Abstract
Bakgrunn
Redox lydløs vitamin E analoge α-tocopheryl succinate (α-TOS) ble funnet å synergi samarbeide med vitamin K3 (VK3) pluss askorbinsyre (AA) ved induksjon av kreftcelle-selektiv apoptose via et caspase-uavhengig reaksjonsvei. Her undersøkte vi den molekylære mekanismen (e) underliggende celledød indusert i prostatakreftceller ved α-TOS, VK3 og AA, og potensiell bruk av målrettet legemiddelkombinasjonen i behandling av prostatakreft.
Metodikk /Principal funn
Den generasjonen av ROS, cellulær respons på oksidativt stress, og autofagi ble undersøkt i PC3 prostatakreftceller ved hjelp av medikamenter på sub-giftige doser. Vi evaluerte enten PARP1-mediert apoptose-induserende faktor (AIF) frigivelse spiller en rolle i apoptose indusert ved en kombinasjon av midler. Deretter ble virkningen av kombinasjonen av α-TOS, VK3 og AA på tumorvekst undersøkt i nakne mus. VK3 pluss AA indusert tidlig ROS formasjon forbundet med induksjon av autophagy som reaksjon på oksidativt stress, som ble redusert med α-TOS, hindrer dannelsen av autophagosomes. α-TOS indusert mitokondrie destabilisering som fører til utslipp av AIF. Translokasjon av AIF fra mitokondrier til kjernen, et resultat av kombinatorisk behandling ble mediert av PARP1 aktivering. Inhiberingen av AIF, så vel som av PARP1 effektivt dempes apoptose utløses av medikamentkombinasjonen. Ved hjelp av en musemodell for prostatakreft, kombinasjonen av α-TOS, VK3 og AA var mer effektiv i tumor suppresjon enn når medikamentene ble gitt separat, uten skadelige bivirkninger.
Konklusjoner /Betydningen
α-TOS, en mitokondrier målretting apoptotiske agent, bytter på sub-apoptotiske doser fra autofagi avhengig overlevelse av kreftceller til sin død ved å fremme induksjon av apoptose. Gitt den dystre prognosen for kreftpasienter, er dette funnet av potensiell klinisk relevans
Citation. Tomasetti M, Nocchi L, Neuzil J, Goodwin J, Nguyen M, Dong L, et al. (2012) Alpha-Tocopheryl Succinat Hemmer autophagic Survival of prostata kreft celler indusert av vitamin K3 og Askorbat å utløse celledød. PLoS ONE 7 (12): e52263. doi: 10,1371 /journal.pone.0052263
Redaktør: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Storbritannia
mottatt: 26 juni 2012; Godkjent: 12 november 2012; Publisert: 18.12.2012
Copyright: © 2012 Tomasetti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av et stipend fra Prostate Cancer Foundation of Australia til JN, og den ekstra delen av Forsknings finansiering av Polytechnic University of Marche. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mitokondrier har nylig dukket opp som spennende mål for anti-kreft narkotika [1] – [3]. Vitamin K3 (VK3), en syntetisk versjon av vitamin K, oppviser cytotoksisk aktivitet i kreftceller ved å bevirke mitokondrier-avhengige skade ved hjelp av redoks-sykling, så vel som selektiv hemming av DNA-polymerase-γ, nøkkelenzymet av mtDNA-replikasjon [3], [4]. For å forsterke sin anti-kreft-effekt, har VK3 blitt kombinert med redoks-aktive askorbinsyre (AA). Hydrogenperoksyd utviklet ved VK3-AA-kombinasjonen har blitt rapportert å indusere celledød i ulike typer av kreft [5], [6].
VK3-AA-induserte oksidativt stress kan være forskjellig i tumorceller og normale celle metabolisme, og kan tillate manipulering utformet for å forbedre cancerterapi. Imidlertid, i respons til oksidativt stress-celler aktiverer trasé som fremmer deres overlevelse og tilpasning [7]. En slik stressrespons mekanisme er autofagi [8], [9]. ROS kan indusere autophagy, noe som kan bidra til å caspase-uavhengig celledød, eller i motsetning til dette kan autophagy fremme en beskyttende rolle mot ROS-mediert død [10], [11]. Derfor kan oppdagelsen av molekyler som regulerer autofagi være av stor betydning for utvikling av legemidler for behandling av kreft.
Nylig har subletale konsentrasjoner av VK3 og AA, sammen med en sub-apoptotiske dose α-Tokoferol-suksinat (α-TOS), har blitt vist å effektivt indusere prostatakreft celledød som ble karakterisert ved DNA-fragmentering, lysosomal /mitokondrie perturbasjon, cytokrom
c
frigivelse, mens mangler caspaseaktivering [12]. Økende bevis tyder på at caspase-uavhengige baner spiller en viktig rolle i kreftdødsfall, og den apoptose-induserende faktor (AIF) fremstår som en sentral formidler av denne fremgangsmåte [13] – [16]. Relevant for denne forutsetningen, aktivering av DNA-reparasjonsenzym poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1) er rapportert som en forutsetning for AIF frigivelse ved en mekanisme som innebærer Ca
2+ innstrømning i cytosol [17] – [20].
ved hjelp av sub-giftige doser av α-TOS med sub-giftige konsentrasjoner av VK3 + AA tidligere identifiserte [12], vurderte vi effekten av α-TOS på ROS-mediert autophagy utløst av VK3 og AA. Mekanismen (e) som er involvert i celledød som induseres av middel-kombinasjonen ble også undersøkt. Vi rapporterer at VK3 pluss AA induserte tidlig ROS dannelse forbundet med induksjon av autofagi som svar på oksidativt stress. Hemming av autofagi avdekket den beskyttende rollen VK3 + AA-indusert autofagi i PC3 celler. α-TOS ble funnet å redusere VK3 + AA-indusert ROS dannelse abrogere ROS utløser autophagosomes formasjon. Men ROS produsert var tilstrekkelig til å indusere PARP1 aktivering, noe som resulterer i utgivelsen av den pro-apoptotiske faktor AIF, fremme celledød manifestert av kjennetegnene ved apoptose inkludert kromatin kondens. Den kliniske relevansen av denne forskningen er levert av betydelig undertrykkelse av kreft i mus behandlet med kombinasjonen av de tre agenter.
Resultater
α-TOS hemmer autofagi utløst av ROS generert som svar på VK3 og AA behandling
det er blitt rapportert at sub-toksiske doser av en kombinasjon av VK3 (3 uM) med AA (0,4 mM) resulterte i intracellulær produksjon av ROS, men cellene døde bare i nærvær av α -TOS (30 uM) [12]. Å belyse rollen som oksidativt stress i kombinasjonsbehandling, ROS dannelse og cellulære responser til oksidativt stress (autofagi) ble vurdert over tid. Behandling av PC3-celler med VK3 og AA resulterte i dannelsen av peroksyd-relaterte molekyler innen 30 min, hvoretter ROS-assosierte fluorescerende signal tilbake til sin basalnivået. Mens α-TOS alene induserte en sen dannelse av peroksyd-relaterte molekyler, som ble observert etter 120 min inkubasjon det reduserte tidlig økning i sine nivåer i respons til behandling av cellene med VK3 og AA alene (Fig. 1A, venstre panel). For å undersøke om mitokondriene er den viktigste kilden til ROS generasjon ble nivåene av superoksid vurdert ved hjelp dihydroetidium (DHE). Ved interaksjon med superoksid, gir DHE etidiumbromid (EtBr) som samler seg i kjernen og gir rød fluorescens [21]. Fig. 1A (høyre panel) dokumenter øke superoksyd nivåer innenfor 20-60 min av behandling av cellene med VK3 og AA, som ble redusert i nærvær av α-TOS. Den DHE-avledede EtBr nukleær farging ble påvist over tid ved hjelp av fluorescens mikroskopi, og viser at ved behandling med VK3 og AA, de apoptotiske blebs inneholdende kjernefysiske komponenter ble dannet på celleoverflaten etter 60-120 min; 36-46% av cellene ble EtBr-negative (blek celler) som en konsekvens av kromatin tap. Det ble observert redusert antall celler med atom blebs (18% av bleke-celler) ved forlenget inkubasjon. Cellene gjenvinnes etter 180 min inkubasjonstid, noe som indikerer en reversibel prosess. Tilstedeværelsen av α-TOS markert hemmet «gjenvinning «av blebs som gjenspeiles av økningen av bleke-celler (66%), fremmende cellene død (Fig. 1B).
(A), PC3-celler ble behandlet med A-TOS (30 mm), VK3 og AA (3 mikrometer VK3, 0,4 mM AA) og vurderes for ROS generasjon bruker DCF (en indikator på hydrogenperoksid) eller DHE (en indikator på superoksid), uttrykt som gjennomsnittlig fluorescens intensitet. Cellene ble evaluert med hensyn til den økede fluorescens ved hjelp av strømningscytometri. (B) Mikroskopisk visualisering av Dhe-farget PC3 celler etter medikamentell behandling over tid. Ved interaksjon med superoksid, DHE (Punktum blå) gir etidiumbromid (EtBr) som samler seg i kjernen og gir rød fluorescens (øvre panel). Atom blebs innehold skadet kromatin redusere kjerne EtBr-farging (blek celler). Flowcytometri kvantifisering av bleke-celler (EtBr-negative celler, nedre panel) ble utført i PC3-celler behandlet som angitt. Dataene er middelverdier ± S.D. (N = 3), de mikroskop bilder er representative for tre uavhengige eksperimenter. Forstørrelse 600 ×, skala bar = 10 mikrometer.
Etter å ha dokumentert at medikamentell behandling indusert generasjon av ROS, vi neste undersøkt deres effekt på autofagi i PC3 celler ved evalueringen av uttrykket mønster av microtubule -associated protein-1 (LC3), ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM), og via dannelsen av sure vacuolar organeller [22]. LC3 eksisterer i to former, LC3-I (18-kDa) og LC3-II (16 kDa), den sistnevnte er membranbundet og økt i løpet av autofagi ved omdannelse av den tidligere [23]. PC3-celler behandlet med VK3 og AA viste høyere nivå av den LC3-II-proteinet ved 60-120 minutter etter-behandling, som ble hemmet i nærvær av α-TOS (fig. 2A). TEM ble utført på PC3 celler etter ulike behandlingskombinasjoner. Kontroll og α-TOS-behandlede celler kjennetegnet mitokondrier med veldefinerte cristae, intakt dobbel membran, homogen tetthet og sylindrisk form. Utseendet av et stort antall autophagosomes med en dobbel membranstruktur i cytoplasma ble observert ved TEM etter 120 min av behandling med VK3 + AA, med liten effekt på mitokondrie morfologi. I motsetning til dette, når VK3 og AA ble kombinert med α-TOS, fremtredende unormal mitokondrier med uorganisert cristae, redusert elektrontetthet og økning i akse ble observert i samsvar med mitokondriell hevelse, mens dannelsen av autophagosomes ikke ble påvist (Fig. 2B). Opptaket av den røde fluorescerende AO støtter videre den hemmende effekten av α-TOS på VK3 + AA-indusert autofagi (Fig. 2C).
(A) PC3 celler ble behandlet med medikamenter som angitt og nivået av LC3-II-proteinet normalisert til a-aktin ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD av LC3-II /LC3-I densitometry forholdet. (B) PC3 celler ble behandlet med medikamenter som indikert i 2 timer og vurdert for morfologi av TEM. Forstørrelse 4000 ×, skala bar = 0,5 mikrometer (øverste bilde), forstørrelse 9000 ×, bar = 0,5 mikrometer; N = kjerne, m = mitokondrier, a = autophagosomes. (C) PC3-celler ble behandlet som angitt, og dannelse av AO-akkumulerende sure vesikulær organeller (orange-rød fluorescens) ble påvist ved hjelp av flow cytometri. (D) PC3-celler ble behandlet som angitt i nærvær eller fravær av inhibitorer Autophagy (3mA og CQ), og celle-levedyktigheten ble montere etter 24 timers inkubering. (E) Dannelse av autophagosomes i kontrollcellene (1) og i nærvær 3mA (2) og CQ (3) ble undersøkt ved western blotting som uttrykk for LC3-II etter 2 timer av legemiddelbehandlinger. Dataene er uttrykt som en endring i forhold til ubehandlet kontroll, og er gjennomsnittsverdier ± S.D. (N = 3), bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05, sammenlignet med kontroller
Neste vi spurte om autofagi påvirker celledød. For å løse dette spørsmålet, ble autofagi trykt med den farmakologiske inhibitor 3mA (tidlig fase hemming) og CQ (sen fase hemming). PC3 cellene ble deretter behandlet med α-TOS eller VK3 + AA og α-TOS + VK3 + AA. Som vist på fig. 2D, hemming av tidlig autophagic prosessen redusert celle levedyktighet i VK3 + AA-behandlede celler i en grad sammenlignes med hva observert når α-TOS ble kombinert med VK3 + AA. Denne effekten ble ikke funnet når blokkerer den siste trinnet av autophagic pathway. Dannelsen av autophagosomes i fravær eller nærvær av de autophagic inhibitorer 3mA og CQ ble evaluert som ekspresjon av LC3-II etter medikamentbehandlinger (2 timer). Den VK3 + AA blanding indusert LC3-II uttrykk som ble hemmet i nærvær av 3mA men ikke CQ (Fig. 2E). Dette indikerer at autofagi er en beskyttende reaksjon på VK3 + AA-indusert celledød, og hemming av autofagi i tidlig fase er en strategi for å indusere celledød.
Mekanisme α-TOS, VK3 og AA- indusert celledød
for å undersøke mekanismen (e) som er involvert i celledød indusert av kombinasjonen α-TOS med VK3 + AA, vurderte vi rollen som AIF. Sub-cellulær fraksjonering viste at bare når a-TOS (30 uM) ble kombinert med VK3 (3 uM) og AA (0,4 mM), AIF, som ble distribuert fra mitokondrier til cytoplasma og til kjernen (fig. 3A). For å teste hvorvidt AIF re-fordeling er involvert i celledød indusert ved kombinasjonen av de tre midlene ble protein taushet og cellelevedyktigheten evaluert. Som vist på fig. 3B, siRNA målretting AIF AIF stilnet uttrykk som, i sin tur, svekket celledød indusert ved en kombinasjon av α-TOS, VK3 og AA effektivt. Effekten av AIF siRNA er dokumentert i fig. 3C.
Panel (A) viser fluorescens mikroskop bilder av AIF translokasjon til kjernen etter 180 min behandling med á-TOS (30 mm), VK3 og AA (3 mikrometer VK3, 0,4 mM AA) alene eller i kombinasjonen (venstre panel). Atomtranslokasjon av AIF er demonstrert ved lik fordeling av røde (AIF-TRITC) og blå signal (nucleus); forstørrelse 600 ×, skala bar = 10 mikrometer. Høyre panel viser western blot analyse av AIF trans i cellulære fraksjoner. Organeller (Org), cytoplasma (cytomegalovirus) og kjernefysiske (Nucl) fraksjoner ble oppnådd fra PC3-celler behandlet med medikamenter som ovenfor, og graden av AIF vurdert. PC3-celler ble transfektert med NS siRNA eller AIF siRNA, og vurdert for AIF proteinnivå (C). De transfekterte celler ble behandlet som ovenfor i 24 timer av inkubasjon og vurdert for levedyktighet ved anvendelse av MTT-analysen (B). Dataene er middelverdier ± S.D. (N = 3), bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Symbolet «*» indikerer statistisk forskjellige resultater for AIF siRNA- og NS siRNA-transfekterte celler med p. 0,05
For å bestemme direkte sammenheng mellom økt intracellulær ROS-nivåer og AIF-mediert celledød indusert ved kombinatorisk behandling, PC3-celler ble forbehandlet med antioksidanten NAC, som effektivt blokkert cytoplasmisk og nukleær translokasjon av AIF indusert av de tre midlene, noe som indikerer rollen til ROS (fig. 4A, B). Inhiberingen av AIF nukleær translokasjon var forbundet med en oppheving av narkotika-indusert celledød (fig. 4 C, D). Videre, for å teste om den omfordeling av AIF oppstår er et caspase-uavhengig måte, ble cellene eksponert for de tre midlene i nærvær av det pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK, som verken AIF trans heller ikke utøves noen beskyttende virkning mot kombinatorisk behandling (fig. 4 A-D).
Panel (A) dokumenterer AIF-TRITC visualisert ved fluorescens mikroskop, forstørrelse 600 x, skala bar = 10 um. (Venstre panel), og vestlige blot bilder (panel høyre) av AIF trans til cytosol og kjerne after180 min behandling med á-TOS (30 mm), VK3 og AA (3 mikrometer VK3, 0,4 mM AA) i fravær eller nærvær av NAC (10 mm) eller z-VAD-FMK (10 mm). AIF bandet tetthet ble normalisert ved hjelp av en-aktin eller Lamin, og er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. AIF
CYTO-AIF
Nucl /AIF
org densitometry ratio. (B). Cytotoksisk effekt av kombinatorisk behandling på PC3-celler i fravær eller nærvær av NAC (10 mM) og Z-VAD-FMK (10 uM) ble evaluert som cellelevedyktigheten etter 24 timer med eksponering av cellene til stoffene (C), og fasekontrastmikrografer av cellen behandles på tilsvarende er avbildet (D); forstørrelse 200 ×, skala bar = 100 mikrometer. Dataene er middelverdier ± S.D. (N = 3), bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Symbolet «*» indikerer statistisk forskjellige resultater for ubehandlet
vs
behandlet PC3 celler i fravær eller nærvær av NAC eller zVAD-FMK med p. 0,05
Det har vært tidligere rapporterte at ROS-mediert DNA-skade utløser aktivering av PARP1 og påfølgende celledød [24]. PARP1 aktivering genererer PAR polymer i kjernen og det translocate til mitokondriene til å mediere AIF meldingen [20]. For å klargjøre forholdet mellom AIF og PARP1, evaluert vi AIF utgivelsen og PARP1 aktivitet i PC3 cellene etter eksponering for a-TOS, VK3 og AA ved ulike tidspunkt. AIF translokasjon til cytoplasma var påvisbare innen 5 til 60 minutter ved kombinatorisk behandling av cellene, og cytoplasmiske frigjøring av AIF ble samtidig med PARP1 aktivering. I motsetning til dette ble translokasjon av AIF til kjernen forsinket med minst 60 minutter (Fig. 5A, B). Hemming av PARP1 av 3ABA svekket både AIF atomtrans (Fig. 5C, D) og celledød induksjon (Fig. 6 E, F).
Panel A viser kinetikk av AIF utgivelsen og panel B aktivitet av PARP1 i PC3 celler eksponert for a-TOS (30 mm), VK3 (3 mm) og AA (0,4 mm). Panel C viser fluorescens mikroskopi bruker PARP1-FITC og AIF-TRITC (forstørrelse 600 ×, skala bar = 10 mm) (venstre panel), og vestlige blot bilder (panel høyre) av PARP1 og AIF translokasjon til kjernen etter 180 min behandling med á-TOS + VK3 + AA i fravær eller nærvær av 3ABA (2 mm). (D) AIF bandet tetthet ble normalisert til A-aktin eller Lamin og uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av AIF
CYTO-AIF
Nucl /AIF
org densitometry ratio. (E) Den cytotoksiske effekten av kombinasjonsbehandling på PC3-celler i fravær eller nærvær av 3ABA ble evaluert som cellelevedyktigheten etter 24 timer med eksponering av cellene til medikamenter. Panel F viser fasekontrastmikrografer av celler behandlet med de tre stoffene med eller uten 3ABA; forstørrelse 200 ×, skala bar = 100 mikrometer. Dataene er middelverdier ± S.D. (N = 3), bildene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Symbolet «*» indikerer statistisk forskjellige resultater for ubehandlet vs behandlet PC3 celler i fravær eller nærvær av 3-ABA med p 0,05
Behandling med α-TOS + VK3 + AA undertrykker tumor progresjon.
for å vurdere anti-kreft effekt av de tre medikamenter, Balb-c nakne mus med PC3 xenotransplantater ble oralt behandlet med sub-toksiske doser av VK3 (3 mg /kg), AA (400 mg /kg), og med α-TOS (15 mg /kg) levert intraperitonealt, og med den kombinasjonen VK3 + AA, eller α-TOS + VK3 + AA. En signifikant tumorvekst-inhibering ble observert i VK3 pluss AA behandlingsgruppe; denne effekten ble betydelig forbedret ved lengre perioder med behandling når de to agentene ble kombinert med α-TOS (Fig. 6A). Kombinatorisk terapi med de tre legemidler induserte DNA-tråd bryte formasjonen (TUNEL positivitet), tilsvarende en apoptotiske prosess, som var assosiert med nukleær translokasjon AIF (fig. 6B). Større tumorcelledødsområdene ble funnet hos mus eksponert for tri-kombinasjonsterapi i forhold til ubehandlede mus (85 ± 16 x 10
3 um
2
vs
238 ± 45 x 10
3 mikrometer
2 henholdsvis
p
0,05). Denne behandlingen viste seg å utøve noen påvisbar side toksisitet, ettersom musene viste ikke noe vekttap, samt ingen tegn på cytotoksisitet i nyrene og leveren som detektert ved histologisk evaluering og ved biokjemiske analyser (data ikke vist).
(A) Balb-c naken mus med xenografter avledet PC3 celler ble behandlet med peroralt inntak av VK3 (3 mg /kg) andAA (400 mg /kg), og intraperitoneal injeksjon av á-TOS (15 mg /kg) alene eller i kombinasjon, som indikert, 5 ganger per uke, og tumor volum (mm
3) ble kvantifisert ved målepunktene. (B) formalinfiksert, parafininnstøpte tumorsnitt (5 mikrometer) ble inspisert for TUNEL positivitet (grønn krydres celler) (forstørrelse 200 ×, skala bar = 100 nm) og ble immuno-farget med anti-AIF IgG (hvite piler indikerte kjernefysisk translokasjon av AIF-TRITC og pycnotic kjerner oppdaget ved hjelp av DAPI); forstørrelse 400 ×, skala bar = 50 mikrometer. Data over tumorvolumet er gjennomsnitt ± SEM (n = 8), ble ingen signifikante forskjeller funnet mellom kontrollmusene og enkeltmedikamentbehandlede mus, mens signifikante forskjeller ble funnet mellom kontroll mus og VK3 + AA-behandlede dyr på dag 22-31 ( p = 0,034) og α-TOS + VK3 + AA-behandlede dyr på dag 43-49 (p = 0,043).
Diskusjoner
Oral administrasjon av AA og VK3 ble brukt ved behandling av prostata kreftpasienter [25]. Denne tilnærmingen var gunstig når stoffet kombinasjonen ble co-administrert med kjente kjemoterapeutika [26]. Følgelig samtidig bruk av sub-dødelige doser av AA + VK3 (redoks-aktivt system) med redoks-silent α-TOS resulterte i effektiv
in vitro
celledød. Kombinasjonen av VK3 + AA ble vist synergistisk fremme produksjon av hydrogen peroxide i ekstracellulære miljø [12], [27].
I samsvar med tidligere observasjoner, fant vi at kombinasjonen av VK3 + AA forårsaket rask generering av både hydrogenperoksid (DCF fluorescens) og superoksid (DHE fluorescens), med en topp ved 10-20 min og 30-60 min for eksponering av cellene til de to stoffer (
cf
fig. 1A). Som svar på denne oksidativt stress, cellene aktivert autophagic pathway. Dette ble dokumentert av dannelsen av atom blemmer og autophagic vesikler (sure vacuolar organeller), samt økte nivåer av LC3-II protein (
cf
Fig. 2A-C). Imidlertid, etter 180 minutter av denne behandling ble cellene fullstendig restituert. Det viser DHE oksidasjon-indusert EtBr atom flekker, som dokumenterer at den økte indeksen for bleke celler observert etter 60 min av behandling med VK3 + AA markert redusert over lengre tidsperioder (
cf
Fig. 1B). Den autofagi inhibitor 3mA (tidlig autophagic prosess) utløser VK3 + AA-indusert celledød som indikerer at autofagi er en beskyttende mekanisme i sammenheng med PC3 celler (
cf
Fig. 2D). Disse funnene tyder på at tidlig oksidativt stress resulterer i en adaptiv respons på kreftcellene som gjør det mulig for deres utvinning fra fornærmelse. På den annen side, sub-apoptotiske doser av α-TOS induserte en reduksjon i ROS formasjon utløst av VK3 + AA (
cf
fig. 1A). Vi kan hypotese at hydrolysen av α-TOS av esteraser i celler fører til generering av α-tokoferol (α-TOH), som virker som en ROS scavenger [28]. Som tidligere funnet [29], observerte vi at ROS som genereres som reaksjon på a-TOS består i hovedsak av peroksyd-beslektede arter, men ikke superoksyd. I motsetning til dette ble α-TOS rapportert å indusere superoksydproduksjon via interaksjon med kompleks II i mitokondrie respiratoriske kjeden [30]. Vi kan ikke utelukke at det i våre eksperimentelle forhold, sub-giftig doser ofα-TOS fører til dannelsen av lave mengder av superoksid, som kan være raskt dismutated og unngå å bli oppdaget.
Ingen dannelsen av autophagosomes eller endret morfologi organeller ble observert i α-TOS- og VK3 + AA behandlede celler (
cf
fig. 2A-C). Dette kobler reduksjon av den «adaptive» tidlig oksydasjon spenning med den hindring av autophagic prosess indusert av en kombinasjon av VK3 + AA alene, og er videre bekreftet ved TEM, og viser fraværet av autophagosomes i celler behandlet med en kombinasjon av de tre legemidler (
cf
fig. 2B). Hemming av autofagi indusert byα-TOS fremmet utseendet til en økt sub-sett bleke celler, dannelsen av kjernefysiske blemmer og mitokondrie hevelse med uorganisert cristae og redusert elektrontetthet, alle funksjonene til celledød. Derfor hindrer inkluderingen av α-TOS i kombinatorisk behandling av PC3-celler de adaptive mekanismer og overlevelse som fører til induksjon av deres død.
Induksjon av autophagy har blitt rapportert å fremme overlevelse av tumorceller, for derved å motvirke eller å begrense effekten av celledød induksjon av kjemoterapeutiske midler, risikere resultatet av kreftterapi [31]. Etter avtale med denne forestillingen, våre data viser en beskyttende rolle autofagi ved eksponering av PC3 celler til VK3 og AA. Vi fant at de behandlede celler som utviste morfologi som minner om (autophagic) celledød, i stor grad gjenvunnet, og bare en mindre fraksjon av cellene med forstyrret mitokondrie trans-membranpotensialet var utenfor redning og døde under disse betingelser.
det ble funnet tidligere at apoptose er forsinket i celler som mangler de Bax og Bak proteiner som er nødvendige for mitokondrielle ytre membran permeabilization (MOMP), som er et kjennetegn på apoptotisk celledød og en forutsetning for cellen for å krysse den «point of no return «[32]. Det ble funnet at α-TOS induserer translokasjon av Bax inn i mitokondriene i brystkreftceller [33] – [36]. En annen rapport dokumentert α-TOS å indusere mitokondrielle apoptose involverer FoxO1-Noxa-Bak aksen [37], [38]. En AIF-mediert caspase-uavhengige indre vei via Bak er tidligere beskrevet [39]. AIF oppløselig fragment frigjøres fra mitokondrier ved ytre membran permeabilization gjennom Bax /Bak porene [40]. Vi viser at AIF frigjøring fra mitokondrier er nødvendig for celledød indusert ved kombinatorisk behandling av prostatacancerceller med α-TOS + VK3 + AA ved sub-toksiske doser av de individuelle midler. Dempe AIF protein av siRNA vesentlig svekket død PC3 celler indusert av kombinatorisk behandling (
cf
Fig. 3).
ROS produksjon spiller en sentral rolle i utgivelsen av AIF og følgende fremming av celledød. Vi dokumentere at denne forutsetningen holder for vårt system, som viser at ROS åtseldyr NAC helt avskaffet dødsfallet til PC3 celler eksponert for kombinasjonen av α-TOS + VK3 + AA (
cf
Fig. 4). Vi dokumenterer videre at ROS-avhengig PARP1 aktivering er assosiert med utgivelsen av AIF fra mitokondriene til kjernen (
cf
Fig. 5). I respons til DNA-skade, katalyserer PARP1 syntesen og overføring av PAR-enheter til akseptor-proteiner, hvorved det modulerende deres aktiviteter og regulere DNA-reparasjon [41], [42]. Imidlertid aktiverer overdreven DNA-skade en unik PARP1-avhengig celledød program, som er caspase-uavhengige, men avhengig av AIF [43]. Selv om i mindre grad med hensyn til VK3 + AA, den α-TOS + VK3 + AA kombinasjon indusert tidlig ROS formasjon, som tidligere ble funnet å indusere tidlig DNA-skade [12]. Den ROS-induserte DNA-skader utløst en sterk økning i PARP1 aktivitet, noe som førte til frigjøring av AIF fra mitokondrier til cytoplasma, og videre til kjernen. Således, som s en konsekvens av PARP1 aktivering, AIF-proteinet translokert fra cytoplasma til kjernen, noe som resulterer i induksjon av kromatin kondensering med påfølgende celledød (
cf
fig. 5).
andre har observert at høye doser av AA induserte autofagi i prostatakreftceller, som ikke gjenopprette og ble begått for å dø [10], [44]. Forskjellige doser av medikamentene utøver forskjellige virkninger på celler ved å produsere varierende mengder av ROS. På bakgrunn av ROS fornærmelse, cellene på en annen måte reagere ved induksjon av deres overlevelse eller død program. Her, sub-toksiske doser av VK3 + AA indusert en ROS fornærmelse ikke i stand til å utløse celledød, men forårsaker skade på celleorganeller med påfølgende aktivering av overlevelse autophagic prosessen. Tilstedeværelsen av α-TOS redusert VK3 + AA-indusert oksidativ fornærmelse, og dermed hemme den cellulære responsen overlevelse. Imidlertid ROS dannet var tilstrekkelig til å indusere PARP1 aktivering resulterer i AIF meldingen og den påfølgende celledød.
på grunn av mulige anti-kreft-aktivitet av de tre midler, effekten av kombinasjonen av α-TOS + VK3 + AA på tumorvekst ble undersøkt i nakne mus. Oral administrasjon av blandingen av VK3 + AA betydelig redusert tumorvekst på dager 22-31 (p = 0,034). Ingen TUNEL positivitet ble funnet i deler av VK3 + AA-behandlede tumorer, noe som tyder på at reduksjonen i tumorstørrelse indusert ved VK3 + AA skyldes tumorveksthemning i stedet for celledød (
cf
figur 6A). Dette bekreftes av det faktum at i lengre tid av medikament eksponering (dag 35-49) tumorene startes på nytt for å vokse. Behandling med α-TOS + VK3 + AA signifikant hemmet tumorvekst (dager 43-49, p = 0,04), indusere store deler av celledød assosiert med AIF atomtranssammenlignet med kontrolldyrene og de som ble behandlet med de enkelte legemidler (
jf
fig. 6A, B). Spesielt, den anti-tumoreffekten til det α-TOS + VK3 + AA-kombinasjonen var assosiert med ingen tegn på sekundære skadelige effekter. Disse funnene støtter
in vitro
data som viser at α-TOS hemmer kreft celle utvinning og overlevelse etter VK3 + AA behandling, indusere effektiv celledød i lengre tider av eksponering for kombinasjonen av de tre agenter.
Konklusjoner
Mange faktorer som svulst vascularization og kreftcelle opptak påvirke medikamentkonsentrasjoner innenfor tumormasse. Derfor, ved tumor nivå, kan de anti-kreft medikamenter være ikke ved avliving nivå selv når det administreres i høye konsentrasjoner. Derfor, i stedet for å indusere celledød, lave nivåer av anti-kreft legemidler kan indusere en adaptiv respons som fører til kreftceller til å formere seg. Her fant vi at det adaptive cellulær respons på oksidativt stress indusert av redoks-aktive system av VK3 + AA ble overvunnet av kombinasjonen med redoks-silent middel α-TOS, som forårsaket en bryter fra autophagic overlevelse til celledød (Fig . 7). Siden serum nivåer av anti-kreft agenter var under deteksjonsgrensen, ble deres farmakokinetikk ikke evaluert, derfor den effektive konsentrasjonen av agentene som kan oversette til kliniske settinger ikke er nøyaktig kjent. I klinisk praksis kan lave doser av AA og VK3 enkelt oppnås ved oral administrasjon. Siden α-TOS fullstendig omdannes til den ineffektive α-tokoferol etter oral administrasjon, representerer intravenøs eller transdermal administrering en skikkelig måte å oppnå de farmakologiske nivåer og den anti-cancer effekt. Uten hensyn til kliniske hjelp av administrasjonen, som er ennå ikke testet, viser denne rapporten potensiell bruk av målrettet legemiddelkombinasjonen i behandling av prostatakreft.
VK3 + AA kombinasjon induserer ROS dannelse (i), til
