legemidler ble injisert ved hjelp av aseptisk teknikk for å unngå forurensning. Etter behandling, ble svulster overvåket av alternative dag målinger i to dimensjoner, ved hjelp av Vernier kalipere. Tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen V = ab
2ᴨ /6, hvor «a» er den lengste diameter av tumoren og «b» er den lengste diameter vinkelrett på diameteren «a». Dyrene ble avlivet når tumorvolumer skredet ~ 500/600 mm
3 (ikke større enn 15 mm i diameter). Toksisitet av litium
in vivo
ble testet ved å undersøke plasmanivået av natrium, kalium og kreatinin i alle behandlingsgrupper, 24 timer etter siste behandling av en tre ukers studie. Det var ingen forskjell i nivåene av natrium, kalium eller kreatinin i noen av behandlingsgruppene (PBS-kontroll, litium, 5-FU 5-FU 0,01, *** p 0,0001. Median overlevelse av hver prøve gruppe ble også vurdert. Student t-test (uparede) ble brukt for å vurdere betydningen av midlere tumorvolum på den siste dag av behandlingen. ** P 0.005.
Resultater
Evaluering av effekter av litium og rapamycin på autofagi induksjon i KYSE450 esophageal celler
Vi har tidligere ansatt fire esophageal cellelinjer for å undersøke konsekvensene av apoptotiske og autophagic respons på medikamentell behandling [4]. To cellelinjer (OE21 og OE33) ble vist å være apoptose og autofagi kompetent og er relativt narkotika sensitive. I motsetning til to cellelinjer (KYSE450 og OE19) som reagerer med autofagi alene er mer resistente og kan gjenopprette følgende seponering. De sistnevnte to cellelinjer er av spesiell interesse da de sannsynligvis vil være mer representativ for tumorer som har mistet apoptose kompetanse. Vi vurderte derfor effektene av to mekanistisk distinkte autofagi indusere, i første omgang på KYSE450 cellene.
Rapamycin er en kjent mTOR-hemmer [12], mens litium er rapportert å indusere autofagi ved å hemme inositol monophosphatase (IMPase) [ ,,,0],1. 3]. Vi bekreftet at både litium (lithium klorid med mindre annet er oppgitt) og rapamycin indusert autofagi i KYSE450 celler ved hjelp av Cyto-ID autofagi deteksjon analyse, vurdering av LC3 I og II isoformer av western blotting og ved morfologisk vurdering av vesikkel akkumulering.
Økt Cyto-ID fluorescens angitt autophagosome dannelse i litium (10, 20 og 30 mM) og rapamycin (100, 200 og 300 nM) behandlede celler, ved 24 timer [fig 1A (i) og (ii)] hhv. Litium-indusert autofagi var mer uttalt enn den som fremkalles av rapamycin med en 9,2-gangers økning observert mellom kontroll og 30 mM litium behandlede celler, sammenlignet med 4,8 gangers økning indusert ved den høyere konsentrasjon av rapamycin. Dataene er vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. Etter 48 timer med behandling, ble Cyto-ID påviselig autofagi redusert i litium behandlet celler (2,3 ganger økning observert mellom kontroll og 30 mm behandlede celler) og umulig å oppdage i rapamycin behandlede celler (data ikke vist).
(A) KYSE450 celler ble behandlet med litiumklorid (litium) (10-30 mM) eller rapamycin (100-300 nM) i 24 og 48 timer. Celler ble vurdert for autofagi induksjon 24 timer etter behandling med litium (i) eller rapamycin (ii) med den Cyto-ID autofagi deteksjon kit. Paneler til venstre viser representative bilder av FACS analyse, med paneler til høyre viser tilsvarende gjennomsnittlig fluorescens intensitet. Dataene som vises her er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Western blot-analyse av LC3 ekspresjon i celler behandlet med litium (i) eller rapamycin (ii) i 24 timer. LC3I og LC3II båndene ble kvantifisert ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System (Li-COR), normalisert til p-aktin og presenteres som integrerte intensiteter. (C) Morfologiske trekk ved KYSE450 celler etter litium (30 mM, midtre panel) eller rapamycin (300 nM, hånd høyre panel) behandling i 24 timer. Svarte piler indikerer opphopning av vesikler i både litium og rapamycin behandlede celler, røde pilene betegne perifer vesikkel akkumulering (Forstørrelse 40x). (D) Celler ble forbehandlet med klorokin (10 uM) i to timer, før behandling med litium (10 mM) (i) eller rapamycin (100 nM) (ii) i 48 timer og Autophagy nivåer måles med den Cyto-ID autophagy deteksjon kit. Representative bilder av FACS-analyse er vist (n = 3), med innfelte søylediagrammer som viser tilsvarende midlere fluorescensintensitet (* p 0,05). E Levedyktige celler etter behandling med enten litium eller rapamycin i 48 timer ble tellet og et likt antall (1500 celler per brønn) reseeded in triplo, i fravær av medikament. Celler ble tillatt å vokse i 14 dager, deretter ble fiksert og farget og koloniveksten bedømt.
Western blot-analyse bekreftet en økning i nivåene av både LC3 I og II etter 24 timers behandling med litium [ ,,,0],fig 1B (i)], en effekt som ble opprettholdt i opp til 48 timer (data ikke vist). Nivåene av LC3 II ble også signifikant økt med rapamycin i 24 timer [figur 1B (ii)], og ble delvis redusert 48 timer etter behandling (data ikke vist).
Morfologisk analyse av KYSE450 celler bekreftet akkumulering av blemmer i cytoplasma av celler behandlet med litium (30 mM) (figur 1C, midtre panel) og rapamycin (300 nM) (figur 1C panel, til høyre) i 48 timer (også åpenbar etter 24 timer, data ikke vist). Pilene viser celler med betydelig vesikkel akkumulering. Lithium behandlede celler utstilt omfattende perifer vesikkel akkumulering (røde piler).
autophagic fluks er betegnelsen som brukes for å beskrive hele prosessen med autofagi, inkludert levering av sequestered komponenter til lysosome og deres påfølgende sammenbrudd [14]. Ved akkumulering av autophagosomes er utelukkende på grunn av en svikt i cellene for å omsetnings autophagosomes, tilsetning av klorokin-en lysosomotropic middel som hemmer aktivitet lysosomale og blokkene autophagosome omsetningen [15], vil ikke ha noen ytterligere innvirkning på vesikkel-akkumulering. Derfor, for å skille mellom autofagi induksjon og vesikkel-akkumulering på grunn av en svikt i omsetningen, vi pre-behandlede cellene med klorokin (10 pM) før behandling med enten litium (10 mM) eller rapamycin (100 nM) i 48 timer. Som vist i figur 1D, behandling av KYSE450 celler med klorokin alene, som forventet, har medført en økning i akkumulering av vesikler (grønne overlegg) som vurderes av Cyto-ID. Litium alene, forårsaket en betydelig økning i vesikkel-akkumulering, som ble forsterket, selv om det ikke er vesentlig, ved klorokin (blå overlay), som tyder på bare moderat forandring. I motsetning til dette, rapamycin alene førte til en mer beskjeden endring i detekterbare autophagosomes. Tilsetningen av klorokin, betydelig øket nivå av vesikler (* p = 0,0136) (blå overlay), som indikerer autophagosome induksjon og omsetning (fluks) som svar på rapamycin.
Viktigere, induksjon av autophagy inntil 48 timer i respons til litium eller rapamycin alene, på en rekke konsentrasjoner, hadde en begrenset effekt på levedyktighet som vurdert av kolonidannelse analysen (figur 1E). Noen toksisitet med litium er tydelig over 20 mm. Til sammen indikerer disse data at begge forbindelser kan indusere forholdsvis ikke-toksiske akkumulering av autophagosomes i disse esophageal kreftceller.
Vurdering av effekten av rapamycin og litium på kjemosensitivitet
Vi evaluerte deretter effektene for å kombinere rapamycin eller litium med 5-FU på følsomheten til esophageal cellelinjer. Autophagy induksjon av 5-FU i KYSE450 cellene ble tidligere demonstrert av GFP-LC3, elektronmikroskopi, og western blot analyse av LC3II [4]. Autophagic forandring, indusert av 5-fluorouracil (5-FU) har også blitt tatt med her, viser en forbedring av vesikkel akkumulering med klorokin (S1 Fig blått overlay).
KYSE450 celler ble behandlet med 30 mM litiumklorid 300 nM rapamycin, 40 uM 5-FU eller en kombinasjon av autophagy inducer og 5-FU i opptil 48 timer. Et likt antall levedyktige celler fra hver behandlingsgruppe ble sådd følgende behandling og inkubert i opptil to uker, i fravær av medikament. Koloniene som utvikles er vist i figur 2A. Kolonier ble sjelden i KYSE450 celler behandlet med kombinasjonen av 5-FU og litium, med en 11,9 gangers nedgang i antall kolonier utvinne fra litium 5-FU-behandlede celler sammenlignet med 5-FU alene [Fig 2A (ii)].
KYSE450-celler ble behandlet med litiumklorid (litium) (30 mM) eller rapamycin (300 nM) alene eller i kombinasjon med 5-fluorouracil (5-FU) (40 uM) i 48 timer. (A) Levedyktige celler etter behandling med enten litium (i) eller rapamycin (ii) alene eller i kombinasjon med 5-FU i 48 timer ble tellet og like tall reseeded i triplikat, i fravær av medikament. Cellene fikk vokse i 14 dager, deretter ble fiksert og farget og kolonier kvantifisert ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging System (Li-COR). Dataene er presentert grafisk som gjennomsnitt +/- SEM av tre uavhengige eksperimenter.
Stjernene
indikerer en betydelig forskjell i antall kolonier dannet i kombinasjon behandlede celler sammenlignet med monoterapi behandlede celler (*** p 0,0005, ** p 0,005) (uparet
t
-test). (B) Morfologiske trekk ved KYSE450-celler ble undersøkt etter behandling i 48 timer. Panelene til venstre viser morfologien indusert som reaksjon på litium eller rapamycin alene, paneler til høyre viser morfologi med tillegg av 5-FU. Piler indikerer akkumulering av autophagic vesikler i litium, rapamycin, 5-FU og kombinasjons behandlede celler. CD betegner nærværet av en ikke-apoptotisk celledød morfologi (forstørrelse 40x).
Morfologisk analyse viste at mens litium alene forårsaket en opphopning av cytoplasmatiske vesikler (midten til venstre panel, piler), var det en betydelig økning i antall celler viser egenskaper av ikke-apoptotisk celledød (CD) i litium-amp; 5-FU behandlede celler (høyre sentrum panel, CD). Rapamycin alene eller i kombinasjon med 5-FU, forårsaket en opphopning av cytoplasmatiske vesikler (piler), som ikke var knyttet til utvikling av celledød morfologi (fig 2B lavere paneler).
For å bekrefte at denne effekten var hverken cellelinje eller 5-FU spesifikke, vi bekreftet kjemosensibiliserende effekten av litium i en ytterligere legemiddelresistente /apoptose inkompetent spiserørskreft cellelinje (OE19) og i kombinasjon med et ytterligere kjemoterapeutisk medikament-cisplatin (S2 figur), som vi tidligere hadde bekreftet å være en induktor av autofagi i disse cellene [4]
sammen er disse funnene fremheve at selv om både litium og rapamycin kan modulere autofagi, de har motstander aktivitet i kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel.; litium fungerer som en kraftig chemosensitizer mens rapamycin er beskyttende.
Vi vurderte også effekten av kombinasjonsbehandlinger i apoptose kompetente esophageal cellelinjer. Det er viktig at disse midler ikke ville forstyrre apoptose og redusere medikamentsensitivitet. Kombinasjonen av litium eller rapamycin med 5-FU forbedret autofagi og apoptose i begge OE21 (S3 figur) og OE33 (data ikke vist) celler, som var tydelig ved morfologi [S3A (i) S3b (i) Fig]. Begge kombinasjonsbehandlinger også redusert levedyktighet som bestemt ved MTT-analyse [S3A (ii) S3b (ii) Fig].
er en rekke av litiumsalter anvendes som stemningsstabiliserende midler, med litiumkarbonat mest foreskrevet på grunn av lavere toksisitet. For å bekrefte at effekten av litium på autofagi og chemosensitization ikke var begrenset til lithium klorid, behandlet vi KYSE450 celler med et utvalg av litiumkarbonat konsentrasjoner (10-20 mm). Data presentert i S4 figur viser at litiumkarbonat indusert økt uttrykk av LC3 II på western blot (S4A Fig baner 2,3 4). Immunfluorescens farging for LC3 (S4B Fig sentrale panel) indikerte også en slående akkumulering av cytoplasmatiske vesikler ved konsentrasjoner så lave som 10 mM, med en fordelingsmønster som ligner den som ble observert i litiumklorid behandlede celler (panel S4C Fig høyre). Når det kombineres med 5-FU, litiumkarbonat indusert samme celledød morfologi (CD, nedre høyre paneler) som de som ble observert i litium chloride behandlede celler. Viktigere, litiumkarbonat induserer også lignende chemosensitization med 5-FU (40 uM) i KYSE450 celler, særlig ved de lavere konsentrasjoner på 10 og 15 mm (Fig S4D). Sammen disse funnene understreker den viktige rollen av litium ion som en autofagi modulator og sin tilknytning til forbedring av celledød i kombinasjonsbehandling.
Mekanisme cytotoksisitet
Tidligere studier har antydet at endringer i autophagic flux, som fører til en overdreven opphopning av autophagosomes kan slå autofagi inn i en destruktiv prosess [16]. Våre innledende studier med Cyto-ID-analysen viste at litium påvirket autophagosome omsetning (figur 1). Vi har derfor sett for ytterligere bevis på nedstrøms forskjeller i autophagosome behandling som kan forklare muligheten av litium til chemosensitize esophageal celler.
Vi sammenlignet nivået av forandring i litium og rapamycin behandlet celler ved hjelp av fusjonsproteinet (mCherry- GFP-LC3) i KYSE450 celler, kvantifisere både grønn og rød fluorescens ved strømningscytometri, med to separate lasere for å eliminere eventuelle krav kompensasjon.
