Abstract
Bakgrunn
kreften spredt seg til andre organer er den viktigste årsaken til død av onkologiske pasienter. Migrasjon av kreftceller fra en primær svulst er det avgjørende skritt i den komplekse prosessen med metastaser, derfor blokkerer denne prosessen er i dag den viktigste behandlingsstrategi. Metastase-inhibitorer avledet fra naturlige produkter, slik som migrastatin, er meget lovende anticancermidler. Dermed er målet med vår studie var å undersøke effekten av seks migrastatin analoger (MGSTA-1 til 6) på migrasjon og invasjon av hjørnetann brvstadenokarsinom cellelinjer isolert fra primærsvulster og deres metastaser til lungene. Canine brystsvulster utgjør et verdifullt verktøy for å studere flere aspekter av menneskelig kreft
Resultater
Våre resultater viste at to av seks helsyntetiske analoger av migrastatin:. MGSTA-5 og MGSTA-6 ble potent hemmere av canine melkekreftceller migrasjon og invasjon. Disse data ble oppnådd ved bruk av sårtilheling testen, samt trans-brønners migrering og invasjon analyser. Videre er behandlingen av kreftceller med den mest effektive forbindelse (MGSTA-6) forstyrret binding mellom trådformede F-aktin og fascin1. Konfokal mikroskopi-analyser viste at behandling med MGSTA-6 økte nærværet av ikke-bundet fascin1 og redusert ko-lokalisering av F-aktin og fascin1 i canine kreftceller. Mest sannsynlig, aktin filamenter ikke var kryssbundet ved fascin1 og ga ikke den typiske filopodial arkitekturen av aktin filamenter som respons på aktiviteten av MGSTA-6. Dermed administrasjon av MGSTA-6 resulterer i redusert dannelse av filopodia fremspring og stress fiber i canine melkekreftceller, forårsaker hemming av kreft migrasjon og invasjon.
Konklusjon
To syntetiske migrastatin analoger (MGSTA -5 og MGSTA-6) ble vist å være lovende forbindelser for inhibering av kreftmetastaser. De kan ha gode terapeutiske effekter på kreftterapi hos hunder, spesielt i kombinasjon med andre anticancer legemidler. Men videre
i
vivo
studier er nødvendig for å bekrefte denne hypotesen
Citation. Majchrzak K, Lo Re D, Gajewska M, Bulkowska M, Homa A, Pawlowski K, et al. (2013) Migrastatin analoger Hemme Canine melke Cancer Cell migrasjon og invasjon. PLoS ONE 8 (10): e76789. doi: 10,1371 /journal.pone.0076789
Redaktør: Waldemar Debinski, Wake Forest University School of Medicine, USA
mottatt: May 22, 2013; Godkjent: 04.09.2013; Publisert: 08.10.2013
Copyright: © 2013 Majchrzak et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet antallet N N308 574940 fra Ministry of Sciences og høyere utdanning i Polen og Science Foundation Irland (tilskudd nummer 07 /IN.1 /B966). Den forskning som fører til disse resultatene har mottatt støtte fra People Programme (Marie Curie Actions) i EUs sjuende rammeprogram (FP7 /2007-2013) under REA tilskuddsavtalen antall Pief-GA-2011-299042. Dette arbeidet ble støttet av COST Handling CM1106. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser er årsaken til de fleste kreftdødsfall [1,2]. Selv om det er grundig undersøkt, gjenstår det fortsatt en av de mest uutgrunnelige aspekter av sykdommen. Dårlige resultater av dagens behandlingsformer, spesielt dårlig prognose for pasienter i avanserte stadier av solide svulster på grunn av metastaser oppmuntre etterforskere over hele verden for å finne nye medikamenter som kan hemme metastatisk kaskade. En lovende middel er et naturlig produkt migrastatin: en ny anti-metastatisk forbindelse av mikrobiell opprinnelse. Det er en makrolakton naturprodukt opprinnelig isolert fra
Streptomyces
sp. MK929-43F1 av Imoto et al. i 2000 [3-5] og senere fra
Streptomyces platensis
av Licari et al. i 2002 [6] som en inhibitor av tumorcellemigrering. Bare få år senere ble den første totale kjemisk syntese av migrastatin ble rapportert [7,8]. Siden da har flere mer effektive analoger av migrastatin blitt syntetisert og beskrevet som lovende anti-metastatiske narkotika [8-13]. Det har vært arbeidet med å skape ytterligere analoger til struktur aktivitets studier [14-17]. Viktigere er det enklere analoger av migrastatin, slik som makrolid MGSTA-8 (figur 1), vist aktivitet ~ 1000 ganger mer aktiv enn migrastatin seg i tumorcellemigrasjon assays
in vitro product: [9]. Avkortede analoger som MGSTA-4 og macroketone MGSTA-5 og MGSTA-8 sperre metastasering av høyt metastatiske tumorceller i musemodeller [10,12]. Imidlertid hemming av celle trekkende evne betydelig avhenger av strukturen av forbindelsene og noen acykliske analoger vise aktivitet [11,14,15].
molekylære mekanismen som migrastatin påvirker kreftcelle migrering og invasjon har ikke vært fullt oppdaget, selv om det har vært foreslått for å målrette fascin1, aktin-kobling av protein [18]. Migrastatin kan binde seg til en av de actin-bindende steder hindrer aktin kryssbinding av filamenter og filopodia formasjon [18]. Over-ekspresjon av
fascin1
i kreftceller har tidligere blitt forbundet med klinisk aggressive karakteren av tumoren, dårlig prognose og forkortet sykdomsfri overlevelse tid [18-20].
Våre tidligere undersøkelser har vist oppregulering av
fascin
i svært invasive hjørnetann brystkreftcellelinjer [21]. Derfor brukte vi dem som en modell for undersøkelse av fascin-rettet mot narkotika, for eksempel migrastatin. Derfor, undersøkte vi en rolle av seks forskjellige analoger av migrastatin MGSTA-1 til 6, inkludert Danishefsky macroketone (MGSTA-5) og makrolakton (MGSTA-4), i hjørnetann brystcancercelle invasjon, migrering og cytoskjelettet omleiring.
de hjørnetann brystsvulster er attraktivt og nyttig modell for å studere menneskelig brystkreft fordi de fange essensen av menneskelig brystkreft, i motsetning til de fleste av genmodifisert eller xenograft gnagermodeller. For det første, hunder har samme miljø som mennesker, og dermed er utsatt for mange av de samme kreftfremkallende. For det andre, de tumorer forekommer hos hunder naturlig og spontant, og har en identisk kurs til den hos mennesker. Mange kliniske likheter er påvist så langt, om hormonelle årsaker til svulster, debutalder, risikofaktorer (f.eks fedme), klinisk utfall, prognosefaktorer (f.eks tumor størrelse, lymfeknute invasivitet og klinisk stadium) (for oversikt se: [ ,,,0],22-24];). I tillegg har mange sterke og betydelige likheter på molekylnivå er vist i genom komparative studier. For eksempel veier i forbindelse med promotering av spredning ble oppregulert i begge arter, og de som er knyttet celle utvikling, hudmatriks heft, og cellekommunikasjon, ble nedregulert [23]. Videre overekspresjon av steroidreseptorer, spredning markører, epidermal vekstfaktor, p53 suppressor genmutasjoner, metalloproteinaser og cyklo-oksygenaser, ble funnet i begge arter, så vel som stor homologi i de endringer i kreft-relaterte reaksjonsveier slik som fosfatidylinositol 3-kinase ( PI3K) /AKT vei, KRAS, fosfatase og tensin homolog (PTEN), Wnt-β-catenin, og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) kaskade [23,25]. Derfor utgjør hjørnetann brysttumor modell et verdifullt verktøy for translasjonell medisin spesielt for evaluering og utvikling av nye diagnostiske og prognostiske applikasjoner samt terapeutiske strategier som vil gagne både hunder og mennesker kreftpasienter [22-26].
Metoder
Cell kultur
De cellelinjer som benyttes for denne studien er beskrevet i vår tidligere publisert forskning [21,27]. To adenokarsinom-cellelinjer ble isolert fra hunde brysttumorer (CMT-W1 og CMT-W2) og to cellelinjer ble isolert fra deres lungemetastaser (CMT-W1M og CMT-W2M). Cellelinjene ble dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 50 U /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, og 2,5 pg /ml amfotericin B (-reagenser oppnådd fra Sigma Aldrich Chemical Co., USA). Celler ble dyrket i vevskulturflasker (Nunc ™, Danmark) i en atmosfære av 5% CO2 og 95% fuktet luft ved 37 ° C, og ble rutinemessig dyrket hver andre dag.
Migrastatin analoger
strukturene av testede migrastatin analoger (MGSTA-1 til 6) er presentert i figur 1.
Syntese av analoger av migrastatin
forbindelse MGSTA-4 og MGSTA-5 ble syntetisert fra 9 , som rapportert i litteraturen [9], mens forbindelsene MGSTA-1 til 3 og MGSTA-6 ble fremstilt fra 9 [9] som illustrert i figur 2. forestring av 9 Dermed med 5-heksensyre under Mitsunobu-betingelser, fulgt av ringlukningsmetatese (RCM) ga 10 og etterfølgende fjerning av TBS gruppe ga MGSTA-1. Behandling av 9 med karbontetrabromid i nærvær av polymer-båret trifenylfosfin i diklormetan ga det allyliske bromid 11 [9]. Etterfølgende omsetning av β-ketosulfone 12 i nærvær av DBU, etterfulgt av reduktiv fjerning av sulfongruppen ga 13. Ring avsluttes metatese og fjerning av TBS gruppe ga MGSTA-2. Den tiolakton ble fremstilt av 14 som ble først og fremst omdannet til tiosyren 15 ved anvendelse av Lawessons reagens [28]. Dannelse av tiolakton i henhold til Mitsunobu-betingelser, RCM og TBS fjerning ga MGSTA-3. TBS beskyttede macroketone 16 ble fremstilt fra 9 som tidligere beskrevet [9]. Dannelse av TMS enoleter ble oppnådd på en regioselektiv måte og etterfølgende oksydasjon med Pd (OAc)
2 ga α, β-umettet macroketone 17. Til slutt fjernelse av beskyttelsesgruppen ga TBS umettet macroketone MGSTA-6.
Reagenser og betingelser: (a) 5-heksensyre, Ph
3P, DIAD, PhCH
3, rt, 3 timer, 69%; (B) Grubbs 2
nd, PhCH
3, reflux, 25 min, 68%; (C) HF. Py, THF, rt, 18h, 61%; (D) CBr
4, Ph
3P polymer-bundet, CH
2 Cl
2, rt, 50 min; (E) 12, DBU, PhCH
3 deretter 11, rt, 1,5 timer; (F) Na /Hg, MeOH, rt, 3 H, 51% over tre trinn; (G) Grubbs 2
nd, PhCH
3, reflux, 15 min, 99%; (H) HF. Py, THF, rt, 38h, 84%; (I) Lawesson-reagens, CH
2 Cl
2, mw, 100 ° C, 10 min; (J) 9, Ph
3P, DIAD, PhCH
3, rt, 15t, 42%; (K) Grubbs 2
nd, PhCH
3, reflux, 15 min, 88%; (L) HF. Py, THF, rt, 18h, 85%; (M) TMSCl, LHMDS, THF, 0 ° C, 2 timer; (N) Pd (OAc)
2, CH
3CN, rt, 3t, 64% over to trinn; (O) HF. Py, THF, rt, 18t, 90%.
Celleviabilitet analysen (MTT-analyse)
Celleviabilitet (metabolsk aktivitet levedyktige celler) ble kvantifisert ved MTT-analyse. Celler ble sådd ut på 96-brønners plate (Nunc Inc., Danmark) ved en konsentrasjon på 1 x 10
4 celler per brønn. Når cellene nådde 60-70% konfluens, ble mediet erstattet med medium inneholdende 10% FBS og seks forskjellige migrastatin analoger (MGSTA-1 til 6) ved konsentrasjoner på: 1, 10 eller 100 um. Kulturene ble inkubert i 24 timer. Deretter ble cellene inkubert med 0,5 mg /ml tetrazoliumsalt MTT fortynnet i fenolrødt-fritt RPMI 1640-medium (Sigma Aldrich) i 4 timer ved 37 ° C. For å fullføre oppløsning av formazankrystaller ble 100 ul DMSO (dimetylsulfoksyd, Sigma Aldrich) tilsatt til hver brønn. Cellelevedyktigheten ble kvantifisert ved å måle fotometrisk absorbans ved 570 nm på en multi-brønn plateleser (uendelig 200 PRO Tecan ™, TECAN, Sveits). Alle prøvene ble undersøkt i tre eksemplarer, ble hvert eksperiment utført tre ganger (n = 9).
Cellekultur på et rekonstituert basalmembran (Matrigel)
Kreftceller ble behandlet med trypsin og resuspendert i kulturmedium. Hver brønn i den Lab-Tek 8-kammer kulturglass (Nunc Inc., USA) ble belagt med 25 ul av vekstfaktor redusert Matrigel (BD Biosciences) og objektglassene ble etterlatt til å stivne i 30 minutter. ved 37 ° C. Cellene ble deretter sådd ut ved en konsentrasjon på 10
4 celler /ml i migrastatin analog-inneholdende medium eller mediet med tilsetning av DMSO (medikament kjøretøy). Veksten av celler på Matrigel ble observert hver dag under fase-kontrast mikroskop (IX 70 Olympus Optical Co., Tyskland). Eksperimentet ble utført tre ganger (n = 3).
In vitro
sårheling analysen (skrape test)
scratch Analysen ble utført for å vurdere påvirkning av migrastatin analoger på canine brystkreft cellemotilitet. Cellene ble sådd ut i en høy tetthet på 600 mm petriskåler (Corning-Costar, Cambridge, USA). Etter 24 timer ble mediet fjernet og erstattet med medium inneholdende 10% FBS og en av seks migrastatin analoger (MGSTA-1 til 6) eller DMSO (kontroll). Den mono ble såret ved å skrape i overflaten: som jevnt og rett som mulig med en pipette tips (1000 mL) minst tre ganger. Bildene av cellene som invaderer bunnen ble tatt ved angitte tidspunkter (0, 4, 6, 8 og 24 timer) under anvendelse av fasekontrastmikroskopi (IX 70 Olympus Optical Co., Tyskland). Bildene ble analysert ved hjelp av en datamaskin-assistert bilde analysator (Olympus Microimage ™ Bildeanalyse, programvareversjon 4.0 for Windows, USA). Migrasjonen hastigheten ble uttrykt som prosent av bunnen lukking og ble beregnet som følger:% av skrapelukke = ab /a, hvor (a) er en avstand mellom kantene av såret, og (b) er den avstand som forble celle-fri under cellemigrasjon til å lukke såret [29].
verdiene presenteres som middel for tre uavhengige såret felt fra tre uavhengige forsøk (n = 9).
Trans-vel migrasjon analysen
Boyden kammer celle migrasjon analysen ble utført ved hjelp av BD Falcon ™ FluoroBlock ™ 24-multiwell Sett plater (8 micron porestørrelse) (BD Biosciences, USA). For det første, celler (1 x 10
5) ble suspendert i FBS fritt medium og lagt til de apikale kamre av en lagsplater (500 mikroliter). Deretter 750 ul kjemotiltrekkende (10% FBS) ble tilsatt til basal kamre. Migrastatin analoger (MGSTA-5 eller MGSTA-6 ved 100 pM) eller DMSO (som en kontroll) ble tilsatt til mediet i begge kamre. For doseavhengig studier MGSTA-6 ble benyttet i konsentrasjonsområde fra 0,1 til 100 uM. Migreringsforsøk ble utført i 18-20 timer ved vanlige kulturbetingelser. Deretter ble mediet forsiktig fjernet fra apikal kammeret og innsatsen systemet ble overført til en annen 24-brønners plate inneholdende 500 ul 2,5 ug /ml Calcein AM i Hanks «balanserte saltløsning (HBSS). Platene ble inkubert i en time ved standard dyrkningsbetingelser. Deretter ble fluorescensen av migrerte celler målt ved eksitasjon bølgelengde 485 nm og emisjonsbølgelengde 530 nm ved anvendelse av fluoriserende plateleser med bunn- lese evner Infinite 200 PRO Tecan ™ (Tecan, Sveits). Alle prøver ble analysert i triplikat, og hvert forsøk ble utført tre ganger (n = 9). For hvert eksperiment to negative kontroller ble anvendt: (1) celler dyrket som gitt ovenfor uten å legge kjemotiltrekkende til mediet, og (2) medium tilsatt som beskrevet uten celler. For å bestemme fluorescens av celler som migrerte gjennom membranen ble platene analysert ved hjelp av fluorescens mikroskop (Olympus BX60, forstørrelse x4).
Trans-brønn assay invasjon
celle invasjon Analysen ble utført bruk av BD BioCoat ™ 24-multiwell Invasion System pre-belagt med BD Matrigel ™ Matrix (BD Biosciences, USA). De mellomlagsplater ble først fremstilt ved å rehydrere BD Matrigel ™ Matrix lag med varm PBS i to timer ved 37 ° C. Den rehydrering Oppløsningen ble deretter forsiktig fjernet, og 500 ul av cellesuspensjonen ble tilsatt til den apikale kamrene (2,5 x 10
5-celler). Cellesuspensjonen ble fremstilt ved å trypsinizing cellemonolagene (80% sammenflytende) og resuspendering av cellene i FBS-fritt medium. Deretter 750 ul kjemotiltrekkende (10% FBS) ble tilsatt til basal kamre. For eksperimentet ble MGSTA-6 eller DMSO (som en kontroll) tilsatt til mediet i begge kamre. Invasjonsanalyse Platene ble inkubert i 22-24 timer ved vanlige kulturbetingelser. Deretter ble mediet forsiktig fjernet fra apikal kammeret og innsatsen system var farget med Calcein AM i HBSS på samme måte som beskrevet i migrasjon assay. Deretter ble fluorescensen til invaderte celler målt ved anvendelse av fluorescerende plateavles Infinite 200 PRO Tecan ™ (Ext.485 nm /Ems. 530 nm) (TECAN, Sveits). Alle prøvene ble analysert in triplo, ble hvert eksperiment utføres tre ganger (n = 9). For hvert forsøk utgjorde den negative kontrollmediet, hvor kjemotiltrekkende ikke ble tilsatt. For å bestemme fluorescens av celler som invaderte gjennom membranen belagt med Matrigel platene ble analysert ved hjelp av fluorescens mikroskop (Olympus BX60, forstørrelse x4).
Konfokalmikroskopi
canine brystcancerceller var dyrket på Lab-Tek dyrkningsobjektglass belagt med Matrigel i 24 timer i migrastatin inneholdende medium (MGSTA-6 ved en konsentrasjon på 100 uM). Deretter ble cellene vasket to ganger i varm PBS og fiksert med 3,7% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur (RT). Deretter ble cellene permeabilisert med 0,5% Triton X-100 fortynnet i PBS (10 minutter ved romtemperatur), vasket i PBS tre ganger og inkubert med primært kanin-anti-fosfo-FSCN1 (Ser39) antistoff ved 1: 100 fortynning i PBS ( BIOSs, USA). Etter inkubering over natten med primære antistoffer ved 4 ° C ble cellene vasket tre ganger i PBS og inkubert med sekundær Alexa Fluor 568 geite-anti-kanin-antistoff fortynnet 1: 500 i PBS (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA) og co-farget for F p-aktin med FITC-X phalloidin fortynnet 1: 100 i PBS (Invitrogen, USA) i en time i mørke ved RT. Glassene ble deretter montert på objektglass ved hjelp SlowFade®Gold montering medium (Life Technologies, Invitrogen). Celler ble visualisert ved hjelp av konfokal laser scanning mikroskop FV-500 system (Olympus Optical Co., Hamburg, Tyskland). Kombinasjonen av eksitasjon /emisjon var: Argon 488 nm laser med 505-525 nm filter for FITC og HeNe 543 nm laser med 610 nm filter for Alexa Fluor 568 farging. Bildene ble samlet inn separat for hver fluorescens kanal. Cellene ble undersøkt ved hjelp av Fluoview program (Olympus Optical Co., Tyskland). For å kvantifisere confocal resultatene, har vi analysert intensiteten av rød fluorescens relatert til fascin1 uttrykk og kolo intensiteten av flekker som viser samlokalisering av fascin1 og F-aktin på Slå sammen bilder, bruker dataassistert bilde analysator (Olympus Microimage ™ bildeanalyse , programvareversjon 5.0 for windows, USA). Fem til ti bilder i hvert lysbilde ble analysert. Antigenet sted Fargeintensiteten ble uttrykt som gjennomsnittlig pixel integrert optisk tetthet (IOD).
Statistisk analyse
Den statistiske analysen ble utført ved bruk av GraphPad Prism versjon 5.00 software (GraphPad Software, USA). Enveis ANOVA og Tukey HSD (Ærlig signifikant forskjell) post-hoc test, Dunnetts test og
t
-test ble brukt samt regresjonsanalyse. P-verdien 0,05 ble ansett som viktig, mens p-verdi 0,01 og 0,001 som svært viktig. Dataene ble uttrykt som gjennomsnitt +/- S.D. med mindre annet er angitt.
in vitro
sårheling analysen ble analysert ved hjelp av to-veis RM ANOVA og Bonferroni post-hoc test.
Diskusjon
Effekten av seks analoger av migrastatin på
Resultater og kreftcelle levedyktighet
Først undersøkte vi om de undersøkte analoger av migrastatin påvirket celle levedyktighet. Fire av disse kjemiske forbindelser (MGSTA-1, MGSTA-3, MGSTA-5, og MGSTA-6) ikke endre levedyktigheten til hundekreftceller på hvilken som helst brukte konsentrasjon (Figur S1). Imidlertid, levedyktigheten av de CMT-W1 og CMT-W2-celler signifikant redusert (ca. 29% og 32%, respektivt) etter behandling med MGSTA-4 i en konsentrasjon på 100 uM (p 0,01) (figur S1A, B ). Den levedyktighet av CMT-W1 celler også redusert etter inkubasjon med MGSTA-2 med ca 26% (figur S1 A). Reduksjonen av cellelevedyktigheten etter behandling med 100 uM av MGSTA-4 og MGSTA-2 kan ha blitt forbundet med deres cytotoksisitet derfor i de følgende forsøk, ble disse forbindelser som anvendes ved en konsentrasjon på 10 mM for å sikre at den observerte virkning av disse forbindelsene på migrering og invasjon var ikke et resultat av inhibering av celleproliferasjon og induksjon celledød.
Omvendt vi også observert at lavere konsentrasjoner av andre analoger av migrastatin forårsaket en svak økning i kreftcellen levedyktighet (f.eks MGSTA -5 eller MGSTA-6 i CMT-W1 cellelinje; MGSTA-1, MGSTA-2 i CMT-W2-cellelinje og MGSTA-3 i CMT-W1M og CMT-W2M cellelinjer) (fig S1). Derfor, for å unngå mulige kreftcellevekstfremming av behandlede forbindelser, i følgende forsøk vi brukte en høyest mulig konsentrasjon (100 uM) som ikke påvirker cellenes levedyktighet (eller avtagende verken øker sin levedyktighet). Videre har tidligere studier utført på human A549 lungekreft cellelinjen har vist at lavere konsentrasjoner av migrastatin analoger (ME – migrastatin kjerne eter) ikke påvirker cellevandring [13]. I tillegg er en studie av Shen og medarbeidere [11], hvor atten forskjellige semi-syntetisk fremstilte migrastatin beslektede forbindelser ble undersøkt, viste at bare to forbindelser oppviste cellemigrering hemming IC
50-verdier under 100 pM i den til sårheling analysen .
Hemming av hjørnetann brystkreftceller migrasjon av analoger av migrastatin evaluert av sårtilheling analysen
in vitro
sårheling analysen ble utført for å karakterisere effekten av analoger av migrastatin på migrasjon av hjørnetann kreftceller. Som vist i figur 3 to av seks undersøkte forbindelser (MGSTA-5 og MGSTA-6) forårsaket sterk hemmende effekt på cancercellemigrering i CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2-cellelinjer. I tillegg er også MGSTA-2 var ganske effektiv i CMT-W2 cellelinje ved tidspunktene 4, 6 og 8 timer etter skrape. Mens i kontrolltilstands celler stengt 39,2 ± 6,8%, 57 ± 7,5% og 84 ± 9,4% av såret (etter 4, 6 og 8 timer, henholdsvis), etter MGSTA-2 administrering celler lukkes bare 19,9 ± 2,1%, 29,6 ± 9,9% og 38,9 ± 8,8% av såret, respektivt. Imidlertid, etter 24 timer var såret helt lukket som i kontroll tilstand (figur 3B). Cellevandring ble ikke påvirket av noen av de undersøkte analoger migrastatin i CMT-W2M cellelinje (data ikke vist).
Kvantifisering av migrering av CMT-W1 (A), CMT-W2 (B) CMT- W1M (C) cellelinjer er presentert som prosentandeler av bunnen lukking og ble beregnet som følger:% av skrapelukke = ab /a, hvor (a) er en avstand mellom kantene av såret, og (b) er den avstand som forble celle-free under cellemigrasjon å lukke scratch. Fotografier av celler invaderer scratch ble tatt ved utgangspunktet og etter 4, 6, 8 og 24 timer ved hjelp av fasekontrastmikroskop (IX 70 Olympus Optical Co., Tyskland). Administrering av MGSTA-5 og MGSTA-6 (100 pM) ble redusert celler motilitet i CMT-W1, W2 og CMT-CMT-W1M cellelinjer. Den MGSTA-2-behandling minsket cellene motilitet bare i CMT-W2-cellelinjen. Andre migrastatin analoger ikke påvirker migrering evne undersøkte cellelinjer. (D) Representative bilder av grunnen nedleggelse i kontroll forhold og etter MGSTA-5 og MGSTA-seks behandling (100 mm) ved 8
th time etter riper i CMT-W1, CMT-W2 og CMT-W1M cellelinjer; bildene ble tatt med objektiv med 4x forstørrelse og analysert ved hjelp av en datamaskin-assistert bilde analysator (Olympus Microimage ™ Bildeanalyse, programvareversjon 5.0 for Windows, USA). Eksperimentet ble gjennomført tre ganger. Toveis ANOVA og Bonferroni post-hoc tester ble brukt. p 0,05 var merket som * og p 0.001 ble merket som ***.
MGSTA-5 gitt ved konsentrasjon på 100 mikrometer hemmet migrasjon av CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2 celler som svar på scratch såret. CMT-W1-celler behandlet med MGSTA-5 lukkes bare 29 ± 6,5% og 56 ± 5,2% av såret (etter 6 og 8 timer, henholdsvis), mens i kontrollforhold 50 ± 7,2% og 78 ± 7,8% av såret ble lukket 6 og 8 timer etter riper, henholdsvis (figur 3A). På samme måte, CMT-W2-celler inkubert med MGSTA-5 (100 uM) lukkes bare 30 ± 3,8% og 43 ± 3% av såret 6 og 8 timer etter skraping (henholdsvis), mens de lukket i kontrollforhold 57 ± 7,5% og 84 ± 9,4% av såret på den tiden (henholdsvis 6 og 8 timer) (figur 3B). På tilsvarende måte, også CMT-W1M celler inkubert med denne forbindelsen stengt 21 ± 7,7% og 30 ± 7,4% av såret 6 og 8 timer etter skrape, henholdsvis, mens kontrollcellene lukket 59 ± 6,3% og 80 ± 8,7% av såret ved de samme tidspunkter (Figur 3C). Videre gjorde CMT-W2 og CMT-W1M cellelinjer behandlet med MGSTA-5 ikke lukke såret selv etter 24 timer med skrape (74 ± 7,3% og 52 ± 7,8% nedleggelse, henholdsvis). I kontrollforhold, såret var helt lukket (figur 3B, C).
MGSTA-6 også vist seg å være en svært effektiv hemmer av migrasjon. CMT-W1 cellelinje behandlet med denne agenten stengt bare 25 ± 5,1% og 37 ± 2,8% av såret 6 og 8 timer etter skrape (Figur 3C). Behandling av CMT-W2 celler med MGSTA-6 redusert også deres migrasjon evne. Det var stor betydning 8 og 24 timer etter riper. I kontrollbetingelser såret ble nesten helt lukket på den tid (86-100%), mens celler behandlet med MGSTA-6 lukkes bare 52 ± 8,1% og 78 ± 5,2% av såret, henholdsvis (figur 3B). Den MGSTA-6 forårsaket en lignende effekt i CMT-W1M cellelinje, som ble manifestert ved nesten komplett blokk av migrasjon (9 ± 6,8% og 21 ± 3,7% for sårheling 6 og 8 timer etter riper, henholdsvis). Etter 24 timer bare 41 ± 4,2% av såret ble lukket (figur 3C).
Danishefsky og medarbeidere oppnådd lignende resultater [13]. Forfatterne undersøkte anti-metastatiske egenskaper migrastatin kjerne eter (ME) og karboksymetyl- migrastatin eter (CME). Begge forbindelser gitt ved en konsentrasjon på 100 uM nesten fullstendig blokkerte migrering av human ikke-småcellet lungekarsinom 12 timer etter begynnelsen. Forfatterne basert på sårheling analyse bestemmes den halv maksimal hemmende migrasjons konsentrasjon (IC
50 verdi), som var lavere enn det som oppnås i vår forskning med å bruke trans-brønn migrasjonsanalyse (diskusjon nedenfor). Den mest effektive inhibering av migrering i tre hjørnetann kreftcellelinjer, evaluert ved sårheling assay ble oppnådd med MGSTA-5 og MGSTA-6 ved konsentrasjon på 100 uM, og disse to ble brukt for ytterligere karakterisering. Selv om MGSTA-2 inhiberte migrering evnen til CMT-W2-celler var ineffektive i andre cellelinjer. I sin tur, MGSTA-4 (Danishefsky «makrolakton») ved høy konsentrasjon på 100 uM i betydelig grad hemmet celleproliferasjon av to cellelinjer (CMT-W1 og CMT-W2) (fig S1 A, B), men ved lavere konsentrasjon (10 pM ) hadde ingen effekt på cellemigrering (figur 3). Disse avvikene kan skyldes forskjellig karakteristikk av hjørnetann cellelinjer.
Hemming av migrasjon og invasjon av hjørnetann brystkreftceller ved to de mest effektive analoger av migrastatin (MGSTA-5 og MGSTA-6) evaluert av Boyden kamre analysen
for å bekrefte anti-metastatisk aktivitet av to forbindelser som var mest effektive i sårheling analysen, utførte vi migrering og invasjon analyser i Boyden kamre.
Kreft celle migrasjon ble betydelig redusert etter 24 timers inkubering med 100 uM av MGSTA-5 og MGSTA-6 i CMT-W1 og CMT-W1M cellelinjer. Fluorescens intensitet knyttet til trekkende celler i kontroll forholdene var 10,3 ± 2,5, og 19,7 ± 3,1 i CMT-W1 og CMT-W1M cellelinje, henholdsvis, mens behandling med macroketone MGSTA-fem redusert de relative fluorescerende enheter (RFU) til 5,6 ± 1,2 og 14,2 ± 2,1 i CMT-W1 og CMT-W1M cellelinje, henholdsvis (figur 3A). En tilsvarende effekt ble oppnådd i celler behandlet med MGSTA-6. RFU redusert til 4,2 ± 1,2 og 3,8 ± 1 i CMT-W1 og CMT-W1M cellelinje, henholdsvis (figur 4A). Migrering av CMT-W2-celler ble nesten fullstendig hemmet av disse forbindelser. Imidlertid ble ingen virkning på migrering av CMT-W2M-celler er angitt, selv om en liten reduksjon ble observert (figur 4A).
(A) Kvantifisering av migrering av undersøkte cellelinjer (CMT-W1, CMT-W1M , CMT-W2, CMT-W2M) er presentert som Relativ Florescent enheter (RFU) oppnådd ved hjelp av fluorescerende plateleser Infinite 200 PRO Tecan ™ (Ex. 485, Em. 530). Behandlingen av kreftceller med MGSTA-5 og MGSTA-6 i 20 timer ved en konsentrasjon på 100 uM redusert migrering gjennom membranen av CMT-W1, og CMT-W1M celler og nesten fullstendig opphevet migrering av CMT-W2-celler. I CMT-W2M cellelinje disse forbindelser var ineffektiv. Eksperimentet ble gjennomført tre ganger. Den statistiske analysen ble gjort ved hjelp av Prism versjon 5.00 software (GraphPad Software, USA). Enveis ANOVA etterfulgt av Tukey HSD post-hoc test og uparet t-test ble brukt. p 0,05 var merket som *, p 0.001 ble merket som ***. (B) mikrografer av de migrerte CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2 celler tatt med Olympus mikros BX60 på x4 forstørrelse.
Den kreftcelle invasjon Analysen ble utført bare med den mest potente analog av migrastatin (MGSTA-6). Invasivitet av CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2 canine cancercellelinjer ble signifikant redusert ved denne forbindelsen administrert ved en konsentrasjon på 100 uM i 24 timer. Fluorescensintensiteten knyttet til de invaderte CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2-celler i kontrollforhold var 11 ± 1.7, 9.7 ± 0.6, og 11.4 ± 1.5, respektivt (figur 5A). Administrasjon av MGSTA-6 redusert invasivitet av kreftceller. Den florescence intensiteten til invaderte CMT-W1, CMT-W1M og CMT-W2 celler var 6,7 ± 0,6, 6,6 ± 0,6, 7,3 ± 0,7, henholdsvis (p 0,005). Invasjonen av CMT-W2M celle ble ikke påvirket av MGSTA-6. Den mikroskopiske analyse utført ved hjelp av fluorescens mikroskopi bekreftet oppnådde resultater (Tall 4B og 5B).
(A) Kvantifisering av invasivitet av undersøkte cellelinjer (CMT-W1, CMT-W1M, CMT-W2, CMT-W2M ) er presentert som Relativ Florescent enheter (RFU) oppnås ved hjelp av fluorescerende plateavles Infinite 200 PRO Tecan ™ (Ex. 485, Em.530). Behandlingen av kreftceller med MGSTA-6 i 24 timer ved en konsentrasjon på 100 uM redusert invasivitet gjennom membranen på forhånd belagt med Matrigel ™ Matrix, av CMT-W1M, CMT-W2, CMT-W1M celler. I CMT-W2M cellelinje MGSTA-6 var ineffektiv. Eksperimentet ble gjennomført tre ganger. Den statistiske analysen ble gjort ved hjelp av Prism versjon 5.00 software (GraphPad Software, USA). Enveis ANOVA etterfulgt av Tukey HSD post-hoc test og uparet t-test ble brukt. p 0,05 var merket som *. Eksperimentet ble gjennomført tre ganger. Eksperimentet ble gjennomført tre ganger. Eksperimentet ble gjennomført tre ganger.
