Abstract
Dårlig prognose av leverkreft (HCC) forbundet med sen diagnose krever utviklingen av tidlig diagnostiske biomarkører. Vi har tidligere avgrenset landskapet av DNA metylering i HCC pasienter unraveling betydningen av arrangøren hypometylering i aktivering av kreft og metastase kjøring gener. Hensikten med denne studien var å teste muligheten at gener som er hypomethylated i HCC kunne tjene som kandidat diagnostiske markører. Vi bruker smelte analyse høy oppløsning (HRM) som en enkel oversett PCR-basert metode for å definere metylering stater i kliniske prøver. Vi testet syv regioner valgt fra shortlist av gener hypomethylated i HCC og viste at HRM analyse av flere av dem skiller metylering tilstander i leveren kreft prøver fra normal tilstøtende leveren og kronisk hepatitt i Shanghai-området. Slike områder ble identifisert innen arrangører av neuronal membran glykoprotein M6-B (GPM6B) og melanom antigen familie A12 (MAGEA12) gener. Forskjeller i HRM i immunglobulin super Fc reseptor (FCRL1) atskilt invasive svulster fra mindre invasiv HCC. De identifiserte biomarkører differensiert HCC av kronisk hepatitt i et annet sett med prøver fra Dhaka. Selv om hoved fremstøt i DNA-metylering diagnostikk i kreft er på hypermethylated gener, vår studie for første gang illustrerer den potensielle bruken av hypomethylated gener som markører for solide svulster. Etter ytterligere validering i en større kohort, er identifisert DNA hypomethylated regioner kan bli viktige kandidat biomarkører for leverkreft diagnose og prognose, spesielt i befolkninger med høy risiko for HCC utvikling
Citation. Stefanska B, Bouzelmat A, Huang J, Suderman M, Hallett M, Han ZG, et al. (2013) Discovery og validering av DNA Hypomety-lering Biomarkører for leverkreft Bruke HRM-Specific prober. PLoS ONE åtte (8): e68439. doi: 10,1371 /journal.pone.0068439
Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA
mottatt: 18 mars 2013; Godkjent: 29 mai 2013; Publisert: 07.08.2013
Copyright: © 2013 Stefanska et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra Ministere du Developpement Economique, de l’Innovation et de l’utførsel (MDEIE) program av regjeringen i Quebec (nr 215004, til MS), den kanadiske Institute of Health Research (nr MOP-42411, til MS) og International Centre for Diaré-sykdommer Research, Bangladesh (ICDDR, b). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Avvik i epigenetiske modifikasjoner, spesielt i DNA metylering mønstre, har vært knyttet til kreftutvikling og progresjon i mange studier i siste tiår [1], [2], [3]. Hypermethylation av tumorsuppressorgener knyttet til transkripsjonen stanse, global DNA demetylering forbundet med genom rearrangements og ustabilitet, og nylig rapportert promoter hypometylering knyttet til aktivering av onkogener og prometastatic gener er kjennetegnene på nesten alle typer kreft [2], [3], [ ,,,0],4], [5]. DNA hypermethylation av tumorsuppressorgener har vist seg å ha diagnostisk potensial i flere krefttyper [6], [7], [8], men vår siste opptrevling av det brede omfanget av hypometylering i leverkreft antydet at potensielle biomarkører kan finnes i hypomethylated gener som spiller en avgjørende rolle i å drive kreft og kreft metastase [4]. Identifisering pålitelige biomarkører for HCC er av spesiell betydning siden slutten av kliniske symptomene står for en sen diagnose og høy dødelighet. Det er anslått at tidlig påvisning av HCC øker herdehastigheten fra 5% til 80% [9].
Vi har tidligere brukt et genom-wide tilnærming å avgrense DNA promoter metylering profiler i HCC svulster og avslørte nesten 2000 gener som promotorer ble hypomethylated i tumorer sammenlignet med matchet tilstøtende normalt vev [4]. Disse genene ble innblandet i biologiske prosesser og trasé avgjørende for kreftutvikling og invasjon, som peker på en viktig funksjonell rolle de observerte endringer. Hypometylering ble observert i flere genfamilier tvers av kromosomer. Spørsmålet oppsto om det vil spesielt markere svulster og skille tumorprøver fra friske vevet. I vårt tidligere arbeid, har vi fokusert på sammenligning mellom forskjeller i gjennomsnittlig DNA metylering i hele promoter og anti-korrelerte endringer i genuttrykk. Vi analysert i detalj 230 gener som ble hypomethylated og indusert i HCC svulster. De fleste av disse genene falt i en kategori av arrangører med høy CpG innhold. I denne studien på DNA hypometylering biomarkører for leverkreft, må vi først valgte gener som var tungt hypomethylated i HCC prøvene sammenlignet med matchet tilstøtende normalt vev (≥2 ganger endring i promoter metylering basert på microarray analyse,
P
10E-4). Denne gruppen av gener ble deretter siktet for de mest konsekvent hypomethylated probe (200-400 bp region, ≥1.5 ganger endring,
P
10E-3) på tvers av de pasientene som bestemmes av microarray analyse. For å øke den funksjonelle relevansen av potensielle biomarkører, vi senere begrenset denne listen til 47 gener som ble indusert i HCC tumorer målt ved Affymetrix arrays (≥1.5 ganger endring,
P
0,05, Tabell S1 ). Ta hensyn til endringer i promoter metylering, uttrykk, og omfanget av demetylering av de spesifikke sonder, har vi valgt sju gener som viste den høyeste promoter hypometylering, de hypomethylated sonder på tvers av pasienter og høy induksjon av uttrykket. I tillegg begrenses vi listen til gener med kreftrelaterte funksjoner basert på offentlig tilgjengelige datasett som beskrevet nedenfor. Disse syv hypomethylated gener som er oppført i tabell 1 ble valgt for å identifisere og optimalisere spesifikke prober som differensial metylering ville skille svulster fra normalt vev ved hjelp av High Resolution Melting analyse (HRM). HRM analysen er en enkel PCR-basert metode for lett å oversette til klinisk miljø for påvisning av forskjeller i DNA-metylering mønstre [10]. Denne metoden krever behandling av DNA med bisulfit som konverterer cytosinrester til uracil forlate 5-metylcytosin rester upåvirket. Etter forsterkning, resulterer det i endringer i DNA-sekvensen hvor uracil er konvertert til tymidin og 5-metylcytosiner forblir som cytosines. Unmethylated DNA fragment som inneholder tymidin i stedet for cytosin innen CpG sekvenser viser forskjellige smelteegenskaper enn denaturert DNA. Etter primer optimalisering, tre sonder som tilsvarer tre gener
nevronale membranglykoprotein M6-B product: (
GPM6B
),
FØFLEKKREFT antigen familie en 12 plakater (
MAGEA12
), og
immunglobulin SUPERFAMILY Fc-reseptor product: (
FCRL1
), ble funnet å skille HCC fra tilstøtende normalt vev og /eller invasive svulster fra ikke-invasive svulster i en kinesisk sett av prøver som samt HCC av kronisk hepatitt B infeksjon (CHB) i prøver fra Bangladesh.
GPM6B
er involvert i nevral utvikling og regulering av beindannelse [11], [12]. Ekspresjon av dette genet ble vist i genomet bred transkriptomet profilering for å tjene som en prediktor for hjernetumorer [13], [14] og lymfoide leukemier [15]. Høy uttrykk for
MAGEA12
, et medlem av onkogen
MAGE
familie, ble vist å være assosiert med blære carcinoma [16], melanom [17], brystkreft [18] og muntlig plateepitelkarsinom karsinom [19].
FCRL1
er et celleoverflatemembranprotein fortrinnsvis uttrykt på B-celler som regulerer B-celleaktivering og differensiering [20]. Høy ekspresjon av dette genet ble observert i metastatiske melanomer [21] og i ulike typer leukemier [20]. Ingen av disse genene eller deres tilstand av metylering ble tidligere knyttet til HCC.
MAGEA12
ble vist før for å bli undertrykt i normale celler ved promoter metylering og aktiveres i kreftceller ved demetylering [22], [23], mens rollen som
GPM6B Hotell og
FCRL1
metylering i promoter aktivitet var ikke tidligere testet. Vår nåværende studie bekrefter for første gang overekspresjon av
GPM6B
,
MAGEA12 Hotell og
FCRL1
i HCC pasienter i forhold til normalt vev og undersøker DNA metylering innenfor sine arrangører som en potensiell diagnostisk markør av leverkreft. Siden tidlig diagnose av HCC øker herdehastighet og overlevelse, kunne de identifiserte epigenetiske kandidat biomarkører ha en innvirkning på leveren kreft terapi utfallet etter validering i en større kohort.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke, og etikkomiteen fra berørte institusjoner (Chinese National human Genome Center på Shanghai, Kina og Bangabandhu Sheikh Mujib Medical University (BSMMU), Dhaka, Bangladesh) godkjent studiet .
pasienter og vevsprøver
Kreft og normal tilstøtende vevsprøver ble oppnådd fra 12 pasienter med HCC og en pasient med inflammatorisk pseudo (kontroll pasient) i kinesisk National human Genome Center på Shanghai, Kina (Dr. Ze-Guang Han) (tabell 2). kohort Bangladesh besto av 4 HCC pasienter og 4 KHB pasienter i Bangabandhu Sheikh Mujib Medical University (BSMMU), Dhaka, Bangladesh (tabell 2). HCC Prøvene ble tatt ved ultrasonogram guidet tynn nål aspirasjon, mens KHB prøvene ble tatt ved per-kutan leverbiopsi bruker Tru snitt biopsi nål. I begge tilfeller lokalbedøvelse ble brukt.
DNA og bisulfite behandling av DNA
DNA fra kreft, normale grenser, og KHB prøvene ble isolert ved hjelp av standard fenol-kloroform ekstraksjon teknikk. Bisulfitt omdannelse ble utført som tidligere beskrevet [24]. I korthet ble 2 ug av DNA ble linearisert med EcoRI og inkubert i 3 timer ved 37 ° C, etterfulgt av rensing under anvendelse av Quick Clean PCR Purification Kit (GenScript) i henhold til produsentens protokoll. Det rensede DNA ble så denaturert med 3M NaOH og inkubert i 15 minutter ved 37 ° C. Nyfremstilt 3,6 m natriumbisulfitt /1 mM hydrokinon blanding (pH 5.0) ble tilsatt til denaturert DNA og inkubert i 2 minutter ved 95 ° C og deretter 8 timer ved 55 ° C etterfulgt av 2 minutter ved 95 ° C og 2 timer ved 55 ° C. DNA-prøver ble så avsaltet og renset (Quick Clean PCR Purification Kit, GenScript). Det rensede DNA ble igjen denaturert med 3M NaOH og inkubert i 15 minutter ved 37 ° C. Oppløsningen ble nøytralisert ved tilsetning av ammonium-acetat til en sluttkonsentrasjon på 10 M, og DNA ble utfelt med 95% etanol og pelleten ble resuspendert i 50 ul destillert vann.
PCR-amplifisering av bisulfitt konvertert DNA
amplifikasjonsreaksjoner inneholdt 25 ug av bisulfitt-behandlede genomisk DNA, 0,4 uM forover og revers primere er oppført i Tabell S2, 10 pl 10 x Lys Cycler 480 SybrGreen i Master (Roche) i et sluttvolum på 20 ul. Amplifikasjon ble utført i en termosykler ved anvendelse av følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, forsterkning for 40 sykluser ved 95 ° C i 1 minutt, annealing temperatur i 2 min 30 s, 72 ° C i 1 minutt, og endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. Som vist i Tabell S2, ble utvendige og nestede primersett brukt til flere sonder for å forbedre effektiviteten av utvidelsen. Den forsterkede DNA ble deretter utsatt for smelting høy oppløsning (HRM).
Høy oppløsning smelteanalyse (HRM)
amplifiserte DNA ble overført til lyset Cycler 480 QPCR instrument (Roche) som gjør det mulig HRM. Prøvene ble gradvis oppvarmet fra 40 ° C i 1 minutt til 60 ° C i 15 s, og til slutt DNA ble smeltet ved 95 ° C i 15 sek. Smelte av PCR-produktet induserer en reduksjon i fluorescensen av SybrGreen siden SybrGreen som en DNA-interkalerende fargestoff frigjøres fra dobbelt-trådet DNA etter dissosiasjon. Fluorescens-signalet er oppnådd under smeltefase og analyseres av lyset Cycler 480 programvare. Temperaturen i en smeltetopp av DNA amplikon er definert ved midtpunktet av smeltefase ved hvilken frekvensen av endringer i fluorescens er den største. Dette smeltepunkt er avhengig av rekkefølgen og lengden av amplikonet og er spesifikk for hvert produkt. Som følge bisulfitt omdannelse metylert DNA etter forsterkning inneholder CG basepar, er smeltetemperaturen for en unmethylated versjon som inneholder TA basepar forskjellig. Den metylert amplikon smelter ved høyere temperatur enn når unmethylated og prøver av forskjellig metylering tilstand kan separeres ved å sammenligne smeltekurvetopper. Ved anvendelse av 0% og 100% denaturert kontroll-DNA, viste vi at de testede probene viser klare forskjeller mellom unmethylated og fullstendig denaturert DNA. 0% metylert kontroll ble dannet ved anvendelse av hele genomet amplifikasjon kit (Sigma), mens 100% kontroll er laget av
in vitro
metylering reaksjon katalysert ved SSSI metyltransferase, i nærvær av en metyl- donor S-adenosyl-L-metionin ( SAM). Melting kurven topper i HCC svulster ble sammenlignet med gjennomsnittet av smeltetopper i normale tilstøtende vev fra 7 personer med ikke-invasiv HCC. Dette gjennomsnittet kurve ble kalt her som vanlig ved referanse (NorAdjRef).
pyrosekvensering
Spesifikk bisulfite konvertert promotersekvenser ble forsterket med HotStar Taq DNA polymerase (Qiagen) ved hjelp av biotinylerte primere oppført i tabell S2. De biotinylerte DNA-trådene ble pyrosequenced i PyroMarkTMQ24 instrument (Biotage, Qiagen) som tidligere beskrevet [25]. Data ble analysert ved hjelp av PyroMarkTMQ24 programvare.
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR (QPCR)
Total RNA ble isolert ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. 1 pg av total RNA virket som et templat for cDNA-syntese ved anvendelse av 20 U AMV revers transkriptase (Roche Diagnostics), som anbefalt av produsenten. QPCR Reaksjonen ble utført i lys Cycler 480 maskin (Roche) ved anvendelse av 2 pl av cDNA, 400 nM forover og revers primere er oppført i Tabell S2 og 10 ul av Lys Cycler 480 SybrGreen I Master (Roche) i et sluttvolum på 20 ul . Amplifikasjon ble utført ved anvendelse av følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, amplifikasjon i 60 sykluser ved 95 ° C i 10 sekunder, annealing temperatur i 10 s, 72 ° C i 10 s, og endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. Kvantifisering ble utført ved hjelp av en standardkurve og analysert av Roche LightCycler 480 programvare.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av uparet tosidig
t
-test eller Mann -Whitney
U
test. Mann-Whitney
U
test ble brukt for sammenligninger mellom to grupper hvor utvalgsstørrelsene var liten, og det var derfor vanskelig å verifisere fordelings forutsetninger. I hvert tilfelle ble test ledsaget av et spredningsplott som viser alle verdier som benyttes i testen. Gjennomsnittsverdier er gitt ± S.D. Der det er nødvendig,
P
-verdier er justert for flere tester med Bonferroni korreksjon. For sammenligninger av fire vs. fire prøver (Bangladesh kohort), vi brukte også en permutasjon test hvor dataene ble stokket 10.000 ganger og testen statistikken ble omregnet for hver shuffle. R programvaremiljøet for statistisk databehandling ble brukt for alle statistiske analyser unntatt permutasjon test der resampling Stats-tillegget for Excel-programvare ble brukt (Stan Blank, Charles Seiter, Peter Bruce og resampling statistikk, Inc. 2000, Institutt for statistikk utdanning, USA).
Resultater
Testing og identifisering av kandidat hypomethylated regioner i HCC av HRM analyse
målet med vår studie var å identifisere og optimalisere hypomethylated regioner i HCC som kan skille HCC fra normalt vev ved hjelp av HRM. Vi søkte flere kriterier som vi spådde vil øke sannsynligheten for at sondene er overalt forskjellig metylert i HCC. Først valgte vi sju gener (oppført i tabell 1) som ble identifisert i vår forrige skjermbilde av hypomethylated gener i leverkreft ved hjelp metylert DNA immunoprecipitation (MeDIP) og hybridisering til genom-wide promoter oligonukleotid arrays. For det andre genet promotorer inneholdt prober med en gjennomsnittlig gangers reduksjon i metylering mellom HCC og normal lever høyere enn eller lik 2, og var meget statistisk signifikant (
P
10E-4). Tredje, hypometylering av sine arrangører var også assosiert med overekspresjon i nesten alle pasientene som ble studert tyder robusthet og funksjonelle relevansen av disse DNA demetylering endringer i HCC (figur 1A-C). Fjerde, analyse av sine funksjoner basert på offentlig tilgjengelige datasett som Gene ontologi (GO), KEGG, og NCBI avslører biologiske prosesser og mekanismer som er sentrale for kreftutvikling som regulering av cellesyklus, celle adhesjon, celle-cellesignalisering, spredning og differensiering (tabell 1). Femte, genene ble tidligere forbundet med kreft hos mennesker, spesielt
MAGEA12 product: [16], [17], [18], [19] men bare
PLATER LARGE (Drosophila) homolog tilknyttet protein 5 product: (
DLGAP5
) og
MATRIX METALLOPEPTIDASE en product: (
MMP1
) har tidligere blitt rapportert å være oppregulert i HCC svulster [26], [27] . Sjette, ved hjelp av offentlig tilgjengelige uttrykk microarray data (Oncomine), viser vi at tre av de genene som inneholdt sonder optimalisert for HRM analyse (se avsnittet nedenfor) viser økt uttrykk i mange forskjellige typer kreft som leukemi, eggstokkreft og kreft i bukspyttkjertelen (
GPM6B Hotell og
FCRL1
), nyre- og endetarmskreft (
GPM6B Hotell og
MAGEA12
), HCC og brystkreft (
MAGEA12 Hotell og
FCRL1
), testikkelkreft og føflekkreft (signifikant overekspresjon av
GPM6B
både kreft og
MAGEA12
i melanom) (figur 1D-F). Dataene er konsistente med en generell rolle for disse proteinene i mange forskjellige typer kreft og foreslå deres grunnleggende rolle i kreft progresjon og /eller metastase.
(A) En heatmap viser log
2 differensial metylering ( M) og uttrykk (E) probe intensiteter for de angitte sju gener i hver HCC pasientprøver målt ved mikromatriser. (B, C) Boksplott av disse metylering (B) og uttrykk (C) forskjeller i HCC pasienter (log
2 [kreft-normal]). Negative metylering forskjellene indikerer hypometylering i HCC og positive uttrykk forskjeller reflektere høyere uttrykk i tumorprøver sammenlignet med matchet tilstøtende normalt vev. (D, E, F) Kreft genuttrykk nivåer hentet fra microarray data for
GPM6B product: (D),
MAGEA12 product: (E), og
FCRL1 product: (F). Den normale versus svulst gene expression data ble hentet fra Oncomine og presenteres som log
2-transformert median sentrert per rekke, og SD-normalisert til 1 per array. Alle de presenterte endringene er statistisk signifikant (
P
0,05), bortsett fra
MAGEA12
i testikkelkreft og
FCRL1
i testikkelkreft og melanom. (G, H, I) Smelte kurver og smeltekurve topper for 0% og 100% denaturert kontroll DNA forsterket for
GPM6B plakater (G),
MAGEA12 product: (H) og
FCRL1 product: (i) sammen med et kart over arrangører av de testede genene flankerer sondene som er valgt for HRM analyse. Horisontale piler indikerer posisjonen av primerne anvendt for HRM. HRM for 0% og 100% metanoldenaturert kontroll-DNA er vist. CpG områder som ligger innenfor den forsterkede sonden er sirklet og nummerert. Den antatte transkripsjonsfaktor bindingsseter er angitt som spådd av TransFac.
Tre prober som tilsvarer
GPM6B
,
MAGEA12
, og
FCRL1
optimalisert for HRM analyse av differensial metylering i HCC
Flere metylering uavhengig primersett ble utsatt for optimalisering for HRM analyse (se primer sekvenser i tabell S2). Kontroll-DNA som ble metylert ved 0% og 100% (standard) ble amplifisert med primerene og smeltet i sanntid. Smeltingen mønster av amplikonene ble etablert og analysert. Melting kurver for begge standarder ble plottet i samme diagram og utstilt forskjellige temperaturer på smeltetopper (Figur 1G-H). Vi deretter screenet 12 HCC og 12 normale leverprøver fra Shanghai-kohorten for metylering stat innenfor alle 7 sonder bruker utformet primere. Fire sonder utstilt høy heterogenitet av metylering mønster i tumorer, som ble reflektert i flere smeltetopper i HRM analyse for en enkelt prøve. Tre andre prober for
GPM6B
,
MAGEA12
, og
FCRL1
viste en klar one-topp smelting mønster og ble brukt for videre analyser som kandidat DNA-metylering markører. Overekspresjon av disse genene ble vist i andre kreftformer, for eksempel høyere uttrykk av
GPM6B
var assosiert med hjernesvulster [13], [14] og lymfoid leukemi [15],
MAGEA12
var opp -regulated i blære carcinoma [16], melanom [17], brystkreft [18] og muntlig plateepitelkarsinom [19], mens
FCRL1
induksjon ble observert i metastatiske melanomer [21] og i ulike typer leukemi [20].
Differensial HRM mønster av amplikonene i
GPM6B
,
MAGEA12
, og
FCRL1
skiller HCC fra normal lever
HRM analyse av tumorer (n = 12) og tilstøtende normale vev (n = 12) ble utført. Smeltekurver ble plottet og temperaturen av en smeltetopp ble beregnet som beskrevet i fremgangsmåtene. Som det metylerte DNA-fragment smelter ved høyere temperatur enn amplikonene fra unmethylated bisulfitt omdannet DNA, kan prøver av forskjellige tilstander metylering differensieres ved å sammenligne smeltekurvetopper. Det er en vanlig praksis å sammenligne tumorer med patologisk normal tilstøtende vev fra den samme pasient. Imidlertid kan det resultere i falske negative resultater siden såkalt normal leveren kan allerede forvandlet molekylært og vises endrede DNA metylering mønstre uten å stille endringer i histopatologi, særlig hos pasienter med svært invasive svulster. Fem pasienter i prøvesettet ble diagnostisert med invasiv HCC hvor portvenen svulst blodpropp (PVTT) ble oppdaget. Vi antok at normal tilstøtende leveren kan allerede forandret hos disse pasientene. Vi skapte derfor en normal referansekurve (NorAdjRef) ved gjennomsnitt smeltekurver for alle tilstøtende normalt vev unntatt pasienter med PVTT. Vi foreslår at en slik referansekurve kan bli ytterligere forbedret ved å inkludere HRM resultater fra et stort utvalg av ikke-kreft levervev og bli brukt som en generell standard for sammenligning for nye tilfeller, spesielt når man har mistanke om invasjon i tilstøtende vev. Faktisk, metylering av
GPM6B
sonde i tumorprøve fra pasienten 5 var det samme som i sin tilstøtende normalt vev, men det var forskjellig fra NorAdjRef bekreftet ved bruk av et gjennomsnitt normalt som en standard for sammenligning (figur 2A Figur 3A). Pasienter 1-6 med PVTT utstilt samme metylering stat i
FCRL1
sonde når deres svulster ble sammenlignet med deres matchet tilstøtende normalt vev men igjen HRM profilene var forskjellig fra NorAdjRef (figur 2C). Således, ved hjelp av en gjennomsnittlig normal standard vi var i stand til å kalle disse prøvene som HCC, noe som ville vært umulig hvis vi brukte den tilstøtende vev som referanse.
(A-C) Smeltekurve toppene
GPM6B product: (A),
MAGEA12 product: (B) og
FCRL1 product: (C) amplikonene i 12 tumorprøver og 12 matcher tilstøtende normalt vev. Toppene for HCC med PVTT (PVTT-HCC), HCC uten PVTT (non-PVTT-HCC), og pseudo fagene ble sammenlignet med gjennomsnittet av normale tilstøtende vev fra ikke-PVTT pasienter (NorAdjRef). I det andre panel, ble smeltetopper på tumorprøver av HCC pasienter med PVTT plottet sammen med gjennomsnittet av tilpassede tilstøtende normale vev fra disse pasientene, mens det femte felt er et gjennomsnitt av HCC med PVTT og HCC uten PVTT i sammenligning med NorAdjRef. Temperaturverdier for smelting toppene i hver pasient er vist i spredningsplott og i tabell 3.
(A-C) Smelte kurven toppene
GPM6B product: (A),
MAGEA12 product: (B) og
FCRL1 product: (C) amplikonene i tumorprøver i forhold til tilpasset tilstøtende normalt vev fra samme pasient. (D) pyrosekvensering av
GPM6B
region for pasient 9 (HCC) og pasient 13 (pseudotumor). Den dekket området overlapper med sekvensen analysert i HRM.
Vi har optimalisert tre spesifikke 150 bp DNA-områder som kan skille HCC fra untransformed vev ved hjelp av HRM. En region i
GPM6B
promoter ble hypomethylated i svulster i alle pasienter sammenlignet med NorAdjRef (figur 2A). Alle tumorer ble tydelig separert og identifisert som HCC basert på temperaturverdiene av smeltetopper (tabell 3
P
= 3.97E-5, justert
P
= 1.17E-4, Mann-Whitney
U
test). Forsøkspersoner med ikke-invasiv HCC (non-PVTT) var mer hypomethylated sammenlignet med invasive svulster som forskjellen i smeltetopper mellom kreft og NorAdjRef indikerer. Dermed kunne amplicon skille også HCC uten PVTT fra HCC med PVTT, i hvert fall i lite antall tilfeller undersøkt her (tabell 3, figur 2a-diagrammer 3 og 5,
P
= 0,03, justert
P
= 0,06, Mann-Whitney
U
test). HRM analyse av en region i
MAGEA12
promoter differensiert alle HCC uten PVTT og to av fem HCC med PVTT fra NorAdjRef (figur 2B, 3B,
P
= 1.7E-4, justert
P
= 5.1E-4, Mann-Whitney
U
test). Tumorprøver fra pasienter 5, 6 og 7 som ble diagnostisert med PVTT utstilt samme metylering nivå som deres matchet normal tilstøtende vev (figur 2B-diagram 2, figur 3B) og var ikke skilt enten fra NorAdjRef (figur 2B-diagram 1) . Den gjennomsnittlige smeltetopp temperaturverdi for HCC uten PVTT var lavere enn for den gjennomsnittlige HCC med PVTT indikerer hypometylering innenfor
MAGEA12
sonde i ikke-invasive tumorer (tabell 3, figur 2B-diagram 5), selv om endringen var ikke statistisk signifikant i vår sett prøver (
P
= 0,64, Mann-Whitney
U
test). HRM for
FCRL1
sonde skiller HCC med PVTT fra NorAdjRef (
P
= 2.5E-3, justert
P
= 7.5e-3, Mann-Whitney
U
test), men ikke HCC uten PVTT fra NorAdjRef (
P
= 0,11, Mann-Whitney
U
test) (figur 2C-diagram 1).
FCRL1
sonden er hypomethylated i invasiv sammenlignet med ikke-invasive tumorer (Tabell 3, Figur 2C-diagram 5,
P
= 2.5E-3, justert
P
= 7.5e-3, Mann-Whitney
U
test) og i tillegg skiller disse to typer svulster. Interessant, selv om vi pent skille av HRM PVTT prøver fra NorAdjRef, var det ingen relevant forskjell når vi sammenlignet
FCRL1
metylering stat i hver PVTT tumorprøve med matchet tilstøtende normalt vev fra samme pasient unntatt pasient 7 (tabell 3, Figur 2C-chart2, figur 3C). Dette tyder på at DNA-metylering endringer inntraff allerede i det tilstøtende vev i disse lever. Pasient 13 som ble diagnostisert med leverpseudo viste ingen forskjell i HRM smelteprofil med sitt eget tilstøtende vev og NorAdjRef i alle tre prober (tabell 3, figur 2-diagram 4,
P
0,05). Vi bekreftet denne observasjonen av pyrosekvensering av
GPM6B
region for HCC lagt 9 og pseudo pasient som vist i Figur 3D.
I sammendraget, en kombinasjon av disse tre HRM optimalisert sonder vil differensiere svulster fra ikke-tumorer (ved hjelp av
GPM6B
sonde og
MAGEA12
i kombinasjon med
GPM6B
) og HCC med PVTT fra ikke-PVTT HCC (ved hjelp av
FCRL1
probe).
Validering av identifiserte epigenetiske biomarkører i Bangladesh snitt fra HCC og kronisk hepatitt B (CHB) pasienter
Det kritiske spørsmålet i diagnostisering av HCC er å identifisere tidlig konvertering av CHB til HCC. Vi har derfor spurt om de identifiserte sondene kunne skille mellom HCC og CHB i et uavhengig sett av fag. Vi testet 4 personer med HCC og 4 personer med CHB (tabell 2 for kliniske karakteristika).
GPM6B
sonde som differensiert alle HCC fra NorAdjRef i Shanghai gruppe pasienter viste også forskjellige smelte mønstre i HCC og CHB unntatt en pasient med HCC som ble gruppert sammen med CHB basert på smeltetopptemperatur (tabell 3, 4A,
P
= 0,028, justert
P
= 0,084, Mann-Whitney
U
test;
P
0,0001, permutasjon test) . Metylering stat innenfor
MAGEA12
probe separeres alle HCC saker fra CHB som indikert av lavere smeltetemperatur (tabell 3, figur 4B,
P
= 0,028, justert
P
= 0,084 , Mann-Whitney
U
test;
P
= 0,02, permutasjon test). I HCC pasienter, vi klart observert to smeltetopper indikerer to populasjoner av celler med lav og høy
MAGEA12
metylering nivå. En sonde innen
FCRL1
ble hypomethylated i alle svulster sammenlignet med gjennomsnittet av alle KHB pasienter (tabell 3, figur 4C,
P
= 0,028, justert
P
= 0,084, Mann-Whitney
U
test;
P
0,0001, permutasjon test). Når vi gruppert smelter topptemperaturverdiene for alle HCC prøver og alle tilstøtende normale og KHB prøver, medianverdien for hvert testet sonde var lavere i kreft enn i normal indikerer hypometylering i kreft (figur 4D). Forskjellene var meget statistisk signifikant for
GPM6B Hotell og
MAGEA12
prober (
P
0,001, justert
P
0.003, Mann-Whitney
U
test) samt for
FCRL1
men etter eksklusive HCC prøver uten PVTT (
P
0,01, justert
P
0,03 , Mann-Whitney
U
test). Uttrykk av de testede genene som målt ved QPCR i Bangladesh gruppen var i gjennomsnitt høyere i HCC enn i KHB pasienter (se Figur 4E for eksakte verdier i hver pasient) med de mest relevante endringene som er observert for
FCRL1 plakater (Figur 4E,
P
= 0,028, justert
P
= 0,084, Mann-Whitney
U
test;.
P
= 0,028, permutasjon test)
Smeltekurve toppene
GPM6B (A)
,
MAGEA12 product: (B) og
FCRL1 product: (C) amplikonene i fire HCC og 4 KHB pasienter fra Bangladesh.
