Abstract
TMPRSS2-ERG
krysset onkogen er til stede i over 50% av pasienter med prostatakreft og dets ekspresjon blir ofte assosiert med dårlig prognose. Vårt mål er å oppnå genet knockdown av siRNA TMPRSS2-ERG og deretter vurdere de biologiske konsekvensene av dette hemming. Først må vi designet sirnas mot de to
TMPRSS2-ERG
fusion varianter (III og IV), oftest identifisert i pasientenes biopsier. To av de fem sirnas som ble testet ble funnet å effektivt inhibere mRNA av både
TMPRSS2-ERG
varianter og for å redusere ERG proteinekspresjon. Microarray analyse ytterligere bekreftet ERG hemming av både sirnas TMPRSS2-ERG og avslørte en felles nedregulert genet,
ADRA2A
, involvert i celleproliferasjon og migrasjon. SiRNA mot TMPRSS2-ERG-fusjons variant IV hadde de høyeste anti-proliferative effekter: Vesentlig redusert cellelevedyktighet, økt spaltet caspase-3 inhiberte og en klynge av anti-apoptotiske proteiner. Å foreslå en konkret terapeutisk tilnærming, ble siRNA TMPRSS2-ERG IV konjugert til squalene, som kan selv organisere som nanopartikler i vannet. De nanopartikler av siRNA TMPRSS2-ERG-skvalen injisert intravenøst i SCID-mus redusert vekst av Vcap xenopodet svulster, hemmet oncoprotein uttrykk og delvis restaurert differensiering (reduksjon i Ki67). Som konklusjon, denne studien gir et nytt prospekt for behandling for prostatakreft basert på siRNA-skvalen nanopartikler målretting
TMPRSS2-ERG
krysset onkogen
Citation. Urbinati G, Ali HM, Rousseau Q, Chapuis H, Desmaële D Couvreur P, et al. (2015) Antineoplastiske Effekter av siRNA mot TMPRSS2-ERG Junction Oncogene i prostatakreft. PLoS ONE 10 (5): e0125277. doi: 10,1371 /journal.pone.0125277
Academic Redaktør: Natasha Kyprianou Universitetet of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 14 januar 2015; Godkjent: 22 mars 2015; Publisert: 01.05.2015
Copyright: © 2015 Urbinati et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: The microarray data knyttet til studiet har blitt sendt til Array Express dataregister på europeisk Bioinformatikk Institute (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/), under sjonsnummer:. E-mtab-2838
finansiering: forskning som fører til disse resultatene har mottatt støtte fra Agence Nationale de Recherche (ANR), Program P2N, Grant N ° NANO 00301.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at det ikke konkurrerende interesser eksisterer .
Innledning
Prostatakreft (PCA), en androgen-avhengige svulst, er blitt den hyppigste kreft hos menn (27% av alle krefttilfeller hos menn) og representerer fire
th årsaken til dødelighet av kreft og 2
nd hos menn. I 2014 estimerte forekomsten var på ca 230 000 tilfeller i USA og 417.000 tilfeller i Europa (ACS American Cancer Society,
ACS
org
,… WHO European Cancer Observatory,
eu-kreft
.
IARC
.
fr
). De viktigste risikofaktorene er alder, familiehistorie og svart etniske opprinnelse, men karsinogenisitetsstudier resultatene fra et samspill mellom både miljømessige og endogene faktorer [1]. Den konvensjonell behandling for prostatakreft er androgen deprivasjon terapi; imidlertid, til tross for en høy respons på denne behandlingen, de fleste pasienter videre til kastrering motstand [2]. Siden 2010 har fem nye amerikanske FDA-godkjente behandlinger vært tilgjengelige for kastrering-resistente og metastatisk prostatakreft (Cabazitaxel, Enzalutamide, abirateronacetat, Sipuleucel T,
223Radium klorid). Imidlertid er bivirkningene av de nye stoffene er ikke ennå godt etablert og pasientoverlevelse er bare litt bedre, hvilket resulterer i smertestillende middel i stedet for terapeutiske behandlinger [1, 3]. Derfor er utvikling av nye behandlingsformer fortsatt sterkt anbefalt og uunnværlig.
Tomlins
et al
., Oppdaget et gen fusjon heter TMPRSS2-ERG i mer enn 50% av prostatakreft [4] . TMPRSS2-ERG skyldes omorganisering påvirker kromosom 21 som fører til fusjon av et gen regulert av androgener
TMPRSS2
, med transkripsjonsfaktoren
ERG product: [5]. Sammensmeltingen av
TMPRSS2-ERG
fører til overuttrykk av ERG i prostatakjertelen; Dette fremmer prostata svulst initiering og progresjon. Konsekvent, en betydelig mengde data tyder på at denne blanding gir en mer aggressiv fenotype og kan påvirker utfallet av lokaliserte tumorer som ble behandlet med androgen deprivasjon [5-11]. Mer enn 17 transkripsjoner er observert for
TMPRSS2-ERG
krysset onkogen og best kjente, beskrevet av Wang
et al
. er betegnet som varianter I til VIII [12.]. Blant dem var de hyppigste variantene som finnes i pasientenes biopsier er varianter III og IV og resultat fra å delta ekson 1 av
TMPRSS2
med eksoner 4 eller 5 av
ERG
hhv. Begge fusjoner fører til en over-uttrykk for avkortet men funksjonell ERG protein [12-14]. Videre er ulike former for fusjons transkripter ble beskrevet i den samme tumor [15, 16].
tross det faktum at små interfererende RNA (sirnas) er høyt spesifikk og effektiv ved meget lave konsentrasjoner, er de ustabile i biologiske væsker og den hydrofile karakter hindrer deres mål levering og det cellulære opptak. For å forbedre deres stabilitet, beskytte dem mot nukleaser nedbrytning og forbedre sin hydrofob karakter, må de bli bedre transporteres og leveres inn i kroppen [17]. Vi har nylig bevist effektiviteten av «squalenoylation» -teknologi for å vectorise sirnas designet mot
RET /PTC1 Hotell og
RET /PTC3
junction onkogener, og foreslo at squalenoylation tilbyr en ny ikke-kationiske plattform for siRNA levering [18, 19]. Å vite at en betydelig prosentandel av prostata kreft havner
TMPRSS2-ERG
krysset onkogen, er vårt mål å innføre en ny potensiell terapeutisk tilnærming av siRNA målretting
TMPRSS2-ERG
krysset onkogen hos pasienter med prostatakreft kreft. Våre resultater peker på en konkret klinisk anvendelse for prostatakreft terapi basert på TMPRSS2-ERG knockdown.
Materiale og metode
Kjemi
Alle kjemikaliene som ble brukt var av høyeste analytisk kvalitet . Squalen, sirnas, MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazoliumbromid] reagenset og paraformaldehyd (PFA, 16%) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Quentin Falla , Frankrike). 3′-tiol modifiserte sirnas ble kjøpt fra Eurogentec (Belgia) og Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM), Opti-MEM, føtalt kalveserum (FCS), ble Lipofectamine RNAiMAX og PCR primere kjøpt fra Life Technologies (Saint Aubin, Frankrike). BD Matrigel (basalmembran Matrix Growth Factor Redusert-Reference 356 234) ble kjøpt fra Corning (Amsterdam, Nederland). Bio-RAD protein assay ble kjøpt fra Bio-Rad Laboratories (Marnes-la-Coquette, Frankrike). Annexin-V-Fluos farging kit ble kjøpt fra Roche (Meylan, Frankrike). NucView 488 caspase-3 settet var kjøpt fra VWR (Fontenay-sous-Bois, Frankrike). Proteome Profiler Menneskelig Apoptose Array kit ble kjøpt fra R deres sekvenser er vervet i S2 tabell. SiRNA kontroll har sekvensen av siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) med fem uoverensstemmelser. Alle enkelt-strandet sirnas ble syntetisert av Sigma-Aldrich Chemical Co. (Saint Quentin Fallavier, Frankrike) som 21-mer med to 3′-hengende 2′-deoksynukleotid rester å gi stabilisering mot nukleaser [21]. For å utføre squalen bio-konjugering, ble en 3-merkaptopropyl fosfatgruppe innføres ved 3′-enden av siRNA senstråden (syntetisert av Eurogentec, Belgia).
in vitro celle
transfeksjon
Transiente transfeksjoner ble utført for å: i) å vurdere den mest effektive siRNA TMPRSS2-ERG utformet [siRNA III (1, 2, 3) eller IV (1, 2)], ii) finner mest effektive siRNA konsentrasjon, iii) å vurdere effektiviteten av sirnas, iv) å analysere de knockdown virkning på cellelevedyktighet, apoptose og genregulering, v) verifisere
TMPRSS2-ERG
knockdown effektivitet, med og uten transfektere midler, etter siRNA TMPRSS2-ERG squalenoylation.
Forbigående transfections ble utført med Lipofectamine RNAiMAX trans middel i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 8 x 10
5 VCap-celler ble sådd ut i seks-brønns plater som inneholdt DMEM supplert med 10% FCS, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (10 ug /ml) ved anvendelse av forskjellige konsentrasjoner siRNA og 6 ul Lipofektamin RNAiMAX. Cellene ble inkubert med siRNA for 24t, 48t og 72t. FAM-merkede siRNA kontroll ble anvendt til å overvåke effektiviteten av siRNA transfeksjon.
For valg av en effektiv siRNA konsentrasjon, VCap-celler ble transfektert med den valgte effektiv sirnas TMPRSS2-ERG III eller IV ved 2,5 nM, 10 nM, 25 nM og 50 nM konsentrasjoner og inkubert i 48 timer. Ved slutten av behandlingene ble mRNA og proteiner ekstrahert fra cellene som skal analyseres for gen- og proteinknockdown.
Sanntids PCR (RT qPCR-)
Total RNA ble ekstrahert fra VCap celler ved hjelp RNeasy mini-kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike). Første cDNA ble generert med M-MLV RT buffer pakke (Promega, Charbonnières-les-Bains, Frankrike). Real-time PCR (qPCR) ble utført med StepOnePlus PCR System (AB Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, Frankrike) med GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Charbonnières-les-Bains) i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble kjørt i triplikat; genregulering ble bestemt ved 2
-ΔΔCt fremgangsmåte og normalisert til GAPDH-nivåer. For knockdown eksperimenter, er resultatene gitt som relative mRNA nivåer sammenlignet med ikke-behandlede celler.
Immunoblotting
Totalt proteinekstrakter ble oppnådd ved bruk av M-PER reagens (Thermo Fisher Scientific Courtaboeuf, Frankrike) supplert med en proteasehemmer cocktail (Roche, Neuilly sur Seine, Frankrike). Proteiner ble titrert med Bio-Rad analyse i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble deretter lastet på 10% polyakrylamid gel (NuPAGE Bis Tris Mini Gel 10%, Life Technologies, Saint-Aubin, Frankrike) og proteiner ble overført ved hjelp av iBlotDry Blotting System (Invitrogen, Frankrike). Membraner ble inkubert over natten ved 4 ° C med en av følgende primære antistoffer: monoklonalt kanin ERG (EPR 3864 (2), 1: 500, Abcam Biochemicals, Paris, Frankrike) eller monoklonalt kanin Caspase-3 (1: 1000, Cell Signal teknologi, Saint Quentin en Yvelines, Frankrike Jf. 9662). Monoklonalt mus GAPDH-HRP (1: 1000, Cell signale teknologi, Saint Quentin en Yvelines, Frankrike Ref. 3683) ble benyttet som intern kontroll. Blottene ble deretter vasket og inkubert med tilsvarende sekundære anti-kanin eller anti-mus-antistoffer konjugert med HRP (pepperrot-peroksydase, 1: 3000, Cell Signal teknologi). Bånd ble visualisert ved forbedret chemiluminescence reagent (Invitrogen, Frankrike).
Livskraftig analysen
levedyktighet Vcap celler ble evaluert av MTT-analyse etter 72h inkubasjon med sirnas TMPRSS2-ERG eller Kontroll på 50 nM konsentrasjon. MTT-analyse ble også utført 72h etter celle transfeksjon med siRNA TMPRSS2-ERG III og IV ved 0,1 nM, 1 nM, 2,5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM og 200 nM konsentrasjoner. Resultatene er gjennomsnitt ± SD av to uavhengige eksperimenter som inneholder 8 replikater for hver tilstand og er uttrykt som levedyktighet prosentandelen av behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler.
Hel-genom microarray analyse
Tre uavhengige transfections ble utført med 50 nM siRNA TMPRSS2-ERG III, siRNA TMPRSS2-ERG IV og siRNA kontroll på Vcap celler. Totalt RNA av ubehandlede og transfekterte celler ble hentet ved hjelp RNeasy mini-kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike). Protokollen er detaljert i Array Express (tilgangsnummeret: E-mtab-2838) og tidligere beskrevet av Gilbert-Sirieix [22]. MRNA ble deretter merket ved hjelp av fluorescerende lav-inngang lineær forsterkning kit (Agilent Technologies, Massy, Frankrike). I korthet, revers transkripsjon ble utført ved anvendelse av M-MLV revers transkriptase. Deretter ble cyanin 3-merket cDNA ble generert ved bruk av T7-RNA-polymerase. Hybridiseringer ble utført i 17 timer ved 60 ° C på Agilent human hele genomet oligo microarray 8x60k, enten med 1 ug av ubehandlede celler eller med siRNA TMPRSS2-ERG III, siRNA TMPRSS2-ERG IV eller siRNA kontroll transfekterte celler. Lysbilder ble skannet med Agilent 2505 C DNA microarray scanner og microarray bildene ble analysert med Feature utvinning programvareversjon 10.7.3.1 (Agilent Technologies). Rådatafiler ble normalisert med Limma prosedyre. Vi definerte opp- eller ned-regelverket som forholdstall større enn to ganger mellom Vcap celler transfektert med siRNA (TMPRSS2-ERG III, TMPRSS2-ERG IV og kontrollsekvenser) og ubehandlede Vcap celler, anskaffet med en fold funnrate ≤ 0,05 og en minimum intensitet ≥ 100. for å tolke den biologiske betydningen av genomiske data, brukte vi oppfinnsomhet programvare (www.ingenuity.com). Deretter ble ektheten av microarray data validert av RT-qPCR, av noen av de 10 opp- eller ned-regulert gener ved siRNA TMPRSS2-ERG III og IV. Gene spesifikke primere ble utformet ved hjelp av Oligo Explorer 1.1.0 og Oligo Analyzer 1.0.2 programmer (Kuopio-universitetet, Kuopio, Finland, grunning sekvenser er vervet i S3 tabell). Primere ble valgt med en smeltetemperatur på 60 ° C og et amplikon størrelse på 100-200 baser. Prøvene ble kjørt i duplikat med primer sett av genet av interesse og
GAPDH
som intern kontroll genet.
Annexin-V apoptose analysen
Apoptose ble bestemt ved flowcytometri analyse ved hjelp av en Annexin-V-Fluos farging kit inneholdende både Annexin V-bundet til fluorescein og propidiumjodid (PI). VCap celler ble transfektert med 50 nM av siRNA TMPRSS2-ERG III, IV eller siRNA Control i nærvær av Lipofectamine RNAiMAX. Etter 72H-enheten eller 96h inkubasjon, medium og celler ble samlet og sentrifugert, deretter farget med Annexin-V-Fluos flekker kit i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri (Accuri C6 Flowcytometer, BD Biosciences, San Jose, USA). Ti tusen hendelser i den valgte populasjon ble analysert og elektronisk kompensasjon av apparatet ble utført for å utelukke overlapping av de to emisjonsspektra (Fluorescein og PI). Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer og behandlet celler i hver fase av celledød ble sammenlignet med ikke-behandlede celler.
Cell apoptose analyser
Apoptose ble evaluert av IncuCyte system (Essen Instruments, Ann Arbor, Michigan, USA), som tillater overvåking av levende celler i kultur over tid, og kvantifiserer apoptotiske celler ved telling av fluorescerende kjerner tilstede pr mm
2-område i hvert bilde. Caspase-3/7 substrat (NucView488 caspase-3 kit) ble brukt for å følge caspase aktivitet i levende celler i sanntid. Når substratet blir spaltet av aktivert kaspase-3/7, er høy-affinitets-DNA-fargestoff frigitt og migrerer til cellekjernen for å flekke den sterkt. Brønnene ble skannet (6 bilder /brønn) hver 12h ved IncuCyte for overvåking av fluorescens for hvert bilde.
Vcap celler (30000 /brønn) ble sådd i 96 brønners plater med 100 mL DMEM inneholder FCS og antibiotika, og transfektert med 50 nM av siRNA TMPRSS2-ERG III, IV eller siRNA Control. Apoptose deteksjon kit NucView 488 caspase-3/7 ble tilsatt, og celle-platene ble plassert i IncuCyte henhold inkuberingsbetingelser. Forsøket ble utført i tre eksemplarer og fluorescerende apoptotiske signal i siRNA transfekterte celler ble sammenlignet med ikke-behandlede celler.
Proteome apoptose profiler rekke
Først transient transfeksjon av siRNAs TMPRSS2-ERG III, IV og siRNA kontroll ble utført i VCap-celler i 72 timer, som beskrevet ovenfor. Celler ble lysert og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bio-Rad analyse i henhold til produsentens instruksjoner. Hver proteinprøve (ikke-behandlede VCap-celler, behandlet VCap celler med sirnas TMPRSS2-ERG III, IV eller siRNA kontroll) ble deretter inkubert over natten med «Human apoptose Array» (R MESR) under autorisasjonsnummer CEEA IRCIV /IGR n ° 26: 94-226, Nr: 2011- 09 og utføres i henhold til franske lover og regler på de vilkår fastsatt av det europeiske fellesskap (direktiv 2010/63 /UE). Alle forsøk ble gjort for å minimere dyr nåde: administrasjons behandlinger ble utført under isoflurananestesi og dyrene ble avlivet av CO
2 innånding før svulsten samling. Fem ukers gamle SCID /beige mus kjøpt fra Harlan Laboratory. Alle dyr ble plassert i sterilisert laminær caging system og mat, vann og sengetøy ble autoklavert før de blir satt i bur. Mat og vann ble gitt
ad libitum
.
In vivo
effektiviteten av siRNA TMPRSS2-ERG IV-SQ nanopartikler
Vcap cellene
r
.
c
. vaksinert [10 × 10
6 celler /musen i PBS (50 mL) blandet med Matrigel (50 mL)]. Når tumorer nådde ca 50mm
3, mus (n = 5 /gruppe) ble behandlet intravenøst (
i
.
v
.) To ganger per uke enten med saltløsning (NaCl 0,9% ), ikke-vektorisert siRNA TMPRSS2-ERG IV, siRNA Kontroll-SQ NPs eller siRNA TMPRSS2-ERG IV-SQ NPs, dispergert i 100 mL av 0,9% NaCl-løsning med en hastighet på 0,5 mg /kg for første injeksjon og 0,1 mg /kg for resten av injeksjoner (kumulativ dose = 1.8 mg /kg /mus). Mus ble overvåket daglig for tumorvekst og kroppsvekt og deretter avlivet ved slutten av eksperimentet (dag-40), eller når tumorene nådde et volum på 1000 mm
3. Svulster ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen for Western blotting eller fiksert i 4% paraformaldehyde (PFA) for immunhistokjemiske studier (IHC).
Protein utdrag fra svulster
Svulster ble bakken og proteiner ble trukket ut som beskrevet ovenfor. Western blot ble utført for å vurdere ERG proteinnivå. GAPDH ble benyttet som intern kontroll.
Immunhistokjemi
Studier er utført som tidligere beskrevet av Ali et al., [19.]. Kort fortalt ble tumorvev i parafin, ble 4 mikrometer tykke seksjoner forberedt og farget med hematoksylin-eosin-safranin (HMS) og inkuberes med et monoklonalt kanin anti-Ki67 antistoff (Lab Vision /Neomarkers, Fremont, USA, 1: 200) etterfulgt av «Rabbit Powervision Kit» (Ultravision Technologies, North Andover, USA). Signalene ble avslørt med chemiluminescence DAB Powervision kit (Immuno-Vision-Technologies Co, Hillsborough, USA). Seksjonene ble undersøkt med Zeiss-Axiophot mikroskop (Mikroskopi og Imaging senter, Texas, USA).
Statistisk analyse
Alle data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Non parametrisk Kruskal-Wallis analyse ble brukt for å sammenligne flere behandlinger. Alle parvise sammenligninger mellom ulike behandlingsgruppene ble gjort av Tukey og Dunnet test med «R» programvare.
p
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant nivå
Resultater
Identifikasjon av TMPRSS2-ERG varianter i Vcap celler
Først, vi kjennetegnes TMPRSS2-ERG transkripsjon produkter i Vcap cellelinje som endogent uttrykker
TMRPSS2-ERG
fusjon onkogen. Åtte spesielt utviklet primere ble brukt til å gjenkjenne varianter av TMPRSS2-ERG fra I til VIII (S1 tabell). Som vist i tabell 1, ved hjelp av RT-qPCR, fusjon varianter III og IV ble funnet å være sterkt uttrykt i VCap celler (Ct henholdsvis 20 og 23), mens varianter I, II, VII og VIII ble svakt uttrykt (Ct 30 ). Fusjon varianter V og VI ikke ble funnet å bli uttrykt på denne cellelinje. Siden fusion varianter III og IV er høyt uttrykt i Vcap celler og svarer til de hyppigste variantene som finnes i prostata kreft biopsier, ble de valgt for videre studier med knockdown av siRNA.
sirnas TMPRSS2-ERG mot varianter III og IV redusere onkogen uttrykk og påvirker Vcap celleviabilitet
Vi har utformet 10 sirnas TMPRSS2-ERG over krysset: ekson 1 TMPRSS2-ekson IV ERG for variant III og ekson 1 TMPRSS2-ekson V ERG for variant IV . Ifølge Reynold regler [20], tre siRNA sekvenser mot variant III TMPRSS2-ERG og to siRNA sekvenser mot variant IV ble valgt til å være potensielt effektiv mot hver av de varianter, som vist i Tabell S2.
effektiviteten av siRNA designet mot
TMPRSS2-ERG
i stanse den tilsvarende fusjon onkogen ble først testet av RT-qPCR på 24t, 48t og 72t i Vcap celler. Som vist i tabell 2, ble fire sirnas funnet effektiv i genet Slå [siRNA TMPRSS2-ERG III (1, 2, 3) og TMPRSS2-ERG IV (1)]. Bemerkelsesverdig, siRNA TMPRSS2-ERG III (1) og siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) viste en bedre langsiktig mRNA hemming sammenlignet med siRNA ERG (etter 72 timer: 70% hemming av vår designet siRNA
vs
30 % hemming av kommersialisert siRNA ERG). Av notatet, siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) forårsaket den høyeste hemming av TMPRSS2-ERG mRNA nivåer for både variantene III og IV (tabell 2). Som ventet fikk rykke siRNA (siRNA Control) ikke viser noen hemming av fusjonsgenet transkripsjoner.
Så undersøkte vi effektiviteten av siRNAs TMPRSS2-ERG på hemming av protein uttrykk på 24t, 48t og 72h ved Western blot hjelp ERG antistoff stiller (fig 1a). Blant de sirnas utformet mot TMPRSS2-ERG variant III, både sirnas TMPRSS2-ERG III (1) og (to) viste en bedre effekt enn lyddemping TMPRSS2-ERG III (3) og nådde sin maksimale aktivitet etter 72 timer. Angå siRNA TMPRSS2-ERG variant IV, bare siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) viste en reduksjon i ERG proteininnhold. Som for den tidligere siRNA, ble den høyeste knockdown effektivitet observert etter 72 timer (Figur 1a).
VCap-celler ble transfektert i 24 timer, 48 timer og 72 timer med 50 nM av sirnas TMPRSS2-ERG III (1, 2, 3 ), sirnas TMPRSS2-ERG IV (1, 2), siRNA mot ERG villtype eller siRNA Control. en. Western blot analyse: uttrykk for ERG protein oppdaget av Western blot viste effekten av sirnas mot TMPRSS2-ERG, ERG villtype eller siRNA Control. GAPDH ble benyttet som intern kontroll (bilder er representative for tre uavhengige eksperimenter). b. MTT celleviabilitet analysen: VCap-celler ble transfektert med siRNA TMPRSS2-ERG III (1, 2), TMPRSS2-ERG IV (1) og siRNA kontroll ved 50 nM konsentrasjon og inkubert i 72 timer. Barer representerer gjennomsnitt ± SD av 2 selvstendige eksperimenter som inneholder 8 replikater for hver tilstand. Antall levedyktige celler ble målt og 100% celleviabilitet svarer til antallet av levende celler inkubert bare med transfeksjon av middel. *** =
p
0,001, betydelig nedgang sammenlignet med ubehandlede celler eller siRNA kontroll (Kruskal Wallis fulgt av Tukey og Dunnet test).
For å forstå de biologiske virkningene av oncogenet knockdown, vurderte vi levedyktigheten etter transfeksjon av siRNA [siRNA TMPRSS2-ERG III (1 og 2), IV og siRNA Control] ved 50 nM konsentrasjon i VCap-celler. Som vist i figur 1b, MTT-analyser viste en signifikant inhibering i vekstraten for alle sirnas når sammenlignet med ubehandlede celler (
p
0.0001). Imidlertid vil bare sirnas TMPRSS2-ERG III (1) og IV (1) viste en reduksjon i vekstrate (henholdsvis 20% og 40%) sammenlignet med siRNA kontroll (figur 1b).
Til sammen utgjør disse resultatene viser at både sirnas TMPRSS2-ERG III (1) og TMPRSS2-ERG IV (1) er meget effektive for mRNA og protein hemninger og for å redusere celleveksthastigheten. Derfor ble disse sirnas valgt for ytterligere omfattende undersøkelser og videre utpekt som siRNA TMPRSS2-ERG III og siRNA TMPRSS2-ERG IV, henholdsvis.
Lave konsentrasjoner av siRNA TMPRSS2-ERG III og IV hemme onkogen og oncoproteinet uttrykk, men ikke påvirke cellenes levedyktighet
for å kunne vurdere den optimale konsentrasjon som skal anvendes for ytterligere
in vivo-studier
, undersøkte vi om siRNA TMPRSS2-ERG III og IV kan hemme TMPRSS2-ERG-genet og proteinnivåer ved lavere konsentrasjoner enn 50 nm. RT-qPCR og Western blot ble utført ved 48 timer (tid svarende til den høyeste nedregule aktivitet). Interessant, hemmende effekter av både sirnas TMPRSS2-ERG ble observert starter på 2,5 nM konsentrasjon (
p
0,001, figur 2a RT-qPCR og 2b for Western blot). Deretter cellenes levedyktighet ble også testet etter 72 timer transfeksjon av siRNA TMPRSS2-ERG III, IV og siRNA Styre fra 0,1 til 200 nM konsentrasjon. Av notatet, både sirnas TMPRSS2-ERG III (
p
0.05) og IV (
p
0,001) betydelig hemmet vekst fra 50 nM mens lavere konsentrasjoner ikke påvirker celle levedyktighet og høyere konsentrasjoner ikke øke celledødelighet (figur 2c). Når det gjelder siRNA kontroll, ble en reduksjon i cellelevedyktighet bemerket ved høye konsentrasjoner (100 nM, 150 nM og 200 nM), sannsynligvis på grunn av uønskede toksiske effekter, mens det ikke påvirker cellelevedyktigheten ved 50 nM konsentrasjon. Derfor synes den 50 nM konsentrasjon for å være optimal dose for å oppnå de beste spesifikke effekter i form av genet knockdown effektivitet og celle dødelighet (figur 2).
VCap celler ble transfektert i 72 timer fra 2,5 nM til 50 nM med siRNA TMPRSS2-ERG III, siRNA TMPRSS2-ERG IV eller siRNA Control. en. RT-qPCR analyse: relative TMPRSS2-ERG fusjon varianter III og IV mRNA nivåer ble analysert og sammenlignet med ikke-behandlede celler. Resultatene er normalisert til GAPDH mRNA uttrykk. Barer: gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk. * =
p
0,05; *** =
p
0,001, vesentlig endring sammenlignet med ubehandlede celler ved hjelp av Kruskal Wallis fulgt av Tukey og Dunnet test. b. Western blot-analyse ble brukt for å påvise effekten av siRNA TMPRSS2-ERG III, IV eller siRNA Control på ekspresjon av ERG protein. GAPDH ble benyttet som intern kontroll (bilder er representative for tre uavhengige eksperimenter). c. MTT levedyktighet analysen: siRNA TMPRSS2-ERG III, siRNA TMPRSS2-ERG IV eller siRNA kontroll ble transfektert i 72 timer på ulike konsentrasjoner (0,1 nM-200 nm). Ett hundre prosent cellelevedyktighet svarer til antallet av levende celler inkubert med bare transfeksjon middel. Resultatene er gjennomsnittet ± SD av to uavhengige eksperimenter med 8 replikater for hver tilstand. * =
p
0,05, ** = rapporten
p
0,01, *** =
p
0,001, betydelig reduksjon sammenlignet med ubehandlede celler (TA ) eller siRNA kontroll (Kruskal-amp; Wallis fulgt av Tukey og Dunnet test)
kombinasjon av siRNA TMPRSS2-ERG III og iv ble ikke bedre knockdown effekt og celleveksthemming
Vi så vurdert om kombinasjon av begge siRNAs TMPRSS2-ERG III og siRNA TMPRSS2-ERG IV forbedret TMPRSS2-ERG gen- og protein hemninger. en. b. c. b.
