Abstract
Tumor stamceller representerer en populasjon av resistente celler som kan overleve konvensjonell kjemoterapi og føre til tumor tilbakefall. Men lite er kjent om rollen tumor stamceller i prostata kreft metastasering. De her rapporterte studier viser at den CXCR4 /CXCL12 akse, en viktig regulator av tumorspredning, spiller en rolle i opprettholdelsen av prostatakreft stilk-lignende celler. Den CXCL4 /CXCR12 pathway er aktivert i CD44
+ /CD133
+ prostata stamfar befolkning og påvirker differensiering potensial, celle adhesjon, klonal vekst og tumorigenicity. Videre prostata tumor xenograft studier i mus har vist at en kombinasjon av de CXCR4 reseptorantagonist AMD3100, som retter seg mot prostatakreft stilk-lignende celler, og den konvensjonelle kjemoterapeutisk middel Taxotere, som retter seg mot hoveddelen svulsten, er betydelig mer effektiv i å utrydde tumorer sammenlignet til monoterapi
Citation. Dubrovska A, Elliott J, Salamone RJ, Telegeev GD, Stakhovsky AE, Schepotin IB, et al. (2012) CXCR4 uttrykk på Prostate Cancer stamceller. PLoS ONE 7 (2): e31226. doi: 10,1371 /journal.pone.0031226
Redaktør: Diane Renee Bielenberg, Barnesykehuset Harvard Medical School, USA
mottatt: 30 august 2011; Godkjent: 04.01.2012; Publisert: 16 februar 2012
Copyright: © 2012 Dubrovska et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Susan G. Komen for Cure Grant PDF0707903 (AD). Dette arbeidet ble støttet av Novartis Research Foundation og The Skaggs Institute for Chemical Biology. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostata kreft er den nest vanligste årsaken til kreftdød i menn. De fleste prostata kreft er hormonavhengig og svare på androgen ablasjon terapi. Imidlertid er ablasjon ikke kurativ for metastatisk prostatakreft, fordi disse tumorene slutt bli hormon ildfast og vokse til tross for androgen ablasjon, selv om initial behandling først på vellykket [1], [2]. Kjemoterapiregimer som inneholder stoffet docetaxel (Taxotere) forlenge median overlevelse etter to til tre måneder hos pasienter med avansert prostatakreft som ikke lenger reagerer på hormonbehandling. Likevel, med en fem års overlevelse på 17% av pasientene og en median overlevelse periode på 2-3 år, prognosen for pasienter med metastatisk prostatakreft fortsatt dårlig [3].
Det har blitt hevdet at svulsten stamfar celler spiller en avgjørende rolle i tumorutvikling og representerer en medikamentresistent cellepopulasjon som kan overleve konvensjonell behandling og forårsaker sykdom tilbakefall [4]. Denne forestillingen tyder på at behandling rettet mot kreftstamfedre kan føre til mer effektive kreftbehandling [5], [6]. Cellepopulasjon som uttrykker overflatemarkører CD133 og CD44 har blitt identifisert som mulige stamcellepopulasjoner i prostatakjertelen [5], [7], [8], [9]. Vi og andre har vist at CD133
+ /CD44
+ celler fra etablert prostatakreftcellelinjer er også selvfornyende og multipotent, og har sterke karsinogent potensial
in vivo product: [5], [ ,,,0],7], [10], [11], [12]. Mens prostata kreft cellelinjer dyrket under langsiktig enlagskultur vilkår inneholder mindre enn 2% prostatakreft stamfedre, dette CD133
+ /CD44
+ kreft stamfar befolkningen kan bli utvidet etter forankrings uavhengige serumfrie forhold (sfære forming forhold) [5], [11]. Dette beriket stamfar befolkningen opprettholder økt selvfornyelse kapasitet og tumorigenicity [5]. mRNA-ekspresjon analyse viste at kjemokinreseptoren CXCR4 er sterkt oppregulert i disse celler sammenlignet med celler dyrket under vekstbetingelser monolag [5]. Det er kjent at aktivering av CXCR4 /CXCL12 vei forandrer tilslutning, migrering og invasjon av kreftceller, inkludert prostata kreft [13], [14], [15]. Men lite er kjent om rollen av denne veien i vedlikehold av prostata svulst initiere cellepopulasjoner. Heri vi rapporterer studier som antyder at CXCR4 /CXCL12 aksen er aktivert i prostatakreftstamfedre og spiller en rolle i selvfornyelse, differensiering potensial, celle adhesjon, og tumorgenisiteten. Videre mus xenograft studier tyder på at hemming av CXCR4 veien kan være gunstig i målretting av prostata kreft stamceller
in vivo
.
Resultater
Den CXCL4 /CXCR12pathway er aktivert i CD44
+ /CD133
+ prostata stamfar befolkningen
Flere antatte stamcellepopulasjoner har blitt identifisert i prostata og er preget av celleoverflatemarkører CD44, CD133, og inte α2β1
høy [5], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Prostata kreft celler som uttrykker CD44 og CD133 celleoverflatemarkører kan bli beriket av prostatakreft cellelinjer ved å dyrke dem som kuler i progenitor medie forhold [5]. Vi og andre har bekreftet at dette CD133
+ /CD44
+ cellepopulasjonen utgjør en undergruppe av prostata kreft celler som er selv fornyer, differensiere i heterogene svulster, og er svært tumorigent i immunsvikt mus [5], [ ,,,0],7], [8], [9], [10], [11], [12]. For å identifisere signalveier selektivt aktivert i denne CD133
+ /CD44
+ befolkningen, vi gjennomført microarray analyse av genuttrykk i DU145 og PC3 celler ved hjelp av Affymetrix U133 arrays [5]. Genuttrykk profilering viste at kjemokinreseptoren CXCR4 er sterkt oppregulert i begge cellelinjer dyrket under sfære danner sammenlignet med monovekstforhold (en 13-dobling og 104,6-dobling for PC3 og DU145 cellene henholdsvis) [5]. Det høye nivået av CXCR4 ekspresjon observert i microarray eksperimenter ble bekreftet ved kvantitativ RT-PCR og Western blot-analyse (figur 1A).
(A) Celler dyrket under kuledannende betingelser viste en økt ekspresjonsnivå av CXCR4 som analyseres ved hjelp av RT-PCR og Western blot-analyse. For sfære dannelse, ble enkle celler sådd ut på 500 celler /ml i 10 cm skåler med en ultralav festeflate og dyrket i serumfritt epitelial basal medium i 7 dager. (B) Strømningscytometri-analyse viste betydelig anrikning av CXCR4
+ populasjonen i løpet av CD44
+ /CD133
+ celler sammenlignet med den totale cellepopulasjon for DU145 og PC3-celler (p 0,001). Cellene var trippel farget og analysert med en BD LSR II strømningscytometer. (C) Representative fluorescerende bilder av CD133 og CD44 co-farging som viser at CXCR4
+ DU145 og PC3 celler har en høyere andel av CD44
+ /CD133
+ celler i forhold til CXCR4
– celler. Celler som uttrykker høye til lave nivåer av CXCR4 ble FACS-rensede, sådd ut i 384 godt sort klare bunnplater ved en tetthet på 100 celler /brønn i serumfritt epitelial basalmedium. Etter 18 timer ble cellene fiksert med 3,7% formaldehyd i PBS og farget med anti-CD133 og anti-CD44-antistoffer. Celler i minst fem tilfeldig utvalgte synsfelt ble telt for hver tilstand. Pilene viser trippel positive celler. Skala barer indikerer 15 mikrometer. * – P-verdi 0,05. (D) Farging av parafin-embedded deler av xenografttumorer dannet av FACS renset CD44
+ /CD133
+ og CD44
– /CD133
– celler viste mer enn 13% CXCR4
+ celler i svulster avledet fra CD44
+ /CD133
+ celler sammenlignet med 2,2% CXCR4
+ celler i xenografttumorer avledet fra CD44
– /CD133
– celler. Totalt 10
3 FACS-sortert DU145 CD133
+ /CD44
+ eller CD133
– /CD44
– celler innebygd i BD matrigel ble injisert subkutant i NOD /SCID-mus. Tumorene fikk vokse i 42 dager før svulstene stilles ved DU145 CD133
+ /CD44
+ nådde en størrelse på 400 mm
3 og tumorene produsert av DU145 CD133
– /CD44
– nådd en størrelse på 125 mm
3. Celler i minst fem tilfeldig utvalgte synsfelt ble telt for hver tilstand. Skala barer indikerer 30 mikrometer. (E) CXCR4 farging på parafininnstøpte deler av xenografttumorer laget av cellene dyrket under sfære forming og monolagsforhold viste mer enn 6% CXCR4
+ celler i kule-avledet svulster, sammenlignet med 1,4% av CXCR4
+ celler i monolag-avledet xenografttumorer. ** – P-verdi. 0.01.Scale linjene viser 30 mikrometer
En voksende mengde bevis har vist at CXCR4 spiller en viktig rolle i kreft spredning, formidling, invasjon og narkotika motstand [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Men lite er kjent om rollen til CXCR4 /CXCL12 signalveien i vedlikehold av prostata kreft stamceller. For å kontrollere at CXCR4 uttrykket oppregulert i prostata svulst initiere celler, vi undersøkte CXCR4 nivåer i CD44
+ /CD133
+ prostata kreft stamceller og totale cellepopulasjoner i DU145 og PC3 cellelinjer ved flowcytometri. Vi observerte en 10.3- og 2,3 ganger berikelse i andelen CXCR4
+ celler i CD44
+ /CD133
+ befolkningen i forhold til prosentandelen av CXCR4
+ celler i den totale befolkningen i DU145 og PC3-celler, respektivt (figur 1B). I samsvar med denne observasjonen, FACS-rensede DU145 CXCR4
+ og PC3 CXCR4
+ populasjoner har en betydelig høyere andel av CD133
+ /CD44
+ celler sammenlignet med CXCR4
– celler ( en 5,8 ganger og 2,8 ganger økning for DU145 og PC3 celler, henholdsvis) (figur 1C). Denne økte nivået av CXCR4 uttrykk i CD133
+ /CD44
+ cellepopulasjonen antyder en viktig rolle for CXCR4 signalering i vedlikehold av prostata kreft stamceller.
For å finne ut om det samme korrelasjon
in vivo
vi analysert CXCR4 ekspresjon i tumorer fra mus injisert med CD133
+ /CD44
+ anrikede celler, så vel som celler dyrket under kuledannende betingelser. Begge prostata cellepopulasjoner har tidligere vist seg å ha økt tumorgenisitet [5], [12]. Histologisk analyse av DU145 xenografttumorer avledet fra FACS-renset CD44
+ /CD133
+ celler viste en signifikant høyere CXCR4
+ celle befolkningen enn i tumorer dannet av CD44
– /CD133
– celler (figur 1D). Tilsvarende analyse av CXCR4-ekspresjon i xenograft tumorer fra mus injisert med DU145-celler dyrket under sfære eller monolagsbetingelser viste at CXCR4 uttrykkende celler utgjør 6,1% av den totale cellepopulasjonen i sfæren-avledede tumorer, mens monolags-avledede tumorer med 1,4% av CXCR4 positive celler (figur 1E). Dermed er en høyere prosentandel av celler som uttrykker CXCR4 også assosiert med tumorer avledet fra både CD44
+ /CD133
+ celler eller celler dyrket under kuledannende betingelser.
Deretter analyserte vi forholdet mellom CXCR4 uttrykk og selvfornyelse kapasitet og tumorigenicity av prostata kreft stamceller. Begge FACS sortert DU145 og PC3 CXCR4
+ populasjoner viste en økning i sfære og kolonidannende potensiale over CXCR4
– celler (2,3 ganger økning og 3,9 ganger økning, henholdsvis) (figur 2A, B). Tilsvarende CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
+ celler har høyere spherogenic potensial i forhold til CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
– celler (figur 2C). For å evaluere selvfornyelse kapasitet på CXCR4
+ celler, ble sekundære kuler generert fra dissosierte primære kuler som stammer fra PC3 CXCR4
+ og PC3 CXCR4
– celler (figur S1 A). Antallet sekundære kuler per 1000 eller 500 celler var høyere med kuler som stammer fra CXCR4
+ celler enn fra CXCR4
– celler (en 5,5 ganger økning og 3,2 ganger økning, henholdsvis). For å bestemme hvorvidt aktivering av CXCR4 /CXCL12 akse stimulerer proliferasjon av prostata kreft stamceller, PC3 og DU145-celler ble behandlet med CXCL12 ved 10 og 100 ng /ml i 5 dager i serum-fritt epitelial vekstmedium. Som vist i figur 2D, aktivering av CXCR4 /CXCL12 signalveien øker CD44
+ /CD133
+ populasjonen både PC3 og DU145 prostatacancercellelinjer på en doseavhengig måte (opp til 3,5-fold og betydelig 2,6 ganger høyere, henholdsvis). Tilsvarende adenovirus-mediert overekspresjon av CXCR4 i DU145 cellene resulterte i en mer enn 2,5 gangers økning av CD44
+ /CD133
+ befolkningen (Figur 2E og figur S1B), men hadde liten effekt på CD44
– /CD133
– og totalt cellepopulasjoner. For ytterligere å karakterisere svulstdannende potensiale av CXCR4
+ -celler, 1000 FACS-rensede CXCR4
+ og CXCR4
-DU145 celler ble injisert subkutant i NOD /SCID-mus. CXCR4
+ celler ble funnet å ha betydelig høyere tumorigenicity enn CXCR4
– celler (opp til 3,8 ganger økning i xenograft tumorvekst, figur 2F, Figur S1C). Faktisk CD44
+ /CD133
+ og CXCR4
+ celler viste en lignende tumorigent potensiale
in vivo
. Disse resultatene indikerer at uttrykk for CXCR4 bidrar til tumorigent potensialet androgen ildfaste prostatakreftcellelinjer.
CXCR4
+ DU145 og PC3 cellene viste en økning i (A) clonogenicity og (B) sfære forming evne løpet CXCR4
– celler. (C) CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
+ DU145 cellene viste en økning i sfære dannende evne i forhold til CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
– celler. Cellene ble renset ved hjelp av FACS og sådd ut i 24-brønners lav feste plate ved en tetthet på 100 celler /brønn i serumfritt epitelial basal medium og dyrket i 10 dager. ** – P-verdi 0,01. (D) Strømningscytometri-analyse viste at CXCL12 stimulerer proliferasjon av prostata cancer progenitorceller i DU145 og PC3 cellelinjer på en doseavhengig måte. DU145 og PC3-celler ble dyrket i serumfritt, EBM medium med bilag og behandlet med de angitte konsentrasjoner av CXCL12 fylles daglig i 5 dager. (E) Overuttrykte CXCR4 i prostatakreftceller resulterte i en tre-dobling av CD44
+ /CD133
+ befolkningen. DU145-celler ble infisert med adenovirus som koder CXCR4 under kontroll av tet-off-regulatoriske system, og med kontroll adenovirus og analysert 4 dager etter infeksjon. CXCR4 uttrykk ble validert ved flowcytometri analyse. (F) CXCR4
+ celler ha høyere tumorigene egenskaper sammenlignet med CXCR4
– celler. 10
3 CXCR4
+, CXCR4
-, CD44
+ /CD133
+ og CD44
– /CD133
– DU145 cellene samlet inn av FACS sortering ble innebygd i BD matrigel og injiseres sc i NOD /SCID-mus. Hver forsøksgruppe inneholdt minst fem mus. Feilfelt representerer SEM
Til slutt, vi avgjort om CXCR4
+ og CXCR4
-. Celler vise tydelig differensiering potensial ved å analysere disse cellepopulasjoner for uttrykk av prostata avstamning markører. Tidligere studier har vist at prostatakreft kan stamme fra CK5
+ basal celler med multilineage differensiering potensial [23], [24]. DU145 og PC3 cellene ble sortert inn i CXCR4
+ og CXCR
– fraksjoner og dyrket på vev kultur behandlet plast under differensiering forhold. Interessant, CXCR4
+ populasjoner i DU145 og PC3 cellelinjer er mer heterogen i forhold til CXCR4
– celler og inkluderer CK5
+ populasjon av basale epitelceller, middels bestand av basal-lignende CK5
+ /CK18
+ celler, og CK18
+ populasjon av luminal epitelceller. I kontrast, CXCR4
– cellene differensieres til CK5
– /CK18
+ og CK5
+ /CK18
+ celler, men ikke gi opphav til CK5
+ basal epitelceller ( figur 3). Dette resultatet tyder på at CXCR4
+ befolkningen havner mer tumorigene basal-lignende celler, som er konsistent med de siste resultatene som basal epitelceller er en celle utstedt prostatakreft [25].
FACS renset CXCR4
+ og CXCR4
– DU145 og PC3-celler ble dyrket under differensierings betingelser i nærvær av 10% FBS.CXCR4
+ celler differensierer toCK5
+ basale epitelceller (10,7%), CK5
+ /CK18
+ mellomliggende celler (32,2%), og CK18
+ luminale epitel-celler (57,1%). I kontrast, CXCR4
– cellene differensieres til CK18
+ celler (91,9% av total cellepopulasjon) og CK5
+ /CK18
+ celler (8% av total cellepopulasjon), men ikke basal epitel celler. Skala barer indikerer 15 mikrometer.
CXCR4 /CXCL12 pathway regulerer prostatakreftceller gjennom et PI3K /AKT /FOXO3A avhengig feedback loop
Nylig viste vi at aktivering av PI3K /AKT sti er viktig for prostatakreft progenitor selvfornyelse og tumorigenisitet [5], [12]. Dessuten, en tidligere studie viste at CXCR4 /CXCL12 interaksjon aktiverer PI3K /AKT signalisering i prostatakreftceller [26]. Dermed kan CXCR4 bidra til opprettholdelse av prostata kreft stamceller gjennom aktivering av PI3K /AKT aksen. PI3K /AKT signale regulerer transkripsjon gjennom gaffelhodefamilien av transkripsjonsfaktorer (FOXO) ved å fosforylere konservert serin /treonin rester. Transkripsjonelt aktive FOXOs påvirker et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert celleoverlevelse, DNA-reparasjon, oksidativt stress respons, og lang levetid [27]. Blant medlemmene av FOXO familie, har FOXO3A vist seg å være viktig for opprettholdelse av nevrale, blodkreft, og endotel-stamceller [28], [29], [30] og prostatakreft stilk-lignende cellepopulasjoner [5] , [12]. I samsvar med tidligere forsøk som viste at FOXO3a-avhengig genekspresjon hemmes i CD44
+ /CD133
+ prostatakreft forfedre versus CD44
– /CD133
– celler [5], fant vi at FACS renset CXCR4
+ PC3 cellepopulasjonen viste redusert uttrykk nivåer av FOXO3A responsive gener som p21, GADD45, p130, BIM1, og CyclinG2 forhold til CXCR4
– celler, noe som tyder på at økt uttrykk av CXCR4 er forbundet med PI3K aktivering (figur 4A). Behandling av prostatacancerceller med CXCL12 ved en konsentrasjon på 100 ng /ml indusert aktivering av PI3K /AKT-reaksjonsveien (opp til 1,5 til 2,0 ganger økning av AKT-fosforylering i PC3 og DU145-celler, henholdsvis) (figur 4B), i tillegg til øke CD44
+ /CD133
+ befolkningen for både PC3 og DU145 cellene (figur 2D). Derimot er PI3K hemming avskaffet helt effekten av CXCL12 på spredning av CD44
+ /CD133
+ stamfedre (Figur 4C), og redusert nivå av CXCR4 uttrykk i både DU145 og PC3 cellene
in vitro Hotell og
in vivo plakater (figur 4D, E).
(A) Isolert CXCR4
+ PC3 celler viste redusert uttrykk nivåer av FOXO3A responsive gener som p21, GADD45, P130, BIM1, CyclinG2 forhold til CXCR4
-PC3 celler. mRNA-nivåer ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR og normalisert til GAPDH mRNA. (B) Behandling av prostatakreftceller med CXCL12 indusert aktivering av PI3K /AKT pathway. DU145 og PC3-celler ble dyrket i serumfritt, EBM medium med bilag og behandlet med de angitte konsentrasjoner av CXCL12 og NVP-BEZ235 i 18 timer. (C) proliferativ effekt av CXCR4 /CXCL12 signale på CD44
+ /CD133
+ stamceller kan bli helt avskaffet av PI3K hemming. DU145 og PC3-celler ble dyrket i serumfritt, EBM medium med bilag og behandlet med de angitte konsentrasjoner av CXCL12 og NVP-BEZ235 fylles daglig i 5 dager. (D) Behandling av DU145 og PC3 celler med PI3K hemmere LY294002 og NVP-BEZ235 redusert nivå av CXCR4. (E) PI3K hemming reduserer CXCR4 uttrykk
in vivo
. DU145-celler ble injisert subkutant i NOD /SCID-mus. Når tumorene hadde vokst til en størrelse på 300 mm
3, ble musene behandlet med NVP-BEZ235 (12,5 mg /kg gitt hver dag peroralt) eller med kjøretøy i 5 uker. Histologisk analyse av parafin innebygde seksjoner demonstrerer reduksjon av CXCR4-ekspresjon i xenograft tumorer behandlet med PI3K-inhibitor. Skala barer indikerer 15 mikrometer. (F) DU145-celler som stabilt transfektert med FOXO3A-GFP har sunket CXCR4 uttrykk. Western blot analyse viser endogen og overuttrykt FOXO3A fusjonsproteiner (piler). (G) ChIP analysen viser at FOXO3A binder til CXCR4 arrangøren. DU145 og PC3-celler ble stabilt transfektert med enten GFP eller FOXO3A-GFP som beskrevet [17]. Celler ble kryssbundet med formaldehyd og kromatin ble immunopresipitert med anti-FOXO3A /FKHRL1 antistoff. Den tverrbundne genomiske CXCR4-promoteren ble påvist ved hjelp av PCR. FOXO3a regulert gen eNOS ble anvendt som en positiv kontroll. Mengden av utfelt FOXO3A-CXCR4 promoter ble økt i DU145-celler som stabilt transfektert med FOXO3A-GFP protein.
Vi har også observert en nedgang i CXCR4 protein nivåer i respons til FOXO3A overekspresjon i DU145 cellene (Figur 4F ) tyder på at FOXO3A kunne regulere CXCR4 nivåer direkte gjennom CXCR4 transkripsjonsregulering eller indirekte via en annen FOXO3A target genet. Inspeksjon av CXCR4 promoter [31] viste en antatt FOXO bindende sekvens GCAAACA [32] fra posisjoner -187 til -181. For å bekrefte at FOXO3A binder til CXCR4-promotoren, ble en kromatin immunoutfelling assay (chip) utføres. Mengden av utfelt CXCR4 promoter ble økt i DU145-celler som stabilt transfektert med FOXO3A-GFP protein (figur 4G) som viser at FOXO3A binder til CXCR4 promoter. Disse dataene viser en sammenheng mellom PI3K /AKT signale aktivering, CXCR4 uttrykk og selvfornyelse kapasitet og tumorigenicity av CD44
+ /CD133
+ prostata kreft stamceller.
CXCR4 regulerer tumor stamceller adhesjon
rollen til CXCR4 i progresjon av kreft har generelt vært analysert i forbindelse med kreftcellen metastase [19], [20], [21], [22], [33]. På molekylært nivå, er CXCR4 en viktig mediator av interaksjonen av prostata tumorceller til ekstracellulære matriseproteiner slik som laminin, fibronektin, kollagen og som bidrar til den metastatiske prosess [14], [34], [35]. Til tross for at CXCR4 ikke direkte modulere celle vedlegg, spiller CXCR4 reseptoren engasjement ved CXCL12 en viktig rolle i forvaltningen av celle adhesjon ved modulering av inte uttrykk, FAKfosforylering, og aktivering av p38 MAPK og ROCK kinaser [34], [36]. For å undersøke hvilken rolle CXCR4 i cellen adhesjon og migrasjon av prostata svulst initierende celler, sammenlignet vi FACS sortert CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
+ celler med andre bestander i celleadhesjonsprosesser analyser. Vi fant ut at CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
+ celler har betydelig høyere CXCL12 avhengig vedheft til fibronectin enn CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
– eller CD44
– /CD133
– /CXCR4
– celler populasjoner (figur 5A). Den CXCL12-indusert adhesjon av prostata kreft celler til den ekstracellulære matrise er mediert av inte. Interessant, uttrykket nivåer av α2, α5, og β3 integrin subenheter sterkt oppregulert i CD133
+ /CD44
+ DU145 forhold til CD133
– /CD44
– DU145 cellene (Figur 5B), i samsvar med nyere studier som viser at aktivering av CXCR4 /CXCL12 banen i DU145 celler fører til forsterket uttrykking av α5 og P3 griner [14]. I tillegg inaktivering av PI3K vei med NVP-BEZ235 (200 nM) signifikant redusert CXCR4-avhengig adhesjon av CD133
+ /CD44
+ DU145-celler til fibronektin, og denne hemming kan oppheves i nærvær av 200 ng /ml CXCL12 (figur 5C). Bemerkelsesverdig, vedheft av CD133
– /CD44
– DU145 cellene ikke svare på CXCL12 behandling eller PI3K signale hemming (figur 5C). Sammen er disse studiene tyder på at uttrykket av CXCR4 kunne gi en selektiv fordel for interaksjon med den ekstracellulære matrise og lette preinvasive binding av tumor stamceller slik at ytterligere tumor spredning.
(A) DU145 CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
+ celler har betydelig høyere CXCL12 avhengig vedheft til fibronectin enn CD44
+ /CD133
+ /CXCR4
– eller CD44
– /CD133
– /CXCR4
– celler populasjoner. Cellene var FACS sortert og belagt på fibronektin belagt plater og lov til å følge i 1 time. Cellene ble telt i tre brønner per tilstand ved hjelp av et fasekontrastmikroskop * – p-verdi. 0,05. (B) Uttrykket nivået av α2, α5, og P3 inteunderenheter er sterkt oppregulert i CD133
+ /CD44
+ DU45 forhold til CD133
– /CD44
– DU45 celler. (C) inaktivering av PI3K veien med NVP-BEZ235 reduseres betydelig CXCR4-avhengige heft CD133
+ /CD44
+ DU45 celler til fibronektin. Heft CD133
+ /CD44
+ DU45 celler kan gjenopprettes i nærvær av CXCL12. Heft CD133
– /CD44
– DU45 ikke svare på CXCR4 og PI3K signale modulasjon, * -p verdi. 0,05
Hemming av CXCR4 vei fører til en nedgangen i prostata kreft stamceller populasjoner
for å gi ytterligere bevis for at CXCR4 /CXCL12 signalering er viktig for stilk-lignende celle vedlikehold og målretting av denne veien kan føre til hemming av prostatakreft stamfar vekst, vi testet om inaktivering av CXCR4 /CXCL12 aksen av en nøytraliserende antistoff påvirker prostata kreft stamceller
in vitro Hotell og
in vivo
. DU145-celler ble behandlet med 10 mikrogram /ml nøytraliserende anti-CXCR4 (mus monoklonalt IgG, klon 44 716, R * – P-verdi 0,05. (B) Strømningscytometri-analyse viste dempning av CD44
+ /CD133
+ populasjonen i DU145-celler behandlet med 10 ug /ml nøytraliserende anti-CXCR4 (mus monoklonalt IgG, klon 44 716, R * – P-verdi 0,05. (C) Western blot-analyse av DU145 celler behandlet med 10 ug /ml nøytraliserende anti-CXCR4 antistoff i 5 dager, viste nedregulering av den PI3K /AKT sti aktivering sammenlignet med celler behandlet med 10 ug /ml kontroll-antistoff. Cellen ble dyrket i medium supplert med 2% FBS. Kultur medium ble oppdatert hver andre dag. (D) Preinkubering av prostata kreft celler med nøytraliserende anti-CXCR4 antistoff forsinker tumorvekst betydelig. 5 × 10
5 DU145 celler forbehandlet med nøytraliserende anti-CXCR4 eller kontroll antistoff i 5 dager ble innebygd i BD matrigel og injisert subkutant . I NOD /SCID-mus * – p-verdi. 0,01
Vi testet effekten av CXCR4-spesifikke lite molekyl antagonist AMD3100 på overlevelse av stamfar befolkningen (CD44
+ /CD133
+) innen prostata kreft cellelinjer. PC3-celler ble behandlet med 0,5 uM AMD3100 eller med 75 uM av den konvensjonelle kjemoterapeutiske legemiddel 5-fluoruracil i 4 dager i serum-fritt epitelial vekstmedium. Flowcytometri analyse avdekket en 2,2-fold reduksjon i CD44
+ /CD133
+ befolkningen med AMD3100 behandling (Figur 7A og figur S2A), mens denne populasjonen ble økt til 2,1 ganger i respons på konvensjonell terapi. I kontrast til CD44
– /CD133
– befolkningen var følsomme for konvensjonell kjemoterapi viser en 2,1 ganger nedgang, men var ikke svarer til AMD3100 behandling. Dessuten er kombinasjonen av AMD3100 og det kjemoterapeutisk middel resulterte i en samtidig reduksjon av både CD44
+ /CD133
+ og CD44
– /CD133
– cellepopulasjoner (≥1.8 gangers nedgang og 1.7 fold redusere henholdsvis)
(A) Behandling med CXCR4 antagonister AMD3100 reduserer CD133
+ /CD44
+ befolkningen, men ikke påvirke CD133
-. /CD44
– befolkningen innen prostata kreft celler. Bruken av cytotoksiske medikamenter alene resulterer i en reduksjon i prolifererende tumorceller, men fører til en generell økning i den relative populasjon av tumorceller initiering. Kombi behandling av PC3 celler med AMD3100 og den konvensjonelle kjemoterapeutiske stoffet 5-fluouracil reduserer både udifferensierte og differensierte celler populasjoner. PC3-celler ble dyrket i serumfritt, EBM medium med bilag og behandlet med de angitte konsentrasjoner av AMD3100 og 5-fluouracil. På den 5
th dag ble cellene underkastet flow cytometri analyse; * -p Verdi 0,05. (B) Kombi terapi
in vivo
viser signifikant hemming av tumorvekst sammenlignet med én behandling. Musene ble behandlet med taxotere (20 mg /kg, 1q.w., p.o.) som beskrevet (19). Alzet pumper ble brukt til å levere AMD3100 ved en konstant hastighet på 0,25 pg /kg /time. Pumpene lastet med AMD3100 eller saltvann ble implantert subkutant. Musene ble observert i 8 uker for utseende og utvikling av svulster. (C) CD133 og CD44 farging på frosne deler av xenografttumorer behandlet med kombinatorisk eller monoterapi fra (B) viste selektiv hemming av CD133
+ /CD44
+ befolkningen ved CXCR4 antagonist AMD3100; * -p Verdi 0,05. (D) Western blot analyse viste en signifikant reduksjon i FOXO3A fosforylering i svulstene behandlet med AMD3100.
Kombinasjonsbehandling målretting progenitor og bulk kreftceller fører til økt tumorregresjon
For å finne ut Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
