Abstract
Sikt
Studiet er designet for å vurdere muligheten for å bruke sirkulerende mirnas (serum mirnas) som diagnostiske biomarkører i kolorektal cancer (CRC), og for å identifisere deres mulighet som kandidater for målrettet terapi
Metoder
studien involverte to prøvesett:. 1- et treningssett som inkluderte 90 pasienter med kolorektal relatert sykdom (30 med CRC, 18 med inflammatorisk tarmsykdom (IBD), 18 med colonic polypper (CP) og 24 med forskjellige colonic symptomer, men uten colonoscopic abnormitet som ble innskrevet som kontrollgruppe) og 2- et valideringssett som inkluderte 100 CRC pasienter. Serum mirnas ble hentet fra alle fag for å vurdere uttrykk profiler for følgende mirnas (
MIR-17
,
MIR-18a
,
MIR-19a
,
MIR-19b
,
MIR-20a
,
MIR-21
,
MIR-146a
,
MIR-223
,
MIR-24
,
MIR-454
,
MIR-183
,
MIR-135a
,
speil 135b og speil 92a
) ved hjelp av tilpassede miScript miRNA PCR-basert sybergreen array. Arealet under mottaker drift karakteristikk (AUC) ble brukt til å evaluere den diagnostiske resultatene av de studerte mirnas for tykktarmskreftdiagnose.
Resultater
Dataanalyse av miRNA fra treningssettet viste at ; sammenlignet med kontrollgruppen, bare
Mir-19b
var signifikant oppregulert hos pasienter med IBD gruppe (endring = 5,24, p = 0,016), mens hos pasienter med colonic polypper,
MIR-18a
var signifikant oppregulert (endring = 3,49, p-verdi = 0,018). På den annen side,
MIR-17
,
MIR-19a
,
MIR-20a og Selge
MIR-223
signifikant oppregulert ( fold change = 2.35, 3.07, 2.38 og 10.35, henholdsvis, og p-verdi = 0,02, 0,015, 0,017 og 0,016,. henholdsvis i CRC pasienter Men valideringssettet viste at bare
MIR-223
var betydelig opp -regulated i CRC pasienter (endring = 4,06, p-verdi = 0,04).
Konklusjon
Aberrant miRNA uttrykk er sterkt involvert i kaskade av kolorektal kreftutvikling. Vi har funnet at (
MIR-17
,
MIR-19a
,
MIR-20a og MIR-223
) kan brukes som diagnostiske biomarkører for CRC. på den annen side,
MIR-19b Hotell og
MIR-18a
kunne brukes som diagnostiske biomarkører for CP og IBD henholdsvis
Citation. Zekri A-RN, Youssef ASE-D, Lotfy MM, Gabr R, Ahmed OS, Nassar A, et al (2016) Sirkulasjons Serum mirnas som diagnostiske markører for tykktarmskreft PLoS ONE 11 (5):.. e0154130 doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130
redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA
mottatt: 8 november 2015; Godkjent: 10 april 2016; Publisert: 02.05.2016
Copyright: © 2016 Zekri et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Dataene er tilgjengelig fra figshare på følgende link: https://figshare.com/articles/Circulating_serum_miRNAs_as_diagnostic_markers_for_colorectal_cancer/3084625.
Funding: Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en av de vanligste ondartede svulster over hele verden, som er den andre i hunner og den tredje hos menn med 1,2 millioner årlige nye tilfeller på verdensbasis [1]. Til tross for økt bevissthet samt forbedret screening anbefalinger og teknikker, forblir CRC den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn og kvinner [2] og være ansvarlig for 10% av kreftrelatert dødelighet på verdensbasis [3].
Det har tidligere blitt adressert at pasienter med inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er vanligvis forbundet med en økt risiko for progresjon til epitelial dysplasi og CRC [4, 5].
mirnas representerer en interessant klasse av små (18-25 nukleotider lang) ikke-kodende RNA som fungerer som posttranskripsjonelt regulatorer av gen-ekspresjon ved binding til de 3`untranslated regioner (UTR) av mål- mRNA og fremme mRNA degradering eller translasjonsbevegelse undertrykkelse [6]. Det faktum at mirnas spille en rolle i cancerbiologi ble støttet ved å finne at mer enn 50% av miRNA gener er lokalisert ved den skjøre områder og områder av delesjon eller amplifikasjoner, som er endret på ulike typer av kreft hos mennesker [7]. Akkumulert bevis indikerer at noen mirnas kan oppføre seg enten som oncomirs eller tumorsuppressorgener i kaskade av CRC.Therefore, har de potensiale til å bli brukt som diagnostiske, prognostiske eller terapeutiske tumor markører [8].
Ulike studier har rapportert betydelige endringer av miRNA uttrykk nivåer i CRC vev i forhold til normal colonic epitel, og identifisert grupper av mirnas som gjør det mulig prognostisk lagdeling av CRC pasienter [9]. I denne sammenheng, økt uttrykk av mange miRNAs, som formidler cellevekst og tumorprogresjon, ble rapportert i blodet og /eller vev av CRC tilfeller ved hjelp av en miRNA microarray analyse som
inkludert Mir-20
,
MIR-21
,
MIR-17-5p
,
Mir-15b
,
MIR-181b
,
MIR-191 og MIR-200c
[10, 11]. Tilstedeværelsen av miRNAs i serum, plasma og andre kroppsvæsker som urin, spytt, og fostervannet oppfordret mirnas forskning siden dette letter deres oppdagelse og gjør dem ideelle kandidater som ikke-invasive biomarkører for tidlig deteksjon og overvåking sykdomsprogresjon [12].
Formålet med studien er å vurdere rollen til avvikende miRNAs uttrykk i utvikling og progresjon av CRC tilfeller. Dette ble gjort gjennom å studere uttrykket nivåer av 14 mirnas på ulike stadier av tykktarmskreft kaskade. Den rasjonelle for valg av studerte 14 mirnas var basert på tidligere referanser som illustrert sin rolle i kolorektal kreftutvikling (S1 tabell).
Pasienter og metoder
Studiedesign
To uavhengige prøvesettene ble inkludert i denne studien (treningssettet og valideringssettet). Treningssettet inkluderte 90 pasienter som deltok på gastrointestinal endoskopi enhet av tropisk medisin avdeling, Kasr El-Aini School of Medicine, Kairo Universitet; i perioden fra januar 2011 til mars 2012. Basert på colonoscopic resultater og histopatologisk undersøkelse av de studerte tilfellene pasientene ble klassifisert i fire grupper; 30 pasienter med CRC, 18 med inflammatorisk tarmsykdom (IBD), 18 med colonic polypper (CP) og 24 med forskjellige colonic symptomer, men uten colonoscopic unormalt som fungerte som en kontrollgruppe. Valideringssett inkludert 100 CRC saker, som ble diagnostisert og behandlet National Cancer Institute, Kairo Universitet i perioden fra januar 2013 til mars 2014. En skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient etter godkjenning av de etiske komiteer av NCI ( National Cancer Institute), Kairo universitet. IRB-medlemmer er professor Ahmed Morsi Mostafa, prodekan for høyere utdanning og forskning; Prof.Wahid Yousry, leder for kirurgisk onkologi Dept .; Prof. Emad El-Gemaei, Head of Pathology Dept .; Prof. Rabab Gaafar, Head of Medical Oncology Dept .; Prof. Mahmoud El Gebaly, leder for clincal Pathology Dept .; Prof. Mervat El Nagar, leder for Strålebehandling Dept .; Prof. Sabry Shaarawy, Head of Cancer Biology Dept .; Prof. Ikram Hamed, leder for Radiodiagnosis Dept .; Prof. Mai Helali, leder for Anathesia og smerte kontroll Dept .; Prof. Nelly Hassan, leder for Cancer Epidemiology og biostatistikk Dept.and Dr. Atef Badran, Senior of Clinical Data Manager. Organisasjon No.IORG0003381. IRB NO.IRB00004025.
Serumprøver samling
Fra hver pasient og kontroll emnet, ble oppnådd 5 ml venøs blod, sentrifugert og serum ble separert. Alle serumprøver ble lagret ved -80 ° C inntil den ble brukt.
RNA-ekstraksjon og QRT-PCR
Totalt RNA inkludert mirnas ble ekstrahert fra serum ved hjelp av miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland, Cat . No.217004). Ifølge produsentens instruksjoner, ble c-DNA syntese utføres ved hjelp miScript II RT kit (Qiagen, Cat. No.218161). Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) ble utført ved hjelp miScript syber grønt PCR kit (Qiagen, Cat. No.218075). Genuttrykk profiler ble generert i 96-brønners matriser ved hjelp av tilpassede miScript miRNA PCR matrise for følgende microRNAs (
MIR-17
,
MIR-18a
,
MIR-19a
,
Mir-19b
,
MIR-20a
,
MIR-21
,
MIR-146a
,
MIR-223
,
MIR-24
,
MIR-454
,
MIR-183
,
speil 135a
,
speil 135b og MIR – 92a
) plakater (Qiagen, Cat No. CM1HS0064C) i henhold til produsentens instruksjoner som følger: 15 min ved 95 ° C i en syklus, 15s ved 94 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C. og 30-årene ved 70 ° C i 40 sykluser ved hjelp av AB 7500 Fast real-Time PCR system. Terskel sykkel data ble analysert ved hjelp av RT2 Profiler (versjon 3.4, SABiosciences). Relative genekspresjon nivåer ble normalisert til husholdningsgenet (SNORD 68) og brette endringer av målgenet (e) ekspresjon i forhold til de i kontrollgruppen ble analysert ved hjelp av den to-ΔΔCT metode.
Statistisk analyse
den relative uttrykk for miRNAs ble analysert ved hjelp av SABiosciences programvare og p-verdien ble beregnet på grunnlag av en t-test av de replikere 2 ^ (- Delta Ct) verdier for hvert gen i kontroll- og behandlingsgrupper. P-verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Mottaker-drifts-karakteristikk (ROC) kurver og arealet under kurven (AUC) ble brukt for å vurdere den diagnostiske nøyaktigheten av serum miRNAs. De relevante clinicopathological funksjoner ble bestemt av en vei ANOVA for kvantitative data og X
2 test for kvalitative data. Alle testene var to-sidig og p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistisk analyse ble støttet seg på SPSS 17,0 programvare (SPSS Ltd, UK) og grafer ble generert med Graph pad Prism 5.0 (Graf pad Software Inc, USA).
Resultater
Kliniske funksjoner i studerte grupper
Når det gjelder treningssettet, gjennomsnittsalderen av CRC pasienter (51,10 ± 10) var betydelig høyere enn andre grupper (p-verdi 0,05). Men ingen signifikant forskjell ble rapportert mellom gjennomsnittsalderen for kontrollgruppen (43,7 ± 14,2) og de med CP (40,00 ± 15,0) og IBD (41,6 ± 15,4) eller sex for alle grupper (p-verdi 0,48) . I tillegg var det statistisk signifikante forskjeller mellom de undersøkte gruppene i forhold til magesmerter, slim, vekttap, anemi og (p-verdi 0,05). Angåvalideringssettet, var det ingen signifikant forskjell mellom gjennomsnittsalderen for CRC-gruppen (46,7 ± 14,5) og kontrollgruppen (43,7 ± 14,2) eller sex mellom de to gruppene. Men det var statistisk signifikante forskjeller mellom CRC gruppen og kontrollgruppen i forhold til magesmerter, slim, tap av vekt, og anemi (p-verdi 0,05). Som vist i (tabell 1)
Differensial uttrykk for de studerte miRNAs i de undersøkte gruppene sammenlignet med kontrollgruppen i opplæringen satt
Blant alle studert mirnas, bare
Mir-19b
var signifikant oppregulert i IBD gruppen (endring = 5,24, p-verdi = 0,016) (fig 1 og tabell 2), mens
MIR-18a
var betydelig opp regulert i CP gruppen (endring = 3,49, p-verdi = 0,018) (fig 2 og tabell 3) og
MIR-17
,
MIR-19a
,
MIR-20a og MIR-223
signifikant oppregulert i CRC gruppen (endring = 2.35, 3.07, 2.38 10,35 og p-verdi = 0,021, 0,015, 0,017 0,0166 henholdsvis). som vist i (figur 3 og tabell 4)
A) Volcano plottet viser differensial uttrykk for 14-miRNAs i IBD gruppen versus kontrollgruppen.
Mir-19b
ble betydelig opp regulert. B) ROC kurven analyse av
Mir-19b
mellom IBD gruppen og kontrollgruppen.
A) Volcano plottet viser differensial uttrykk for 14-miRNAs i colonic polypper gruppen versus kontrollgruppen.
MIR-18a
ble betydelig opp regulert. B) ROC kurven analyse av
MIR-18a
mellom colonic polypper gruppen og kontrollgruppen.
MIR-17
,
MIR-19a
.
MIR-20a og MIR-233
var betydelig opp regulert. B) ROC kurven analyse av
MIR-17
,
MIR-19a
.
MIR-20a og MIR-233
mellom CRC gruppen og kontrollgruppen. C) Den clustergram utfører hierarkisk clustering av hele datasettet for å vise et kart varmen med dendrogrammer indikerer co-regulert gener på tvers av kontroll, IBD, colonic polypper og CRC gruppene henholdsvis.
Ved å sammenlikne den CRC-gruppen (ondartet) sammenlignet med de andre gruppene (ikke-ondartet); bare MIR-223 var betydelig opp regulert (endring = 4,49, p-verdi = 0,002) som vist i (tabell 5).
Men bare
MIR-135b Hotell og
MIR-454
var signifikant nedregulert i CRC gruppen sammenlignet med IBD gruppen (endring = 0,24 0,44 og p-verdi = 0,023 0,018 henholdsvis), som vist i S2 tabell. Mens
MIR-135a Hotell og
MIR-135b
var signifikant nedregulert i TF-gruppen sammenlignet med IBD gruppen (fold henholdsvis endring = 0,12, 0,09 og p-verdi = 0,019 og 0,018 ) som vist i S3 tabell.
Differensial uttrykk for de studerte miRNAs i CRC-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen i valideringssettet
Blant alle studert mirnas, bare
MIR-223
var signifikant oppregulert i CRC gruppen (endring = 4,06, p-verdi = 0,04) som vist i (tabell 6). Ved å splitte CRC pasienter fra valideringen satt inn i mannlige og kvinnelige grupper; vi fant ut at
MIR-19a
,
Mir-19b
, og
MIR-20a
ble betydelig opp regulert i kvinnelige CRC pasienter sammenlignet med kontrollgruppen (endring = 2,8, 4,1 2,2 og p-verdi = 0,021, 0,023 0,04 henholdsvis) som vist i tabell S4. På den annen side, bare
MIR-17
var signifikant oppregulert i de mannlige CRC-pasienter sammenlignet med kontrollgruppen (endring = 2,1, p-verdi = 0,03) som vist i tabell S5.
ROC kurven analyse av forskjellig uttrykt mirnas
for å skille CRC gruppe fra kontrollgruppen; vi har funnet ut at
MIR-223 plakater (AUC 0,838), MIR-17 (AUC 0,813),
MIR-19a plakater (AUC 0,825) besatt høyere diagnostisk ytelse enn
MIR-20a product: (AUC 0,788). På den annen side,
MIR-18a
(AUC 0,8) viste god diagnostisk ytelse i å skille den IBD gruppe fra kontrollgruppen. Også,
Mir-19b plakater (AUC 0,875) viste god diagnostisk ytelse i den diskriminerende CP gruppe fra kontrollgruppen som vist i (tabell 7).
Diskusjoner
Vår studie vurderte muligheten for å bruke ulike sirkulerende mirnas som serologiske biomarkører for påvisning av CRC. Vår studie var riktig utformet for å inkludere saker på ulike stadier av kolorektal relaterte sykdommer dvs. pasienter med inflammatorisk tarmsykdom (IBD), adenomatøse colonic polypper (CP) og CRC.
Våre resultater viste at det var signifikant oppregulering av
MIR-17
,
MIR-19a
,
MIR-20a Hotell og
MIR-223
i CRC gruppen sammenlignet med kontrollgruppen.
MIR-17
,
MIR-20a og MIR-19a
er medlemmer av polycistronic
miR17-92
klynge (
MIR-17
,
MIR-18a
,
MIR-19a
,
Mir-19b
,
MIR-20a
,
og MIR-92A
) som ligger på 13q31.3; en locus som ofte forsterkes i kolorektal cancer [13, 14]. Våre funn om betydelig oppregulering av
MIR-20a
kom i samsvar med tidligere resultater av Xu et al., Som fant at oppregulering av
MIR-20
var assosiert med svulst invasjon og lymfeknutemetastase av HCC pasienter [15]. Så,
MIR-20a
kan ha en potensiell svulst onkogen funksjon i CRC. I tillegg
MIR-20a
fremmer epitelial til mesenchymale overgang (EMT), et viktig steg i metastase, gjennom målretting tumor suppressor genet (vev hemmer matriksmetalloproteinase 3 (TIMP3)); negativ regulator av matriks metalloproteinase 2 (MMP2) og matriks-metalloproteinase-9 (MMP9) som mediert ekstracellulære matriks (ECM) degradering [15]. Også rettet MIR-20a aktiverings medlemmer av
E2F
familie, inkludert cellesyklus og apoptose regulatoriske gener, som fører til G1-S faseovergangen. Men høye nivåer av E2F proteiner, spesielt E2F1 kan indusere apoptose som fungerer som en nødbrems i over prolifererende celler. Den onkogene funksjon av
MIR-20a
ble foreslått for å hindre denne nødbremsen funksjon av E2F faktorer, og dermed stimulere tumorvekst [16]. Videre
MIR-20a
styrer cellesyklusprogresjon gjennom målretting cyclin-avhengige kinaser, CDKN1A /p21; viktig regulator av G2 /S overgang [17]. Videre rettet MIR-20a tumor suppressor PTEN; som er en negativ regulator av onkogent prosurvival PI3K \\ AKT-reaksjonsveien [18, 19]. Våre data om oppregulering av
MIR-17a Hotell og
MIR-19a
i CRC pasienter er sammenlignbare med tidligere rapporter i litteraturen [9, 16-19]. I likhet med
MIR-20a
,
MIR-17a
ble vist å fremme cellesyklusprogresjon gjennom målretting CDKN1A /p21 og E2F [16, 17], mens onkogene potensialet i
MIR -19a
oppnås hovedsakelig gjennom målretting PTEN; dermed fremme onkogene pro-overlevelse vei [9, 18-20].
Våre data om
Mir-223
enn uttrykk i CRC gruppen er konkordant med de av Huang
m.fl.
som vurderte uttrykket nivåer av mirnas i plasma på 100 CRC pasienter og hos 37 pasienter med kolon adenomer, sammenlignet med 59 friske individer. Blant deres panel ble 12 mirnas opp regulert, inkludert
MIR-223 product: [21]. Tilsvarende Li
et al
. rapporterte at overekspresjon av
MIR-223
i neoplastiske colonic vev i forhold til de tilstøtende ikke-kreft dem [22]. Den onkogene funksjon av
MIR-223
i CRC ble oppnådd gjennom målretting FOXO1 [23] og RASA1 [24]. FOXO1 er medlem av FOX transkripsjonsfaktorer-O underfamilie. Den regulerer transkripsjonen aktivitet av forskjellige gener, inkludert p21, og således inhiberer celle-syklusprogresjon [25, 26] .På den annen side, RASA1, en RAS signale terminator, er assosiert med tumorprogresjon [27]. Videre Li
et al
. viste at
MIR-223
kan anses som en dårlig prognostisk markør siden det er over uttrykk korrelerer signifikant med høy TNM stadium, nodal og fjernmetastaser, samt med reduserte totale overlevelses [22]. Våre data viser også at betydelig oppregulering av
MIR-18a
hos pasienter med CP sammenlignet med kontrollgruppen. Våre resultater støtter en tidligere rapport fra Wu et al, [28] som viste at
MIR-18a
spiller en onkogen rolle i kolorektal kreftutvikling gjennom nedregulering av Ataxia telangiectasia mutert gen (ATM).; et viktig enzym i reparasjon av DNA dobbelttrådbrudd. I tillegg phosphorylates det flere viktige proteiner som starter aktivering av DNA-skade sjekkpunkt, som fører til cellesyklus arrest, DNA-reparasjon eller apoptose [29].
Som for
Mir-19b
, betydelig oppregulering ble rapportert hos pasienter med IBD sammenlignet med kontrollgruppen. Jiang et al. viste at både
miR17 Hotell og
Mir-19b
, som tilhører
MIR-17-92
klynge, hemmer Treg celledifferensiering og fremme Th1 respons [30]. Th1 er ansvarlig for den pro inflammatorisk respons via sekresjon av IL12, IL2, IL6, IFN og TNF [31]. Sistnevnte (TNF) spiller en viktig rolle i inflammasjonsprosessen gjennom aktivering av NF-kB veien; en prototypiske pro-inflammatoriske signalveien [32]. Den mulige mekanistisk rolle betydelige miRNAs i Barnekonvensjonen, IBD og colonic polypper grupper sammenlignet med kontrollgruppen og deres nedstrøms mål ble illustrert i den foreslåtte tegnefilm (fig 4).
Røde stjerne indikerer betydelig miRNA i CRC mens gul stjerne indikerer vesentlige miRNA i IBD og grønn stjerne indikerer miRNA i colonic polypper. Pilen indikerer aktiveringen mens sirkelen på slutten av linjen viser hemming.
Røde stjerne indikerer betydelig miRNA i CRC mens gul stjerne indikerer betydelige miRNA i IBD og grønn stjerne indikerer miRNA i colonic polypper. Pilen indikerer aktiveringen mens sirkelen på slutten av linjen viser hemming.
Videre analyse av data ved hjelp av (ROC) analyse kurve og tilsvarende arealet under kurven ble forsøkt for de betydelige mirnas i hver parvise sammenligningen å undersøke deres diagnostisk nøyaktighet. ROC kurve analyse av enkelt mirnas avdekket at
MIR-17
,
MIR-19a
,
MIR-20a MIR-223
effektivt kan skille mellom de CRC-gruppen og kontrollgruppen. Men
MIR-18a
viste god diagnostisk nøyaktighet i diskriminerende CP gruppe fra kontrollgruppen. På den annen side,
Mir-19b
viste god diagnostisk nøyaktighet i diskriminerende IBD gruppe fra kontrollgruppen.
I konklusjonen
Aberrant miRNA uttrykk er sterkt involvert i kaskade av kolorektal kreftutvikling. Vi har funnet ut at (
MIR-17
,
MIR-19a
,
MIR-20a Hotell og
MIR-223
) kan brukes som diagnostisk biomarkører for CRC. På den annen side,
Mir-19b Hotell og
MIR-18a
kunne brukes som diagnostiske biomarkører for henholdsvis CP og IBD.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Den rasjonelle for å velge de studerte 14 mirnas basert på tidligere referanser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130.s001 plakater (DOC)
S2 Table. Differential uttrykk for de studerte miRNAs i CRC gruppe versus IBD gruppe
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130.s002 plakater (DOC)
S3 Table. Differential uttrykk for de studerte miRNAs i CP-gruppen i forhold IBD gruppe
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130.s003 plakater (DOC)
S4 Table. Differential uttrykk for de studerte miRNAs i kvinnelig CRC gruppen versus kontrollgruppen «Validation Set»
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130.s004 plakater (DOC)
S5 Table. Differential uttrykk for de studerte miRNAs i mannlige CRC pasienter versus kontrollgruppen «Validation Set»
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154130.s005 plakater (DOC)
Takk
Vi erkjenner Yasser Mabrouk Bakr for hans råd om den statistiske analysen.
