Abstract
Bakgrunn
Rapid pålitelig diagnostikk av DNA mutasjoner er svært ønskelig i forskning og kliniske tester. Dagens utvikling på dette feltet går samtidig i to retninger: 1) high-throughput metoder, og 2) bærbare analyser. Ikke-enzymatiske metoder er attraktive for begge typer av metoder siden de ville tillate hurtig og forholdsvis billig påvisning av nukleinsyrer. Moderne fluorescens mikroskopi er å ha en stor innvirkning på påvisning av biomolekyler ved tidligere uoppnåelig oppløsning. Men ingen enkle metoder for å påvise DNA i en ikke-enzymatisk måte fluorescens mikroskopi og nukleinsyreanaloger har blitt foreslått så langt bruker.
Metoder og resultater
Her rapporterer vi en roman enzym-free tilnærming for å effektivt oppdage kreft mutasjoner. Denne analysen inkluderer gen-bestemt mål berikelse fulgt av gløding til oligonukleotider som inneholder låste nukleinsyrer (LNAs) og til slutt, deteksjon av fluorescens mikroskopi. LNA inneholder prober vise høy bindende affinitet og spesifisitet til DNA inneholder mutasjoner, som gjør det mulig for påvisning av mutasjon overflod med en interkalerende EvaGreen fargestoff. Vi brukte en andre probe, noe som øker det totale antall basepar, for å fremstille en høyere fluorescens-signal ved å inkorporere flere fargestoffmolekyler. Faktisk viser vi her at bruk EvaGreen fargestoff og LNA prober, genomisk DNA inneholder
BRAF
V600E mutasjon kunne påvises ved fluorescens mikroskopi ved lave femtomolar konsentrasjoner. Spesielt, dette var minst 1000 ganger over den potensielle deteksjonsgrensen.
Konklusjon
Totalt romanen analysen beskriver vi kan bli en ny tilnærming til raske, pålitelige og enzymfritt diagnostikk av kreft eller andre tilknyttede DNA-mål. Viktigere er støkiometrien av villtype og mutante mål konservert i vår analyse, noe som gir mulighet for en nøyaktig estimering av mutant overflod når påvisningsgrensen kravet er oppfylt. Ved hjelp av fluorescens mikroskopi, presenterer denne tilnærmingen muligheten til å oppdage DNA på enkelt-molekyl oppløsning og direkte i biologisk prøvemateriale
Citation. Miotke L, Maity A, Ji H, Brewer J, Astakhova K (2015 ) enzym-Free Påvisning av mutasjoner i kreft DNA bruke syntetiske oligonukleotid prober og Fluorescensmikroskopi. PLoS ONE 10 (8): e0136720. doi: 10,1371 /journal.pone.0136720
Redaktør: Thomas Abraham, Pennsylvania State Hershey College of Medicine, USA
mottatt: May 19, 2015; Godkjent: 07.08.2015; Publisert: 27 august 2015
Copyright: © 2015 Miotke et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering. den Augustinus Foundation (. Grant No. 95 305 73 949, https://www.augustinusfonden.dk/) er anerkjent for finansiering AM og KA (reagenser for LNA probe syntese og fluorescensmikroskopi, analyse utvikling og dataanalyse). Forfatterne erkjenner også at HJ og LM ble støttet av en stipendiat Grant, RSG-13-297-01-TBG fra American Cancer Society (https://www.cancer.org/). HJ fikk ekstra støtte fra Doris Duke Clinical Foundation Klinisk Scientist Development Award (https://www.ddcf.org/programs/medical-research/goals-and-strategies/build-the-clinical-research-career-ladder/clinical-scientist-development-award/) og en Howard Hughes Medical Institute Early Career Grant (https://www.hhmi.org/). Forfatterne erkjenner også støtte fra National Institutes of Health P01 HG000205 (HJ; https://www.nih.gov/~~number=plural). Tilskuddene fra American Cancer Society og National Institutes of Health støttet utformingen av sondene, genomisk pre-berikelse, kreft cellelinje arbeid og analyse av data
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Single-nukleotid polymorfismer (SNPs) og varianter (SNVs) er den viktigste kilden til genetisk variasjon i menneskelige genom og andre arter [1]. Derfor er pålitelig deteksjon av SNPs og SNVs en viktig klinisk og translasjonell forskning verktøyet. Noen av de mange bruksområder er resistens analyse ved virus genomer og kreft forbundet somatisk DNA-forandringer [2]. En human cancer-genet i særdeleshet,
BRAF
eller v-Raf murin sarkom viral onkogen homolog B, koder for det protein B-Raf [3]. Mer formelt kjent som serin /treonin-protein kinase B-Raf, påvirker dette proteinet intracellulær signalering og er involvert i regi cellevekst [3]. Mutasjoner i
BRAF
har vært innblandet i noen menneskelige kreftformer, særlig melanom [4]. Forresten, har flere medikamenter blitt utviklet som behandler kreft drevet av
BRAF
, hvorav to, vemurafenib og dabrafenib, er nå FDA godkjent for behandling av sent stadium melanom [5,6]. Aktuelle metoder for påvisning av mutasjoner i
BRAF
fag biopsiprøver til PCR og /eller sekvensering. En mindre invasiv tilnærming oppdager
BRAF
mutasjoner direkte i sirkulerende tumor DNA (ctDNA) hentet fra pasientens plasma [7]. Men siden ctDNA er til stede i svært lave konsentrasjoner (100-300 molekyler pr 100 ul analytt), svært sensitive og spesifikke deteksjonsteknikker må bli benyttet [8].
Generelt utvikling innen SNP /SNV diagnostikk går samtidig i to retninger: 1) high-throughput metoder, og 2) bærbar, lett å håndtere analyser [8,9]. Høy throughput sekvensering og polymerase-kjedereaksjon (PCR) er dagens metoder for valg for forskning på kreft og infeksjonssykdommer i utviklede land [9]. Mer tilgjengelige teknikker for rask point-of-care diagnostikk i fravær av sekvensering og PCR er tiltalende. Videre må alle high-throughput teknikker som er utviklet til dags dato anvende enzymer for å oppnå den nødvendige sensitivitet og spesifisitet ved påvisning [9]. Enzymer øker risikoen for feil under analysen og påvirker støkiometrien for målrettet mutasjon i forhold til villtype-analog [10]. Dermed vil alle metoder av nukleinsyrer deteksjon og kvantifisering dra nytte av alternative enzymfritt strategier [9,10].
En ideell, lett-å-håndtere diagnostisk av SNP /SNV er en enkel robust analysen med minimal trinn, høy følsomhet og repeterbarhet ved lave omkostninger [9]. Med disse mål i tankene, en fast bærer eller i væskesystemet ved hjelp av optiske og elektrokjemiske metoder er ideell [11]. Fluorescens er en praktisk optisk deteksjonsmetode som er bredt anvendt i både moderne state-of-the-art og bærbare diagnostiske analyser [9]. Spesielt er den siste utviklingen i fluorescerende mikros ha en stor innvirkning på deteksjon av biomolekyler
in vitro Kjøpe og
in vivo product: [12,13]. Mikroskop teknikker har gjort tidligere uoppnåelig enkelt-molekyl deteksjon tilgjengelig. Dette gir en mulighet til å unngå enzymer når det oppdages biomolekyler
in vitro Hotell og en sjanse til å overvåke mål
in vivo product: [9-13].
For å oppdage SNP /SNVs på meget lave konsentrasjoner, sterkt spesifikke og sensitive sonder må brukes. En tilnærming er å plassere låst nukleinsyrer (LNAs) med direkte festet fluoroforer til korte oligonukleotider [14]. Disse typer LNA /DNA-fangst sonder er for tiden brukes i enzymatisk genotyping av SNPs i en microarray format og PCR-baserte teknikker [15]. Nylig lanserte vi fluorescensmerkede LNA derivater som et lovende verktøy i avansert genotyping, for eksempel resistens testing av svært polymorfe HIV-1 protease [16]. Men syntese av fluorescensmerkede prober er mer kostbart og arbeidskrevende enn det som er nødvendig for point-of-care applikasjoner. En mer enkel sonde design kan anvende effektive hybridiserings-egenskaper av LNA /DNA-oligonukleotider i forbindelse med en robust, fluorescerende interkalerende fargestoff slik som EvaGreen. I løpet av det siste tiåret innføyings fargestoffer har blitt brukt i enzymatiske teknikker på nukleinsyre deteksjon [2-5]. I denne artikkelen valgte vi EvaGreen fargestoff på grunn av den påviste kontrasten mellom lyse signal det avgir når den er bundet til dobbeltkjedet DNA og seig fluorescens signal med enkelt-trådede prøvene [17].
Heri beskriver vi en ny analyse for rask enzym-fri påvisning av
BRAF
V600E mutasjon (T → A ved genet posisjon 1799) i menneskelig DNA (fig 1). Vi først berike target DNA ved hjelp av et gen bestemt 120mer berikelse sonde, fulgt av fluorescerende deteksjon med EvaGreen fargestoff og andre mutasjon bestemt, kortere LNA /DNA-fangst probe. Ved å bruke serielle fortynninger av mutant /cellelinje DNA blandinger villtype, viser vi at denne romanen analysen er svært potent for fluorescerende sensing av en klinisk relevant SNP ved lave konsentrasjoner og høy sample kompleksitet. Dessuten beviser vi at ved påføring av fluorescens mikroskopi kan vi spesifikt å påvise lave femtomolar og attomolar konsentrasjoner av DNA inneholdende mål-mutasjonen
De viktigste trinn i LNA /DNA-analyse:. 1) binding til genspesifikke capture probe, 2) vasking og spalting fra støtte, 3) tilsetning av signal-styrke LNA /DNA-probe og interkalerende fargestoff, 4) fluorescensdeteksjon. B = biotin, S = streptavidin, CPG = kontrollert pore glass, L = LNA.
Materialer og metoder
Generelt
reagenser oppnås fra kommersielle leverandører ble brukt som anvist. LNA fosforamiditt reagenser og EvaGreen fargestoff (20X i vann) ble oppnådd fra Exiqon og Biotium, respektivt. Umodifiserte og biotinylerte DNA-trådene ble kjøpt fra IDT og brukes etter HPLC rensing.
Detaljer om oligonukleotid syntese, karakterisering og termiske denaturering studier er gitt i S1 bilag.
Genomisk DNA
Genomisk DNA fra cellelinjer LS411N og HT29 ble hentet direkte fra leverandør (ATCC, kataloger nr. CRL-2159 og HTB-38, henholdsvis), og ekstrahert ved hjelp av Qiagen DNeasy vevskultur utvinning system per produsentens retningslinjer (Qiagen). HMC-1 (human hann-kontroll) ble oppnådd fra Promega [18]. Produktet ble oppsluttet i 12 timer ved 37 ° C ved bruk av EcoRI (New England Biolabs), og felt ut fra etanol. Lengde på fragmenter ble målt ved hjelp av Agilent BioAnalyzer DNA 7500 kit som gir en verdi på ca. 7000 bp.
Pre-anriking av
BRAF
genet fragment.
Pre-anriking av genomisk DNA ble utført ved hjelp av XGEN Lockdown kit (IDT), 120mer
BRAF
-spesifikk probe merket med biotin (IDT), og streptavidin-belagte magnetiske kuler (Dynabeads-M270, Life). Den 120mer probe er designet for å overlappe
BRAF
V600E region (stilling V600E mutasjon er underlined):
5’-ACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAA
AATCACCTATTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGG-(biotin-C6)-3’
Pre-digested genomisk DNA og biotinylert 120mer probe ble inkubert i 5 timer ved 60 ° C etterfulgt av feste til magnetiske kuler, flere vasketrinn og løsgjøring av varme som foreslått av leverandøren (IDT, oppvarming til 92 ° C i 10 minutter) som et resultat. , enkelttrådet DNA ble oppnådd.
Solid-støtte hybridisering analysen.
DNA-konsentrasjonen ble beregnet ved hjelp av molekylvekten og Livet Technologies DNA kopiere nummer kalkulator tilgjengelig på deres hjemmeside. Dermed 50 fM av ss DNA-fragmenter (lengde 5000 nt) samsvarer med 3×10
6 molekyler pr 100 ul, eller 1×10
6 molekyler av den samme DNA-fragment i det 100 ul av prøven samsvarer med konsentrasjon 16,6 fM. fast bærer innehold tilsvarende fange probe og mål-DNA (1 ekv.) ble plassert i 1,5 ml Eppendorf-rør inneholdende 100 ul av 1 x PBS-buffer. Den resulterende blanding ble varmet opp i 10 min ved 85 ° C og deretter avkjølt til romtemperatur i løpet av 20 min. Bæreren ble sentrifugert ved 11.000 rpm i 10 minutter, og etter fjerning av supernatanten ble den vasket 2 ganger med 100 pl 1 x PBS ved 37 ° C. Etterpå EvaGreen fargestoff (0.06-0.6X) og det tilsvarende signal-styrke-probe (4 ekv.) Ble hybridisert til støtten (100 ul 1 x PBS, 85 ° C, 10 minutter fulgt av avkjøling til romtemperatur i løpet av 20 min). Fluorescens signal ble opprinnelig analysert ved hjelp av standard laboratorie UV-vis lampe. For analyse i løsning og mikroskopi, ble oligonukleotidene spaltet fra bæreren ved bruk av 32% vandig ammoniakk og methylamin 1: 1 (v /v) i 4 timer ved RT, inndampet og re-glødet i nærvær av EvaGreen fargestoff som beskrevet ovenfor (0.06- 0,6x).
Fluorometri
DNA-mengder (konsentrasjoner og antall molekyler) ble bestemt ved å anvende standard UV-spektrofotometri and Life Technologies DNA kopi antall kalkulator tilgjengelige som beskrevet ovenfor. For gløding ble prober varmet opp i 10 min ved 85 ° C og deretter avkjølt til romtemperatur i løpet av 20 min. Fluorometri studier av de resulterende prøver ble utført ved 19 ° C i 1 x PBS bruker PerkinElmer LS 55 luminescens spektrometer utstyrt med et Peltier Temperatur programmerer, eksitasjon ved 500 nm og opptak emisjon på 530 nm.
Fluorescensmikroskopi
De multiphoton eksitasjon fluorescens mikroskopi målinger ble gjennomført på en tilpasset bygget multiphoton eksitasjon mikroskop [19]. Kort, målet som ble brukt var en 60x vann nedsenking objektiv NA 1,29. Laseren var en Ti: Sa laser (HPeMaiTai DeepSee, Spectra Physics, Mountain View, California) og eksitasjon bølgelengde brukte var 840 nm. Fluorescens signalene ble samlet inn ved hjelp båndpassfiltre Båndpass 525/35 nm (AHF ANALYSEN AG, Tyskland). Detektorene var Hamamatsu H7422P-40 PMTs.
Resultater og Diskusjon
I første omgang har vi designet oppfangingsprober av ulik lengde (9, 11 og 18mers) inneholder tre LNAs i sentrale posisjoner innen sekvensene ( tabell 1). Ifølge vår design, en av LNA enhetene var gratis til potensialet
BRAF
V600E mutasjon (T → A) i målet [16]. Vi undersøkte unikt for hver capture probe CP1-CP3 for hybridisering til målregionen i forhold til hele 3 milliarder bp humane genom ved hjelp av i huset programvare som er tilgjengelig ved Stanford University (S1 tabell) [20]. Således er 9mer og 11mer prober hadde flere bindingsseter i genomet, slik at null, en eller flere uoverensstemmelser, mens 18mer prober (CP3) var helt spesifikke for målet. Som en negativ kontroll, brukte vi en tilsvarende 9mer DNA sekvens brukt i våre tidligere analyser som ikke var gratis til
BRAF
mål (capture probe CP4) [14].
Neste , CP1-CP4 ble fremstilt ved hjelp av automatisert fast-fase oligonukleotidsyntese på kontrollert poreglass (CPG, tabell 1). CP1-CP3 ble syntetisert som både vill-type (w) og mutant (m) varianter til
BRAF
1790-1800 region (dvs. inneholdende nukleotider A og T i posisjon motsatt til basen 1799, henholdsvis). Capture prober ble enten løsrevet fra CPG eller holdt på solid støtte etter syntese (saksdokumenter). Dette tillot oss å utføre analysen både i løsning og på solid støtte som beskrevet nedenfor.
Vi analyserte bindende slektskap CP1-CP3 til fullt komplementære og feilaktige 63 nt BRAF fragmenter i løsning (
T
m verdier, tabell 1). Som forventet, internt plassert LNAs økte smeltetemperatur på alle sondene ved 3,0-4,5 ° C per en LNA innlemmelse. Samtidig målrette spesifisitet ble øket, fordi den Tm ble redusert med 10,0 til 11,0 ° C, i nærvær av en mismatch. Ingen tomannsboliger ble dannet ved temperaturer over 22 ° C for de 9mer oppfangingsprober CP1W, m. Dette tyder på at CP1W, m sonder har høyest potensial til å diskriminere et umake vs. fullt matchet mål. Men dette kan være ledsaget av en mangel på spesifisitet i det humane genom som foreslått av vår sonde unikhet analyse (Hjelpemiddel informasjon). I sin tur, 18mer oppfangingsprober viste høy
T
m verdier for både fullt matchet og avvikende tomannsboliger og 11mer CP2w og CP2m hadde noe mellomliggende verdier (33,5 ° C-34,5 ° C i nærvær av en mismatch). Endelig negativ kontroll CP4 viste ingen binding til målet sekvenser.
Etter å ha studert hybridisering egenskaper LNA /DNA oppfangingsprober, vi brukt dem til påvisning av
BRAF
V600E mutasjon i menneskelige genom DNA (figurene 2 og 3, Tabell 2). Vi har fastslått, ved hjelp av digital PCR (data ikke vist), at de humane cellelinjer HT29 og LS411N hadde en 25,0% og 66,7% overflod av målet mutasjon, henholdsvis [18]. HMC-1-DNA ble anvendt som en 100% villtype kontroll som den hadde ingen mutasjoner. Først må vi pre-beriket DNA ved hjelp av en 120mer
BRAF
spesifikk probe merket med streptavidin som ikke overlapper det område av fangst sonden og således ble universell for både vekt- og mut mål (Fig 1 og materialer og metoder;). Dette trinnet øket konsentrasjon av målet genomfragment, og samtidig forbedret spesifisitet av vår analyse på samme måte som når det blir påført før neste generasjons sekvensering [7-8]. Etter flere vasketrinn og løsgjøring fra de biotinylerte magnetiske kuler, enkeltkjedet
BRAF
fragmenter (7000 nt) ble gjenvunnet i oppløsningen.
Target bindingsspesifisitet resultatene fra forskjellen i smeltetemperatur (
T
m) mellom fullt matchet og avvikende fangst probe: target komplekser. CPG = kontrollert pore glass
(A) Visualisering av
BRAF
V600E mutasjon på solid-støtte inneholder fangst probe CP2m. CP2m: HT29 (02:05, en tube), CP2m : LS411N (02:05, røret 6). Signal er oppnådd under laboratorie UV-vis lampe (eksitasjon ved 365 nm) ved 19 ° C ved hjelp 22:00 signal-styrke sonde og 0,6x EvaGreen fargestoff. (B) Kvantifisering av genomisk
BRAF
mål etter fluorometri i løsning. Target titrering kurver ble oppnådd for fullt komplementære og avvikende komplekser (blå og røde linjer, henholdsvis) av LNA /DNA oppfangingsprober CP2w og CP2m med tilsvarende mål og signal-styrke probe P1: 5′-GCT A + GA CCA + AAA TCA CCT A + TT TTT ACT GTG AG + G TCT TCA TGA AGA + AAT AT-3 «. LNA nukleotidene er merket med pluss før den tilsvarende bokstaven.
Etterpå pre-beriket
BRAF
målene ble glødet til oppfangingsprober CP1-CP4 direkte på solid støtte [ ,,,0],11]. Vi så brukt EvaGreen for å påvise og kvantifisere den dobbelt-trådet DNA. EvaGreen signalet øker proporsjonalt med antall basepar i den dannede dupleks [17]. Som blir sagt, fangst probe: target komplekset var ganske kort (9-18 basepar). For å unngå et svakt signal som tilføres vi en ytterligere LNA /DNA-signal-styrke-sonden komplementær til sekvensen like ved siden av fangst sonden (P1; 50 nt). Denne sonden viste ingen selv folding egenskaper og bundet både villtype og mutant mål universelt (fig 2 og S1 vedlegg). Lengre signal-styrke sonden vil resultere i enda høyere signal økning på målet bindende. Men LNA /DNA-prober av lengden 50 nt er utfordrende å syntetisere og rense. Videre deres mål bindingsegenskaper må bli ytterligere vurdert for å unngå falske positive signal på grunn av f.eks self-folding (papir under forberedelse)
Videre med solid-støttesystem vi var i stand til å dra nytte av
T
m forskjellen mellom helt matchet og feilaktige mål.: probe par (tabell 1). En enkel vasketrinn på
T
m på feilaktige komplekset tillatt oss å eliminere binding av feilaktige sekvensen. Til slutt ble prøven gjen glødet i nærvær av signal-styrke sonde P1 og EvaGreen fargestoff (figurene 1 og 2)
Den faste bæreren inneholdende cancer DNA:. Probe komplekset ble visualisert ved anvendelse av en standard laboratorie-UV-lampe (figur 3 og S2 tabell). Når den mutante spesifikke capture probe ble anvendt, kunne nærværet av mutanten målet være klart påvises med det blotte øye. For ytterligere kvantifisering ble prøven løsnet fra CPG, re-glødet og utsatt for analyse ved fluorometri (figur 3). Vi beregnet konsentrasjonene av vill-type og mutante mål i cancer DNA ved hjelp av en titreringskurven. Dette ble generert med en fluorometri analyse i oppløsning ved anvendelse av en kjent innledende mengde av genomisk DNA i analytt (i mol og antall molekyler), og de samme konsentrasjoner av reagenser som i forsøksanalysen (se Materialer og Metoder). Deteksjonsgrense (LOD) er beregnet som den laveste målkonsentrasjonen som kunne påvises med et signal-til-støy-forhold over 3 [14]. Derfor etablerte vi LOD verdi av 50 fM genomisk DNA ved hjelp av konvensjonelle fluorometri (tabell 2, se Materialer og metoder for detaljer om beregning).
Når man sammenligner resultatene mellom oppfangingsprober CP1-CP3, viste 11mer CP2 den høyeste diskriminering av feilaktige mål og samtidig opprettholde god binding spesifisitet (fig 3). I motsetning til dette, de lengre CP3 probene viste tilsvarende signal for fullt passet og umake komplekser, siden dupleks ble fortsatt dannet ved temperaturen for analysen (tabell 1 og fig S1). Ved hjelp av CP2m, vi også oppnås høy nøyaktighet for overflod kvantifisering av cellelinjen LS411N (67,2% -67,7% bestemt ved vår analyse sammenlignet med 66,7% bestemt ved digital PCR). Men den nedre mutant overflod i HT29-DNA ble påvist med vår analyse på et høyere nivå feil sammenlignet med LS411N (avvik fra ~ 8% vs. ≤ 1%, henholdsvis). Mest sannsynlig dette var forårsaket av utslipp signal av mutanten målet i HT29 er under vår pålitelig LOD.
Spesifisiteten til påvisning ble bekreftet ved fravær av fluorescens-signal ved bruk av CP2m og villtype kontroll-DNA, HMC-1 (tabell 2). Spesielt, pre-berikelse steg dramatisk økt konsentrasjon av
BRAF
fragment i prøven. Dette ble bekreftet av opp til 10 ganger forhøyet ikke-spesifikt signal ved deteksjon av ikke-anriket HMC-1 DNA med CP2m probe (data ikke vist). Derfor, konkluderte vi at både pre-anrikning trinn og utformingen av mutasjonen sonden var avgjørende for analysen. Vi beregnet nøyaktigheten av rettet mot en bestemt
BRAF
region å være innenfor ± 1%. Tatt i betraktning den store sekvens kompleksiteten av humant genomisk DNA, konkluderte vi med at nøyaktigheten av våre
BRAF
gene targeting hjelp LNA /DNA-prober var veldig bra [10,21].
Som en siste aspektet, vi utsatt en rekke svært fortynnede HT29 muterte DNA-molekyler til deteksjon av fluorescens mikroskopi (fig 4). Før analyse vi pre-beriket mål-DNA, sammensmeltet det til CP2m på en fast bærer (CPG) og deretter spaltes det fra CPG, som beskrevet ovenfor. Med denne metoden komplekset av
BRAF
målet, CP2m, P1 og EvaGreen fargestoff kan lett oppdages på ~ 1,5 fM konsentrasjon av mutant DNA tilsvarer ~ 1 × 10
5 molekyler per 100 mL analytt (for informasjon om beregning, se Materialer og metoder). DNA: EvaGreen komplekset ble sett til å danne små aggregater på omslaget glassoverflaten på ca.. 1 um i diameter. I fravær av P1, fluorescens signalet var fire ganger svakere og ingen fluorescens ble observert for EvaGreen fargestoff kontroll (Fig 4 og S2 Fig). Videre ble ikke noe signal observert ved bruk av 100% villtype kontroll-DNA HMC-1 i samme innstilling. Så langt vi kjenner til, disse LOD verdiene har bare vært tidligere rapportert for PCR-baserte analyser, men ikke noen forsterkning frie metoder. Videre kan den observerte signal detekteres ved 1000-ganger lavere konsentrasjoner av DNA enn til og med 1,5 fM svarende til bare 100 molekyler pr 100 ul analytten. Vi spekulere at ved å bruke denne teknikken, og øke lengden av det signal som økende sonde som nevnt ovenfor, kan den LOD verdi for cancer DNA være langt under 1 aM.
(A) Kompleks av DNA med CP2m, signal -forsterkende sonde P1 og EvaGreen fargestoff, er lyse punkter med intensiteter over 80 sett. (B) target DNA gjensmeltet med CP2m og EvaGreen fargestoff i fravær av P1, blir mørkere prikker sett med teller opp til ca. 20. (C) EvaGreen fargestoff i 1xx PBS (0.06X løsning), blir ikke noe signal sett. Bilder ble innhentet ved hjelp av to foton laser scanning mikroskop (ex 535 + 35nm; laser @ 840); ved 19 ° C ved anvendelse av 1,5 fM cancer DNA og re-annealing med 22:00 signal-styrke-probe og 0.06X EvaGreen fargestoff. Bildene ble tatt med de samme instrumentinnstillinger og justeres med samme intensitet terskel. Grafen under bildene viser en linjeplott av linjen i bildet.
Sammenligning av vår metode til tidligere rapporterte genotyping metoder for
BRAF
mutasjon og andre sekvensvariasjoner var utviklet analysen er rettmessig lavt i pris, tid (12 timer kontra opp til en uke) og robusthet [9,14]. Viktigere, uten enzymer, foruten restriksjonsenzymer for fragmentering genomisk DNA, er nødvendig for påvisning av target-mutasjonen [22-24]. Dette forhindrer feil som ofte forekommer sammen med PCR eller justering av sekvenseringsdata [3,11]. Støkiometri av villtype og mutante mål er også konservert i vår analyse, noe som gir mulighet for en nøyaktig estimering av mutant overflod, gitt at grensen for måldeteksjonen kravet oppfylles. I tidligere rapporterte tester dette kan oppnås ved bruk av gull nanopartikler, DNAzymes eller elektrisk deteksjon [25-27]. I dette arbeidet bedre vi på følsomheten av target påvisning ved å bruke signalfremmende prober og lasermikroskopi, som viser muligheten for å detektere sekvensvariasjoner i mål-DNA ved lave konsentrasjoner direkte i humant serum [28].
i Oppsummert beskriver vi en ny analyse som gir mulighet for hurtig analyse av kreft mutasjoner. For å oppnå nødvendig spesifisitet og sensitivitet av påvisning av mål, kombinerer analysen flere prinsipper: 1) rettet mot pre-anrikning ved hjelp av en lang, gen-spesifikk probe (120mer); 2) høy bindingsaffinitet og spesifisitet av korte LNA prober, og 3) påvisning av DNA med høy oppløsning fluorescens mikroskopi. Som vi vise seg i dette arbeidet, den kombinasjon av disse teknikker muliggjør hurtig analyse av mutasjoner i kreft-DNA uten behov for forsterkning eller andre enzymatiske reaksjoner. Demonstrert som en proof-of-prinsippet på V600E mutasjon i
BRAF
onkogen, denne metoden kan brukes til å oppdage andre mutasjoner av klinisk betydning (f.eks kodon 12 og 13
KRAS
genet [29]) og tjene som en enkel og pålitelig metode for forskning, prognostisk eller terapi overvåking av kliniske prøver.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 bilag. Oligonukleotid syntese, karakterisering og termiske denaturering studier
doi:. 10,1371 /journal.pone.0136720.s001 plakater (docx)
S1 Fig. . Visualisering av kreft DNA på solid-støtte inneholder fangst probe CP3m plakater (venstre til høyre) rør 1-3: CP3m: HT29 (10,0, 5,0 og 2:05), rør 3-6: CP3m: LS411N (10,0, 5,0 og 02:05). Signal er oppnådd under laboratorie UV-vis lampe (eksitasjon ved 365 nm), ved 19 ° C ved hjelp 22:00 signal-styrke sonde og 0,6x EvaGreen fargestoff
doi:. 10,1371 /journal.pone.0136720.s002
(TIF)
S2 fig. Fluorescens bilder av
BRAF
DNA-fragmenter fra cellelinjen HT29. Product: (A) Kompleks av DNA med CP2m, signal-styrke probe P1 og EvaGreen fargestoff, lyse punkter med intensiteter over 80 blir sett. (B) target DNA gjensmeltet med CP2m og EvaGreen fargestoff i fravær av P1, blir mørkere prikker sett med teller opp til ca. 20. (C) EvaGreen fargestoff i 1 x PBS (0.06X løsning), blir ikke noe signal sett. (D) Wild-type kontroll DNA HMC-en, er ingen signal sett
doi:. 10,1371 /journal.pone.0136720.s003 plakater (TIF)
S1 Table. Unikhet analyse av fangst og signal-styrke prober
doi:. 10,1371 /journal.pone.0136720.s004 product: (PDF)
S2 Table. Kolo analyse av modell mål og genomisk DNA på solid støtte
doi:. 10,1371 /journal.pone.0136720.s005 product: (PDF)
